含羧甲基纖維素鈉的發(fā)酵乳中脂肪檢測技術(shù)

劉芳芳 薛敏敏 吳 倩 彭程程 鄧凌云

(湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量檢驗研究院，湖南 長沙 410011)

發(fā)酵乳是一種口感風(fēng)味俱佳的乳制品，富含多種營養(yǎng)成分，具有促進(jìn)消化、防止乳糖不耐、降低膽固醇等多種功效，深受廣大消費者的喜愛[1-4]。目前，發(fā)酵乳的消費比例在中國液態(tài)乳制品中已高達(dá)50%[5]。

脂肪含有200多種不同類型的脂肪酸和大量甘油三酯，是發(fā)酵乳中風(fēng)味物質(zhì)及營養(yǎng)功效的主要來源[6-8]，同時也是發(fā)酵乳產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)測的重要指標(biāo)，其在發(fā)酵乳中最常用的國家標(biāo)準(zhǔn)檢測方法為堿水解法[9-10]。但是在實際工作中發(fā)現(xiàn)，采用堿水解法測定含有羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)的發(fā)酵乳中脂肪時，結(jié)果顯示偏低。由于發(fā)酵乳在生產(chǎn)過程中，通常會添加各類穩(wěn)定劑保障其酸性體系的穩(wěn)定性，而CMC-Na作為一種離子型纖維素膠，具有增稠、持水、乳化、懸浮等功能特點[11]，可防止酪蛋白聚集沉淀分層，并且價格低廉來源廣，被廣泛使用和研究[12-13]。但暫未發(fā)現(xiàn)關(guān)于CMC-Na影響發(fā)酵乳中脂肪測定的相關(guān)研究報道，僅宋艷梅等[14]研究表明果膠和明膠兩種不同穩(wěn)定劑的添加使得發(fā)酵乳中脂肪測定結(jié)果偏低。因此，有必要深入了解CMC-Na的添加對發(fā)酵乳中脂肪檢測的影響。

研究擬通過深入分析堿水解法測定發(fā)酵乳中脂肪的技術(shù)原理，對含CMC-Na的發(fā)酵乳中脂肪測定偏低進(jìn)行溯源分析，并對脂肪檢測方法進(jìn)行特定條件優(yōu)化，以期開發(fā)出具有更高準(zhǔn)確度的含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的檢測方法，為日常檢測判定提供新的技術(shù)思路，也為未來國標(biāo)的修訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

全脂純牛奶：蒙牛乳業(yè)(集團)股份有限公司；

20款市售風(fēng)味發(fā)酵乳：德人牧香、光明、蒙牛、伊利、認(rèn)養(yǎng)一頭牛、德亞、君樂寶等多家企業(yè)不同系列產(chǎn)品(其中兩款含CMC-Na)，市售；

蔗糖：成都太古糖業(yè)有限公司；

發(fā)酵菌粉(保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌)：昆山佰生優(yōu)生物科技有限公司；

羧甲基纖維素鈉：食品級，河南萬邦化工科技有限公司；

氨水、無水乙醇、無水乙醚、石油醚(沸程30～60 ℃)、鹽酸、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

電子天平：SI-234型，丹佛儀器北京有限公司；

食品均質(zhì)器：SJ-Ⅱ型，上海昆蟲科技開發(fā)公司；

生化培養(yǎng)箱：BD115E2型，德國Binder公司；

毛式抽脂瓶：容量100 mL，合肥市三元化玻儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：HWS-28型，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：DHG-9240A型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 制備含CMC-Na的發(fā)酵乳 將脂肪含量為3.91 g/100 g 的全脂純牛奶等量取樣7份，分別加入不同量的CMC-Na，配制成CMC-Na添加量分別為0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的牛奶樣品，再加入6%的蔗糖。將配制好的樣品在30 MPa 下均質(zhì)處理，108 ℃滅菌15 min，取出后冷卻至40～45 ℃?zhèn)溆谩８鳂悠钒? g/L依次加入發(fā)酵菌粉，充分?jǐn)嚢杌靹颍湃?2 ℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵8 h，取出后放入4 ℃冰箱貯藏待測。

