QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS測定蜂蜜中4種硝基咪唑藥物殘留

王華 劉虹虹 羅達龍

摘 要：目的：建立以QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS的方法對蜂蜜中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑進行測定。方法：用Na2EDTA-磷酸鹽緩沖液對蜂蜜中的待測組分進行提取，用QuEChERS dSPE EMR-Lipid進行凈化，采用液質(zhì)聯(lián)用儀進行測定，并利用SOULAB-ST C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，

1.8 μm）對物質(zhì)進行分離，用質(zhì)譜多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）進行采集。結(jié)果：4個化合物在0.2～25.0 μg/kg線性良好，檢出限均為0.06 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg，在0.2 μg/kg、1.0 μg/kg和10.0 μg/kg 3個添加水平的回收率為86.2%～97.0%，相對標準偏差為2.4%～6.5%。結(jié)論：該方法具有操作簡易快速、定性定量準確、靈敏度高等特點，能應(yīng)用于日常樣品的檢驗檢測。

關(guān)鍵詞：蜂蜜;硝基咪唑;藥物殘留

Determination of Four Nitroimidazole Residues in Honey by UPLC-MS/MS with QuEChERS dSPE EMR-Lipid

WANG Hua， LIU Honghong*， LUO Dalong

（Wuzhou Institute for Food and Drug Control， Wuzhou 543000， China）

Abstract： Objective： A QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS method was established for the determination of secnidazole， metronidazole， tinidazole and ornidazole in honey. Method： The components to be tested in honey were extracted with Na2EDTA-phosphate buffer， purified by QuEChERS dSPE EMR-Lipid， and detected by UPLC-MS/MS with the SOULAB-ST C18 chromatographic column（100 mm×2.1 mm， 1.8 μm） under multiple reaction monitoring（MRM） mode. Result： There was a good linear relationship between the four kinds of nitroimidazole residues in the range of 0.2～25.0 μg/kg. The limits of detection was 0.06 μg/kg and the limits of quantitation was 0.2 μg/kg. The recoveries at three spiked levels of 0.2 μg/kg， 1.0 μg/kg and 10.0 μg/kg ranged from 86.2% to 97.0% with relative standard deviation of 2.4%～6.5%. Conclusion： The method had the advantages of simple operation， qualitative and quantitative accuracy， high sensitivity. It could be applied to daily inspection.

Keywords： honey; nitroimidazole; drug residue

蜂蜜中富含糖類、維生素、氨基酸和多種礦物質(zhì)等，蜂蜜具有護肝、潤肺、增強人體免疫的功能[1]。蜂蜜不僅作為一種營養(yǎng)食品，因其具有一定的藥理作用，也被稱作醫(yī)家良藥，在臨床上用于消化系統(tǒng)、創(chuàng)傷治療等疾病的治療[2-3]。因此蜂蜜也成了消費者追捧的產(chǎn)品，在蜂業(yè)養(yǎng)殖中為避免蜂群受到疾病感染，會出現(xiàn)抗生素濫用的情況。塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑為《中國藥典》2020年版收錄的4個具有5-硝基咪唑基本結(jié)構(gòu)的藥物，該藥物具有抗原蟲、抗厭氧菌的作用。在養(yǎng)殖蜜蜂時，養(yǎng)蜂人為避免蜂群出現(xiàn)疾病感染，會使用此類抗生素。由于硝基咪唑類藥物具細胞誘變性，有潛在致畸、致癌和致突變的作用，甚至有遺傳毒性[5-8]。該類藥物在蜂蜜樣品中的殘留會對食品安全構(gòu)成直接威脅，且上述4種藥物，在藥房易于購買獲得，因此需加強檢測。

