RP-HPLC法同時測定武都花椒中3種山椒素

馬君義，周慧霞，劉 潮，黃 榕，馮 珮

(1.西北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，甘肅 蘭州 730070;2.甘肅特色植物有效成分制品工程技術(shù)研究中心，甘肅 蘭州 730070)

藥食兼用的花椒系蕓香科(Rutaceae)花椒屬(Zanthoxylum)植物花椒(ZbungeanumMaxim)或青椒(Z.schinifoliunSieb.et Zucc)的花椒[1]的干燥成熟果皮.花椒主要分布于陜西、甘肅、山東、四川等地，其含有揮發(fā)油、生物堿、山椒素等多種對人體有益的活性成分[2-5]，是我國的“八大調(diào)味品”之一.其中麻味的強弱很大程度上決定了花椒的品質(zhì)，麻味的強弱與花椒中以山椒素為代表的酰胺類化合物的含量和構(gòu)成有一定的聯(lián)系，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素是最主要的麻味成分[6-7].近年來,測定花椒麻味成分含量的方法眾多，主要有紫外-可見分光光度法[8]、甲醛滴定法[9]、薄層層析法[10]、高效液相色譜法(HPLC)[11-12]等，其中前兩種測定方法雖然操作簡單，成本低廉，但準(zhǔn)確度較低，誤差較大.薄層層析法具有檢測速度快、操作簡單等優(yōu)點，但檢測結(jié)果存在重復(fù)性差、準(zhǔn)確度低等局限，而高效液相色譜(HPLC)法測定花椒麻味成分的含量結(jié)果準(zhǔn)確可靠[13].

甘肅武都是我國花椒最佳適生區(qū)之一.在2000年，武都區(qū)被國家林業(yè)局命名為“中國名特優(yōu)經(jīng)濟林花椒之鄉(xiāng)”；2015年，武都花椒被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部登記為“農(nóng)產(chǎn)品地理標(biāo)志”，并獲得了“甘肅省著名商標(biāo)”；2020年，武都區(qū)因花椒被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部認(rèn)定為第三批“中國特色農(nóng)產(chǎn)品優(yōu)勢區(qū)”.“大紅袍”是武都花椒的主要品種，其粒大飽滿、香味濃郁、麻味醇厚、藥效成分多、精油含量高[14-15].但武都花椒作為優(yōu)質(zhì)產(chǎn)區(qū)花椒，與其他產(chǎn)地花椒相比，酰胺類物質(zhì)及主要麻味物質(zhì)特征尚不明確，為凸顯武都花椒的“特別特”、“好中優(yōu)”，打造“甘味”知名農(nóng)產(chǎn)品品牌，文中建立反相高效液相色譜(RP-HPLC)法同時測定武都花椒中3種山椒素含量,這對促進我國名優(yōu)特產(chǎn)武都花椒的質(zhì)量評價、產(chǎn)業(yè)發(fā)展和豐富武都花椒品質(zhì)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)等方面具有參考意義.

1 材料

1.1 材料與試劑

花椒供試品12批，來源于甘肅省隴南市武都區(qū)的6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)12個村，所有檢測樣品均為2020年新品.

羥基-α-山椒素(批號PRF10092902， 純度99.13%)、羥基-β-山椒素(批號PRF10031222， 純度99.36%)、羥基-γ-山椒素標(biāo)準(zhǔn)品(批號PRF10031226， 純度98.94%)，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；正己烷、甲醇均為色譜純，山東禹王和天下新材料有限公司；磷酸，國藥集團化學(xué)試劑有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

IKA/A11basic研磨機，德國IKA公司；UltiMate 3000高效液相色譜儀，美國Thermo Scientific Inc；Silversil-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，美國Dikma Technologies Inc；JRA-6磁力攪拌水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司；電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海-恒科學(xué)儀器有限公司.

2 試驗方法

2.1 供試品溶液的制備

采用有機溶劑浸提法制備樣液，參照地標(biāo)[16]和文獻[17]，并稍有改動.將50 ℃下干燥至恒重的花椒果皮粉碎成粉末，精密稱取約1 g(精確至0.0001 g)于250 mL具塞錐形瓶中，加入30 mL正己烷，封口，50 ℃水浴振蕩提取3 h，0.45 μm有機相微孔濾膜抽濾，得濾渣.向濾渣中加入50 mL甲醇，50 ℃水浴振蕩提取3 h，0.45 μm有機相微孔濾膜抽濾，濾渣再用30 mL甲醇重復(fù)提取3 h，抽濾，合并濾液并定容至100 mL容量瓶中.濾液經(jīng)0.22 μm有機相濾頭過濾并適當(dāng)稀釋后冷藏，取濾液待測，每個樣品設(shè)3組平行.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

分別精密稱取一定量的3種山椒素標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度均為10 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，將儲備液置于-18 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

精密吸取上述3種標(biāo)準(zhǔn)品儲備液適量，置于同一容量瓶中，用甲醇稀釋，制成質(zhì)量濃度為150 μg·mL-1的3種山椒素的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液.