1.2.2 堿水解法關(guān)鍵條件的優(yōu)化 對GB 5009.6—2016第三法堿水解法中關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整。選擇氨水體積、水解溫度、水解時間、提取次數(shù)4個關(guān)鍵試驗參數(shù)，通過依次改變其中一個參數(shù)的水平條件，保持其他參數(shù)與國標(biāo)方法相同(氨水體積2.0 mL，水解溫度65 ℃，水解時間20 min，提取次數(shù)3次)的情況下，對CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%的3個發(fā)酵乳樣品逐一進(jìn)行脂肪分析檢驗。其中，氨水體積的優(yōu)化水平有4.0，6.0，8.0 mL；水解溫度的優(yōu)化水平有75，80，85 ℃；水解時間優(yōu)化水平有30，45，60 min；提取次數(shù)的優(yōu)化水平有4，5，6次。最終對比條件優(yōu)化后結(jié)果與國標(biāo)方法結(jié)果的區(qū)別。

1.2.3 鹽酸水解對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響

參照堿水解中的參數(shù)條件，使用鹽酸替代氨水進(jìn)行酸水解提取發(fā)酵乳中的脂肪。以市售含有CMC-Na的2款發(fā)酵乳產(chǎn)品，及CMC-Na添加量分別為0.00%，0.50%，0.75%，1.00%的自制發(fā)酵乳為研究對象，各取5份平行樣品，分別對應(yīng)添加2.0，4.0，6.0，8.0，10.0 mL 5個體積梯度的鹽酸，之后從水浴水解步驟開始按堿水解法中步驟操作。最后對比各試驗條件下的檢測結(jié)果，考察鹽酸水解對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的適用性。

1.2.4 堿水解法中加入金屬離子對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響 由于CMC-Na是一種聚電解質(zhì)，當(dāng)溶液中離子強度改變時，其黏度特性也會發(fā)生改變[15]，因此，針對CMC-Na含量不同(0.50%，0.75%，1.00%)的發(fā)酵乳，分別加入0.00，0.01，0.05，0.10，0.20，0.50，1.00 mol/L NaCl、KCl、CaCl2溶液，然后采用堿水解法對含有不同種類、不同濃度金屬離子的樣品進(jìn)行脂肪測定，對比分析各金屬離子對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于國標(biāo)堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的結(jié)果分析

依據(jù)GB 5009.6—2016堿水解法對20款市售風(fēng)味發(fā)酵乳及自制CMC-Na含量不同的發(fā)酵乳進(jìn)行脂肪測定，結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，以CMC-Na為主要添加劑的兩款產(chǎn)品(編號1和編號2)脂肪檢測結(jié)果分別為2.33，2.35 g/100 g，遠(yuǎn)低于標(biāo)示值2.7，3.2 g/100 g，并且GB 19302—2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 發(fā)酵乳》規(guī)定風(fēng)味發(fā)酵乳的脂肪含量不得低于2.5 g/100 g，由此可判定上述兩款產(chǎn)品脂肪不合格。而其余產(chǎn)品的脂肪檢測結(jié)果則與其標(biāo)示值接近，且均符合產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)合格要求，產(chǎn)品配料表顯示，其余產(chǎn)品并未添加CMC-Na，大部分以羥丙基二淀粉磷酸酯、乙酰化淀粉二磷酸酯、果膠、瓊脂等作為主要增稠劑。

表1 20款市售風(fēng)味發(fā)酵乳中脂肪測定結(jié)果Table 1 Determination results of fat in 20 commercial flavor fermented milk g/100 g