蜂蜜在食品工業(yè)與藥用輔料中有著不可或缺的地位，為保障食品與藥用安全，有必要建立一種前處理簡單、檢測快速、檢測限低、定性與定量準確的測試方法。目前，硝基咪唑類藥物的相關(guān)檢測方法為試劑盒快速檢測方法、液相色譜法和氣相色譜質(zhì)譜等方法[4]。蜂蜜中存在約70%～80%的糖，糖的去除是實驗中的難點。如在前處理中不對糖進行去除，糖會隨著流動相帶入色譜系統(tǒng)與質(zhì)譜系統(tǒng)，在色譜系統(tǒng)中會導(dǎo)致進樣針與色譜柱的堵塞，也會影響質(zhì)譜電噴霧過程，使測定的目標物受到基質(zhì)干擾，產(chǎn)生基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)，進而導(dǎo)致檢測結(jié)果不準確。本方法使用了Na2EDTA-磷酸鹽緩沖液作為提取溶劑，以QuEChERS dSPE EMR-Lipid為凈化劑，SOULAB-ST C18色譜柱為分離手段，運用UPLC-MS/MS中的多反應(yīng)監(jiān)測模式對蜂蜜樣品中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑進行檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

色譜純乙腈、甲醇購自于歐姆尼公司;分析純試劑無水磷酸氫二鈉、無水磷酸二氫鈉、乙二胺四乙酸二鈉鹽購自于上海麥克林生化科技有限公司;凈化劑QuEChERS dSPE EMR-Lipid購買于安捷倫科技有限公司。實驗用水為密理博純水機制備的去離子水;塞克硝唑、甲硝唑、奧硝唑和替硝唑購自中國食品藥品檢定研究院，含量均不小于99.0%。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜儀Agilent LC1290，液質(zhì)聯(lián)用儀Agilent-QQQ-6470（Agilent Technologies），超純水儀（Millipore）;渦旋振蕩儀（Thermo Fisher Scientific）;超聲波清洗儀（ELMA）;冷凍離心機（SIGMA）。

1.3 實驗方法

1.3.1 溶液的配制

（1）提取溶劑的配制。取65 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸二氫鈉溶液與435 mL濃度為0.2 mol/L的磷酸氫二鈉溶液進行混合后，向混合溶液中加入18.6 g乙二胺四乙酸二鈉鹽試劑，經(jīng)超聲波清洗儀超聲溶解后混勻即得Na2EDTA-磷酸鹽緩沖溶液。

（2）標準儲備液的配制。精密稱取標準物質(zhì)塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑、奧硝唑25 mg至4個25 mL容量瓶中，用色譜級甲醇試劑將標準物質(zhì)溶解，配制得到1 mg/mL的儲備液，避光保存于2～8 ℃冰箱。

（3）混合標準液的配制。分別吸取塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑及奧硝唑儲備液各25 μL到同一個

25 mL容量瓶，用色譜純甲醇試劑進行稀釋得到質(zhì)量濃度為1.0 μg/mL的混合標準液，存放于2～8 ℃冰箱避光保存。

（4）基質(zhì)標準工作溶液的配制。吸取混合標準液，用陰性樣品經(jīng)前處理后所得到的溶液對混合標準液進行稀釋，配制得到的基質(zhì)標準工作溶液S1～S5濃度分別為0.04 ng/mL、0.2 ng/mL、1.0 ng/mL、

2.0 ng/mL和5.0 ng/mL，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2 前處理方法

（1）樣品制備。若蜂蜜樣品中不含有結(jié)晶，將其攪拌均勻，備用。如蜂蜜樣品中含有結(jié)晶，在保證其包裝為密封狀態(tài)下，將樣品放置于60 ℃以下的水浴中加熱、振蕩，等蜂蜜樣品全部融化后再把樣品攪拌均勻，冷卻至室溫，即可使用。

（2）樣品的提取。稱取蜂蜜樣品5.00 g到100 mL離心管中，精密加入提取溶劑10 mL，渦旋混合2 min，備用。

（3）樣品的凈化。吸取提取液5.00 mL至EMR-Lipid凈化管中渦旋混合2 min，精密加入色譜級乙腈試劑5 mL，渦旋混合5 min，在4 ℃下以8 000 r/min離心5 min，吸取上清液0.50 mL到2 mL離心管中，向離心管加入0.50 mL超純水混合均勻，溶液用0.2 μm有機濾膜過濾，待測定。