精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液適量，置于容量瓶中，用甲醇逐級稀釋為150,100,75,50,25,12.5,6.25,3.125,1.56和0.78 μg·mL-1的3種山椒素系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

2.3 色譜分析條件

流動相：甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(68∶30∶2，V/V/V)，等度洗脫30 min；檢測波長：270 nm；流速：1 mL·min-1；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL.

2.4 供試品含量的測定

取20 μL花椒供試品制備液，采用高效液相色譜儀，按2.3條件依次進樣，測定供試品溶液中3種山椒素的峰面積，每樣平行測定3次，利用線性回歸方程分別計算各樣品中3種山椒素含量.

3 結(jié)果與分析

3.1 RP-HPLC分析條件的選擇

HPLC測定山椒素的流動相體系主要為乙腈-水、甲醇-水[18-19]，反相梯度洗脫或等度洗脫.本試驗采用甲醇-0.1%磷酸溶液(70∶30，V/V)等度洗脫時，3種山椒素能夠?qū)崿F(xiàn)很好的分離，分析時間與梯度洗脫相差不大，但羥基-α-山椒素色譜峰稍有拖尾，在流動相體系中添加2%的乙腈，拖尾現(xiàn)象可得到有效改善.故本試驗采用甲醇-0.1%磷酸溶液-乙腈(68∶30∶2，V/V/V)作為流動相，保留時間為30 min進行等度洗脫，既能達(dá)到良好的分離度，又能實現(xiàn)目標(biāo)物在30 min內(nèi)出峰.羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的最大吸收波長分別為268,268和270 nm，考慮到此批花椒樣品中羥基-γ-山椒素含量最低，故選擇270 nm為試驗的檢測波長.同時，在此波長下樣品中其他組分不干擾測定.優(yōu)化后的色譜條件下對標(biāo)準(zhǔn)品和供試品進行測定，結(jié)果見圖1，其中混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)中羥基-α-山椒素與羥基-β-山椒素的分離度達(dá)到1.57，供試品(B)中羥基-α-山椒素與羥基-β-山椒素的分離度為1.54，均符合《中國藥典》分離度R大于1.5的規(guī)定.圖1中的a峰根據(jù)相關(guān)文獻報告,可能是羥基-ε-山椒素[20]，本研究中未將其列為檢測對象.

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)品(A)和供試品(B)的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系的考察

分別取各對照品混合溶液20 μL按2.3色譜條件進樣分析，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)作圖，結(jié)果見圖2.

圖2 3種山椒素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

進行線性擬合，得到3種山椒素的回歸方程(表1).結(jié)果表明，3種山椒素在各自的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好.

表1 回歸方程和線性范圍(n=10)

3.3 方法學(xué)評價

3.3.1 精密度 取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(含羥基-α-山椒素質(zhì)量50 μg·mL-1、羥基-β-山椒素質(zhì)量3.125 μg·mL-1、羥基-γ-山椒素質(zhì)量0.78 μg·mL-1，按2.3條件連續(xù)進樣6次，計算3種山椒素峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD值，表2).結(jié)果表明，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素峰面積的RSD值分別為0.62%，1.01%和0.74%，說明儀器精密度良好.

表2 精密度結(jié)果(n=6)

3.3.2 重復(fù)性 稱取供試品(S3)1 g(精確至0.0001 g)，平行6份，按照2.1的制備方法制備檢測溶液，再按2.3條件分別進樣分析，計算S3樣品中3種山椒素的含量和RSD值.重復(fù)性結(jié)果見表3.可以看出，S3樣品中羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素含量的RSD值分別為3.69%, 3.90%和2.83%，表明該方法重復(fù)性良好.

表3 重復(fù)性結(jié)果(n=6)

3.3.3 穩(wěn)定性 稱取供試品(S3)1 g(精確至0.0001 g)，按照2.1的方法制備檢測溶液，再按2.3的條件分別于0,2,4,6,8,10和12 h進樣分析，記錄S3樣品中3種山椒素的峰面積和RSD值.穩(wěn)定性結(jié)果見表4，由表4可知，在12 h內(nèi)S3樣品中羥基-α-山椒素峰、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素峰面積的RSD值分別為4.88%,4.73%和4.82%，表明供試品的穩(wěn)定性良好，對進樣時間無特殊要求.