此外，通過對CMC-Na添加量為0.00%，0.10%，0.25%，0.50%，0.75%，1.00%，1.25%的自制發(fā)酵乳中脂肪含量進(jìn)行測定。檢測過程中發(fā)現(xiàn)，不含CMC-Na的對照樣管壁上光滑無附著物，含0.10%和0.25%CMC-Na的毛式脂肪管壁上有少量細(xì)小顆粒狀物質(zhì)，但添加量超過0.50%后，毛式脂肪管壁上開始呈現(xiàn)膠狀物質(zhì)，且隨著CMC-Na添加量的增加，膠狀物質(zhì)增多，當(dāng)添加量達(dá)到1.25%時，膠狀物質(zhì)已基本覆蓋整個管壁。

從脂肪測定結(jié)果(圖1)可知，當(dāng)CMC-Na添加量低于0.25%時，脂肪檢測結(jié)果基本持平，無明顯下降趨勢，但當(dāng)CMC-Na添加量達(dá)到0.50%時，脂肪含量明顯下降，為3.74 g/100 g，比未添加CMC-Na的發(fā)酵乳下降0.17 g/100 g，而CMC-Na添加量為0.75%，1.00%，1.25%的發(fā)酵乳脂肪結(jié)果則分別為3.56，3.39，3.05 g/100 g，差值最高達(dá)到0.86 g/100 g。根據(jù)GB 5009.6—2016第三法規(guī)定，當(dāng)樣品脂肪含量≤5%時，同一樣品兩次測定結(jié)果的絕對差值不應(yīng)超過0.1 g/100 g，當(dāng)CMC-Na添加量達(dá)到0.50%后，脂肪檢測結(jié)果隨CMC-Na添加量的增加而明顯減小，遠(yuǎn)超出標(biāo)準(zhǔn)要求范圍。說明CMC-Na的加入可能造成國家標(biāo)準(zhǔn)方法堿水解法對發(fā)酵乳中脂肪檢測結(jié)果偏低，甚至造成產(chǎn)品的不合格判定。

圖1 不同CMC-Na含量的發(fā)酵乳脂肪測定結(jié)果Figure 1 Determination results of fat in fermented milk with different CMC-Na content

2.2 堿水解法關(guān)鍵條件的優(yōu)化對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響

在國標(biāo)方法的基礎(chǔ)上，逐一對堿水解法中氨水體積、水解溫度、水解時間、提取次數(shù)4個關(guān)鍵條件進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，對CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%的發(fā)酵乳中脂肪進(jìn)行測定，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，隨著氨水體積的增加、水解溫度的提高、水解時間的延長、提取次數(shù)的增加，不同CMC-Na添加量水平下發(fā)酵乳中脂肪的測定結(jié)果無明顯變化規(guī)律，均未提高，并且每個試驗條件變化下脂肪測定結(jié)果間的偏差值均在0.1 g/100 g的范圍內(nèi)。由此可見，堿水解法中關(guān)鍵條件的參數(shù)變化對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪檢測結(jié)果不會產(chǎn)生明顯影響，可能與CMC-Na的化學(xué)特性及發(fā)酵乳中脂肪的存在形式有關(guān)。

圖2 堿水解法中關(guān)鍵條件優(yōu)化對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定結(jié)果的影響Figure 2 Determination results of fat in fermented milk with CMC-Na by optimization test of key parameter in alkali hydrolysis

乳中脂肪主要由酪蛋白包裹以脂肪球的形式存在[16-17]，堿水解法通過氨水破壞酪蛋白膜而使脂肪球游離出來，再用有機試劑進(jìn)行提取，而CMC-Na在發(fā)酵乳中的功能作用是通過其膠體特性吸附在酪蛋白表面形成交聯(lián)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生靜電排斥和空間位阻作用使發(fā)酵乳體系達(dá)到穩(wěn)定[18]14。因此，針對含有CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的提取，必須先破壞CMC-Na的膠體作用。但CMC-Na黏度在pH 6～9時最大，pH 7時保護(hù)膠體性最佳，pH為10或更高時，對黏度影響較小甚至有微小增高現(xiàn)象[19-20]，因此，堿水解環(huán)境基本不影響CMC-Na的膠體性及黏度，使得堿水解過程中氨水很可能無法充分水解酪蛋白，使得脂肪無法得到充分釋放游離，造成脂肪抽提不完全。而且CMC-Na添加量越高，膠體覆蓋吸附酪蛋白越全面，有機溶劑抽提過程中不溶的膠狀物質(zhì)越多，脂肪得到充分水解游離及完全抽提的概率越小，使得測定結(jié)果越低。因此，在堿性環(huán)境不變的情況下，以及無其他影響CMC-Na化學(xué)特性的因素存在下，僅通過改變氨水體積、水解溫度、水解時間以及抽提次數(shù)，并不會對脂肪的測定產(chǎn)生有效影響。