1.3.3 測試條件

（1）色譜參數(shù)。自動進樣器進樣量：3 μL;柱溫箱恒溫溫度：35.0 ℃;色譜柱規(guī)格：SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）;流動相組成：甲醇與0.2%甲酸水溶液;流動相流速：0.35 mL/min;液相色譜流動相梯度：0～0.5 min，10%的甲醇保持

0.5 min;0.5～3.5 min，甲醇由10%變化至90%;3.5～4.5 min，90%的甲醇保持1 min;以10%的甲醇比例后運行1.5 min。

（2）質(zhì)譜參數(shù)。正離子模式下噴射流離子源（AJS ESI+），干燥氮氣溫度（150 ℃）;干燥氮氣流速

（10 L/min）;鞘氣溫度（325 ℃）;鞘氣流速（10 L/min）;正模式噴嘴電壓（+500 V）;正模式毛細管電壓（+4 000 V）;霧化器壓力（30 Psi）。質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 實驗條件優(yōu)化

2.1.1 提取及凈化方法的選擇

蜂蜜中的主要成分是糖分，約占蜂蜜的70%～80%，前處理中需使用凈化方法去除糖。如去除糖不完全，會導(dǎo)致色譜柱壽命下降，離子源噴霧針中積累碳化物，同時也會影響待測組分的離子化效率，影響檢測方法的靈敏度。硝基咪唑類化合物在弱堿條件下以游離分子的形式存在，故本實驗采用偏堿性的Na2EDTA-磷酸緩沖溶液對蜂蜜樣品進行提取，使樣品得到更好的分散性以提高目標物的提取效率，提取溶劑中含有Na2EDTA、磷酸鹽，Na2EDTA在提取液中可與樣品中含有的金屬離子進行螯合，減少金屬離子催化導(dǎo)致待測組分的降解。糖溶解于磷酸鹽水溶液中，樣品經(jīng)EMR-Lipid凈化后使用乙腈把待測組分萃取到乙腈層，使目標物與糖分別在不同的溶劑層，以達到凈化效果。

2.1.2 稀釋溶劑優(yōu)化

液相色譜在分離過程中會存在一定的溶劑效應(yīng)，如上機溶液選擇不合適，會影響物質(zhì)的保留與色譜峰的峰形，進而影響物質(zhì)在質(zhì)譜的響應(yīng)強度?；诖?，本研究用陰性樣品經(jīng)前處理后得到的乙腈層溶液進行稀釋，制成含80%乙腈、50%乙腈的水溶液。分別使用乙腈、80%乙腈的水溶液、50%乙腈的水溶液將混合標準溶液配制成待測組分的濃度為5 ng/mL的標準液，上機測試，記錄色譜峰的拖尾因子。在使用乙腈、80%乙腈配制的標準液中，甲硝唑與替硝唑色譜峰產(chǎn)生前沿峰，拖尾因子為0.90～0.93;而使用50%乙腈水溶液配制的標準液中，所得物質(zhì)的色譜峰峰形對稱且尖銳，拖尾因子為1.01～1.03，符合拖尾因子0.95～1.05的要求。待測組分溶于乙腈體系中與流動相極性相差較大，產(chǎn)生溶劑效應(yīng)，進而使待測組分的峰形受到影響。對此為消除溶劑效應(yīng)，本方法中使用含50%乙腈的空白基質(zhì)提取液作為標準溶液的稀釋液。

2.1.3 色譜條件優(yōu)化

（1）色譜柱選擇。色譜柱在實驗中對于樣品的分離非常重要，為確保待測組分在色譜柱上有較好的保留與分離效果，比較了柱1 SOULAB-SH C18（150 mm×4.6 mm，3 μm）、柱2 SOULAB-AM C18（150 mm×3.0 mm，3 μm）、柱3 SOULAB-ST C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）3種色譜柱對4個待測組分的分離效果。使用柱1與柱2這兩款色譜柱所需的流動相流量較大，與質(zhì)譜電噴霧離子化方式不匹配，物質(zhì)離子化效率較低，所得的質(zhì)譜響應(yīng)強度較低。相對于柱1、柱2，使用柱3能使化合物具有更好的分離效果及峰形，小粒徑色譜柱具有高柱效且能節(jié)省溶劑，適用于UPLC儀器。綜合考慮物質(zhì)保留時間、色譜峰峰形與檢測靈敏度，選擇柱3作為本實驗分析柱。