表4 穩(wěn)定性結(jié)果(峰面積)

3.3.4 加標(biāo)回收率 精密吸取1 mL已知含量(表5)的花椒提取物溶液3份于Eppendorf管中，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液(含羥基-α-山椒素82.35 μg、羥基-β-山椒素6.38 μg和羥基-γ-山椒素1.90 μg)1 mL，混勻，按2.3項下色譜條件分別進樣分析，每個樣品平行進樣3次，計算S3樣品中3種山椒素的加標(biāo)回收率和RSD值.結(jié)果見表5.由表5可知，羥基-α-山椒素的加標(biāo)回收率為104.86%、RSD值為3.32%，羥基-β-山椒素的加標(biāo)回收率為91.43%、RSD值為3.60%，羥基-γ-山椒素的加標(biāo)回收率為93.58%、RSD值為3.66%，表明該方法準(zhǔn)確性良好.

表5 加標(biāo)回收率結(jié)果

3.3.5 檢測限和定量限 精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用甲醇逐級稀釋定容成一系列的溶液.以信噪比為3∶1時的質(zhì)量濃度作為檢出限，信噪比為10∶1時的質(zhì)量作為定量限.由表6可知，羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的檢測限分別為0.059,0.092和0.037 μg·mL-1，按進樣量為20 μL換算，其定量限分別為3.91,6.16和2.45 ng.

表6 檢測限和定量限

3.4 供試品山椒素的含量

甘肅武都6個鄉(xiāng)鎮(zhèn)12個村的12批次地標(biāo)產(chǎn)品“大紅袍”系列武都花椒中3種山椒素的含量見表7.由表7可知，12批次的武都花椒樣品中羥基-α-山椒素含量為(71.75±2.70)～(191.65±2.35) mg·g-1，羥基-β-山椒素含量為(8.32±0.33)～(22.93±0.71) mg·g-1，羥基-γ-山椒素含量為(2.45±0.04)～(4.05±0.10)mg·g-1，其RSD值分別為1.23%～3.99%,3.11%～4.98%和0.94%～3.54%.3種山椒素的均值高達(dá)143.51 mg·g-1，且羥基-α-山椒素的含量遠(yuǎn)高于羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素的含量.且不同產(chǎn)地的花椒山椒素含量存在差異，這可能與花椒種植地環(huán)境條件和氣候因素有關(guān).有研究表明，花椒的品質(zhì)和產(chǎn)量受產(chǎn)地溫度、平均相對濕度、年日照時數(shù)、降雨量、降雨坡度方向、海拔和管理方式等因素有關(guān)[21-22]

表7 武都花椒中3種山椒素的含量

4 結(jié)論

建立了測定花椒中3種山椒素含量的RP-HPLC的方法，該方法穩(wěn)定性好、精密度高、重復(fù)性好.用此方法測定麻味物質(zhì)含量的結(jié)果顯示12個花椒樣品均含有羥基-α-山椒素、羥基-β-山椒素和羥基-γ-山椒素，且均以羥基-α-山椒素的含量為最高，其中，羥基-α-山椒素含量為(71.75±2.70)～(191.65±2.35) mg·g-1，羥基-β-山椒素含量為(8.32±0.33)～(22.93±0.71) mg·g-1，羥基-γ-山椒素含量為(2.45±0.04)～(4.05±0.10) mg·g-1.

從花椒種植地域分布來看，在所考察的鄉(xiāng)鎮(zhèn)中，漢林鎮(zhèn)、桔柑鎮(zhèn)、蒲池鄉(xiāng)、郭河鄉(xiāng)、馬街鎮(zhèn)和安化鎮(zhèn)均適于花椒的種植，尤其是蒲池鄉(xiāng)下壩村，其花椒中3種山椒素總量高達(dá)(217.90±2.35) mg·g-1，其次是郭河鄉(xiāng)候家灣村(171.73±5.0) mg·g-1、郭河鄉(xiāng)符家山村(163.47±4.85) mg·g-1、安化鎮(zhèn)曾街村(158.81±3.37) mg·g-1.

本研究利用RP-HPLC對武都花椒麻味物質(zhì)中的3種山椒素進行定量分析，完善了“甘味”知名農(nóng)產(chǎn)品武都花椒的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，可為武都花椒質(zhì)量評價和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供參考，對促進武都地方經(jīng)濟發(fā)展和鄉(xiāng)村振興具有重要意義.