2.3 鹽酸水解對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響

在堿水解法中各參數(shù)條件不變的情況下，用不同體積的鹽酸代替氨水對含CMC-Na的發(fā)酵乳進(jìn)行脂肪測定，結(jié)果見表2。由表2可知，2 mL鹽酸水解時，不含CMC-Na的發(fā)酵乳中脂肪測定結(jié)果，與堿水解法測定結(jié)果基本一致，并且CMC-Na添加量為0.50%，0.75%，1.00%時，2 mL鹽酸水解結(jié)果分別為3.90，3.89，3.92 g/100 g，與堿水解法測定不含CMC-Na發(fā)酵乳的結(jié)果偏差最高為0.02 g/100 g，在國標(biāo)規(guī)定的0.1 g/100 g的允差要求內(nèi)，可認(rèn)為檢測結(jié)果一致。同時，采用2 mL鹽酸對市售兩款含有CMC-Na的產(chǎn)品進(jìn)行水解，其脂肪測定結(jié)果分別為2.73，3.11 g/100 g，與標(biāo)示值2.7，3.2 g/100 g接近。但隨著鹽酸體積的增加，脂肪測定結(jié)果逐漸提高，4 mL時，檢測結(jié)果提高了0.04～0.08 g/100 g，但基本還在偏差要求范圍內(nèi)，但當(dāng)鹽酸體積增至6 mL時，脂肪檢測結(jié)果有了明顯提升，偏差均超過了0.1 g/100 g，最高達(dá)到0.19 g/100 g，當(dāng)體積增至8，10 mL時，結(jié)果基本穩(wěn)定，但偏差最高達(dá)到0.27 g/100 g，并且提取物中出現(xiàn)黑色焦?fàn)钗铩?/p>

表2 不同體積鹽酸水解對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定結(jié)果的影響?Table 2 Determination results of fat in fermented milk containing CMC-Na by hydrolysis with different volumes of hydrochloric acid g/100 g

試驗結(jié)果表明，參照堿水解法中的參數(shù)條件，可采用2 mL鹽酸替代氨水水解含CMC-Na的發(fā)酵乳，其脂肪測定結(jié)果即可到達(dá)正常值。根據(jù)相關(guān)研究[21]，當(dāng)pH降低時，CMC-Na體系部分負(fù)電荷得到中和，分子鏈卷曲，黏度減小，pH過低時則形成CMC-Na游離酸而沉淀，從而破壞了CMC-Na與酪蛋白的吸附，進(jìn)而鹽酸水解脂肪球膜，釋放脂肪。但當(dāng)鹽酸體積升高至6 mL及更高時，脂肪測定結(jié)果偏高且出現(xiàn)黑色焦?fàn)钗?，有研究[22]表明該現(xiàn)象主要是由于分解物和水一同混入所致，當(dāng)有機溶劑揮干后，則會產(chǎn)生黑色焦油狀物質(zhì)；隨著鹽酸濃度的增大，可能導(dǎo)致樣品過度水解，同時加劇了糖類等物質(zhì)的炭化，更多分解產(chǎn)物混入而使檢測值偏高。