（2）流動相選擇。本文分別比較了使用有機溶劑甲醇、乙腈作為流動相時對所測定的4種化合物分離效果的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)使用甲醇作為流動相時，化合物在色譜柱上的保留與分離效果優(yōu)于乙腈?？紤]到待測組分需要與雜質(zhì)進一步分離，故選擇甲醇作為該實驗中的有機相。由于4個化合物均采用正模式下的電噴霧離子化，在水中加入一定濃度的酸可以促進化合物的電離。故本研究通過比較在水溶液中加入0.1%～0.5%的甲酸，考察對4個化合物的影響。結(jié)果顯示，隨著流動相中甲酸濃度的增大，4種化合物在質(zhì)譜測定中得到的峰面積略有增大，但基線噪聲也明顯提高。綜合不同濃度的甲酸作為流動相下所測得物質(zhì)的信噪比與色譜柱pH的耐受性考慮，選擇0.2%甲酸作為水相，化合物的色譜圖見圖1。

2.2 檢出限、定量限與線性關(guān)系考察

取S1～S5基質(zhì)標準工作溶液，按測試條件進行測定，通過儀器測試得到各化合物定量離子的峰面積。以配制的基質(zhì)標準工作溶液濃度（x）為橫坐標，化合物峰面積（y）為縱坐標，得出回歸方程;通過在空白樣品中加入標準溶液后對樣品進行提取、凈化來進行確認本方法所能達到的檢出限與定量限，使用工作站對信噪比進行計算，當(dāng)目標峰峰高與基線噪聲的比值≥10，即為定量限;當(dāng)目標峰峰高與基線噪聲的比值≥3，即得出檢出限。結(jié)果表明，4個化合物檢出量在0.2～25.0 μg/kg線性良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.995，檢出限均為0.06 μg/kg，定量限均為0.2 μg/kg。化合物回歸方程與相關(guān)系數(shù)見表2。

2.3 回收率實驗

取空白基質(zhì)樣品進行加標，通過調(diào)節(jié)標準溶液的加入體積，使添加量達到0.2 μg/kg、1.0 μg/kg、10.0 μg/kg，每個加標級別進行6份平行加標實驗，并同步進行空白測試，使用基質(zhì)標準工作曲線對4個待測組分進行定量分析，結(jié)果見表3。4個化合物的加標回收率為86.2%～97.0%，相對標準偏差為2.4%～6.5%，均小于10%，表明本方法具有較好的回收率與重現(xiàn)性，可滿足蜂蜜中的塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑的測定。

2.4 樣品的測定

通過購買市場上銷售的蜂蜜樣品共20批次，按建立的方法進行前處理并測試，結(jié)果20批樣品中均未檢出塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑。

3 結(jié)論

本研究建立了QuEChERS dSPE EMR-Lipid-UPLC-MS/MS方法測定蜂蜜中塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑，EMR-Lipid凈化劑能有效去除蜂蜜樣品中的糖類，用SOULAB-ST C18色譜柱對塞克硝唑、甲硝唑、替硝唑和奧硝唑進行色譜分離，通過質(zhì)譜聯(lián)用儀的MRM模式進行檢測。方法中使用了空白基質(zhì)提取液配制標準曲線，相比使用內(nèi)標物的方法，節(jié)省了購買內(nèi)標物的費用，部分物質(zhì)的內(nèi)標物也不容易獲得。該方法具有操作簡單、快速、定性與定量準確、靈敏度高等特點。本方法使用的凈化劑對糖、脂質(zhì)具有高選擇性，能有效去除樣品基質(zhì)中的糖分。糖分的去除能提高待測組分在質(zhì)譜儀上的離子化效率，減少分析過程中的基質(zhì)干擾，以提高測試結(jié)果的穩(wěn)定性與可靠性，減少了色譜與質(zhì)譜的維護成本。

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