2.4 金屬離子對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響

2.4.1 Na+、K+對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響 由圖3和圖4可知，Na+與K+的變化趨勢基本一致。Na+、K+的濃度越高，含CMC-Na發(fā)酵乳的脂肪測定結(jié)果越高，并在金屬離子濃度達(dá)到0.5 mol/L時，含不同濃度CMC-Na的發(fā)酵乳脂肪測定值基本達(dá)到穩(wěn)定，與不含CMC-Na發(fā)酵乳的堿水解測定結(jié)果(3.91 g/100 g)一致。CMC-Na是一種陰離子型聚電解質(zhì)，通過同性電荷的靜電排斥作用使得分子鏈得以伸展，呈現(xiàn)高黏度及穩(wěn)定等特性[23]。研究[18]27[24]表明，加入Na+、K+后，溶液中離子強度發(fā)生改變，使得CMC-Na部分陰離子靜電場得到平衡，同性電荷的靜電排斥作用減弱，分子鏈卷曲體系粒徑變小，黏度降低；同時，使得陰離子聚合物pKa值降低，降低了CMC-Na與酪蛋白的吸附作用。因此，可能減弱了CMC-Na對氨水水解酪蛋白膜的阻礙，使得脂肪測定結(jié)果隨Na+、K+濃度的增加而增加，最終達(dá)到提取完全。

圖3 NaCl對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響Figure 3 Effects of NaCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

圖4 KCl對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響Figure 4 Effects of KCl on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

2.4.2 Ca2+對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響 由圖5可知，Ca2+對含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的影響與Na+、K+不同。隨著Ca2+濃度的增加，在低濃度0.01，0.05 mol/L時，脂肪的測定結(jié)果存在小幅的上升，隨后濃度再增加時，脂肪測定結(jié)果顯著下降，甚至低于未加金屬離子時的脂肪結(jié)果。研究[25-26]表明，Ca2+的加入，一開始時會因陽離子抵消了CMC-Na部分陰離子聚合電解質(zhì)效應(yīng)，使其黏度降低，與酪蛋白吸附成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的能力降低，因而脂肪測定結(jié)果會部分提高，但當(dāng)鈣離子增加時，高分子會通過鈣發(fā)生螯合作用形成超結(jié)構(gòu)，使得CMC-Na黏度進(jìn)一步增加，與酪蛋白的結(jié)合更加牢固，可能導(dǎo)致氨水水解酪蛋白膜的效果更差，脂肪測定結(jié)果更低。

圖5 CaCl2對堿水解法測定含CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪的影響Figure 5 Effects of CaCl2 on determination of fat in fermented milk containing CMC-Na by alkali hydrolysis method

3 結(jié)論

當(dāng)發(fā)酵乳中CMC-Na添加量達(dá)到0.50%時，會使得脂肪含量的檢測結(jié)果明顯偏低，并且堿水解法中關(guān)鍵條件(氨水體積、水解時間、水解溫度、提取次數(shù))的調(diào)整，不會提高含有CMC-Na發(fā)酵乳中脂肪測定的準(zhǔn)確性。但當(dāng)采用2 mL鹽酸水解含CMC-Na不同添加量(0.50%，0.75%，1.00%)的發(fā)酵乳時，即可使得其脂肪測定結(jié)果趨于正常；此外，通過在堿水解法中加入一定濃度的Na+或K+(0.5 mol/L及以上)，同樣可以改善含CMC-Na發(fā)酵乳的脂肪測定結(jié)果。

CMC-Na的添加對發(fā)酵乳中脂肪的測定存在不利影響，容易造成產(chǎn)品的不合格判定，在日常檢測中，需重點關(guān)注該現(xiàn)象，及時改進(jìn)檢測方法，避免產(chǎn)品誤判。但是，隨著添加劑種類的增多，可能還有其他添加劑影響關(guān)鍵成分準(zhǔn)確測定的現(xiàn)象出現(xiàn)，需要對日常檢測工作中的異?，F(xiàn)象進(jìn)行及時總結(jié)，對相關(guān)添加劑的化學(xué)特性進(jìn)行深入了解，從而推動國家標(biāo)準(zhǔn)方法的改進(jìn)修訂，以保證產(chǎn)品質(zhì)量的精準(zhǔn)判定，同時也為企業(yè)對添加劑的選擇提供一定參考。