野牛草種質(zhì)資源評價與分析

喬葭月，孫熙喏，屈新月，王 儲，馬承澤，崔會婷，麻冬梅，孫 彥*

(1. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100193； 2. 寧夏大學(xué)生態(tài)環(huán)境學(xué)院，寧夏 銀川 750021)

野牛草(Buchloedactyloides(Nutt.) Engelm.)又名水牛草、牛毛草，是一種重要的多年生暖季型草坪草，隸屬禾本科野牛草屬。野牛草原產(chǎn)自北美大平原半干旱地區(qū)[1]，于20世紀(jì)引進(jìn)我國種植，因?yàn)槠渲仓甑桶?、需肥量少、適應(yīng)性和抗旱、抗病性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)而逐漸成為我國北方地區(qū)防風(fēng)固沙、公共綠地、公園和公路等粗放管理型草坪的主要草種之一。但野牛草草坪顏色淺、綠期短、耐蔭性差的缺點(diǎn)大大限制了其應(yīng)用范圍。在多年的引種馴化和不同地理區(qū)域長期種植過程中，野牛草的形態(tài)特征和坪用特性發(fā)生了很大變異。成凱凱[2]等人認(rèn)為不同地理來源的野牛草種質(zhì)資源其形態(tài)特征存在差異性，陳科[3]認(rèn)為野牛草的表型特征與地理氣候因子相關(guān)，高溫濕潤氣候條件下野牛草材料的表型特征更大。目前，關(guān)于野牛草種質(zhì)資源方面報道主要集中在野牛草倍性與表型特征的研究[4-5]，野牛草品種逆境評價[6-7]，利用各種分子標(biāo)記手段對野牛草品種遺傳多樣性進(jìn)行評價[2,8-11]等方面。雖然分子標(biāo)記技術(shù)在種質(zhì)資源鑒定和分類中已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用，但形態(tài)特征評價直觀、簡單、易測的特點(diǎn)使其在植物遺傳多樣性研究中仍是一種簡便有效的方法[12-14]，是優(yōu)異資源基因挖掘和利用的堅實(shí)基礎(chǔ)。本研究通過對供試的29份野牛草材料進(jìn)行形態(tài)特征和坪用特性評價和進(jìn)一步分析，為野牛草種質(zhì)資源開發(fā)利用和優(yōu)良品種的選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于河北省涿州市中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州實(shí)驗(yàn)站，地理坐標(biāo)為39°28′ N，115°51′ E，屬溫帶大陸性季風(fēng)氣候，夏季高溫多雨，冬季寒冷干燥，四季分明，全年平均日照2 560 h,年平均氣溫為11.6℃，土壤砂質(zhì)，表層(0～15 cm)土壤pH 8.3，有機(jī)質(zhì)含量1.95%，有機(jī)碳含量1.13%，全氮含量0.63 g·kg-1，全磷含量0.37 g·kg-1,速效磷含量14.39 mg·kg-1，具備灌溉條件。

1.2 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用的29份野牛草(Buchloedactyloides(Nutt.) Engelm.)種質(zhì)資源來源于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)涿州草坪種質(zhì)資源圃，草坪科研團(tuán)隊(duì)長期于國內(nèi)外采集與收集，資源編號為BD001～BD029。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1試驗(yàn)設(shè)計 試驗(yàn)小區(qū)面積為4 m2(2 m×2 m)，設(shè)置4次重復(fù)，采用完全隨機(jī)設(shè)計，小區(qū)之間間隔0.5 m。2018年10月從資源圃中取各個材料的第3個莖節(jié)栽植于花盆中，置于中國農(nóng)業(yè)大學(xué)溫室中育苗，次年5月移栽至小區(qū)內(nèi)。2019年5月—2020年8月進(jìn)行數(shù)據(jù)采集。小區(qū)按需進(jìn)行灌溉以及人工除草，未施用肥料。形態(tài)特征測定主要涉及葉長、葉寬、株高、匍匐莖長、節(jié)間長、莖節(jié)數(shù)以及直徑共7個指標(biāo)。坪用特性測定主要包括顏色、均一性、質(zhì)地、密度、蓋度、擴(kuò)展面積、綠期共7個指標(biāo)。

1.3.2形態(tài)特征觀測 葉長：每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取15個單株的第2片完全展開葉，用直尺測量葉尖至葉基部的長度。

葉寬：用游標(biāo)卡尺測量上述葉片的最寬處。

株高：每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取15個單株，用直尺測量植株最高部位至地面的絕對高度。

匍匐莖長：每小區(qū)隨機(jī)選取15根匍匐莖，用直尺測量其頂端至基部的總長度。

匍匐莖節(jié)數(shù)：對上述匍匐莖的莖節(jié)數(shù)進(jìn)行人工計數(shù)。

匍匐莖節(jié)間長：用直尺測量上述匍匐莖從基部開始第2個和第3個莖節(jié)之間的長度。

匍匐莖直徑：用游標(biāo)卡尺測量上述第2～3個莖節(jié)之間莖的直徑。

1.3.3坪用特性測定 質(zhì)地：以葉片寬度作為質(zhì)地的評價依據(jù)，每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取30單株的第2片完全展開葉，用直尺測量葉片最寬處。

密度：每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3個10 cm×10 cm樣方，記錄樣方內(nèi)枝條的數(shù)目。

蓋度：每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取3個50 cm×50 cm的樣方，樣方內(nèi)含有100個等分小格，記錄每小格內(nèi)野牛草所占比例。

顏色：用葉綠素含量SPAD值表示[15]。每小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取15株單株，采用SPAD-502 Plus葉綠素儀對第2片完全展開葉進(jìn)行測定，每片葉子3次技術(shù)重復(fù)。

均一性：依照NTEP 1～9分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行打分。

擴(kuò)展面積：在小區(qū)建植完成12周后，對野牛草覆蓋面積進(jìn)行測量。

綠期：以野牛草群落50%枯黃記為枯黃期開始，以群落50%返青即返青期記為枯黃期結(jié)束，以全年天數(shù)減去枯黃天數(shù)即為綠期[16]。

1.4 數(shù)據(jù)整理與分析

采用Microsoft Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，用SPSS 25.0進(jìn)行相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 野牛草種質(zhì)資源形態(tài)特征評價

由表1可知，這29種野牛草的7個形態(tài)特征指標(biāo)均表現(xiàn)出較大的變異，變異范圍為8.70%～23.44%。葉長、匍匐莖長、匍匐莖節(jié)間長、匍匐莖節(jié)數(shù)這4個形態(tài)指標(biāo)的變異系數(shù)>15%，分別為17.59%，23.44%，22.82%，17.34%，其中，匍匐莖長的變異最為豐富，平均值為63.10 cm，變化范圍在25.38～84.11 cm。由此說明，匍匐莖的莖節(jié)數(shù)、節(jié)間長，特別是匍匐莖長度的變異豐富，可以通過系統(tǒng)選育的方式進(jìn)行改良，從而獲得擴(kuò)繁能力強(qiáng)的品系。而變異系數(shù)較小的指標(biāo)如葉寬(9.44%)和匍匐莖直徑(8.70%)的變異相對較為穩(wěn)定，難以通過系統(tǒng)選育的方式進(jìn)行改良。

表1 29份野牛草種質(zhì)資源形態(tài)特征測定結(jié)果Table 1 Morphological characteristics of 29 species of buffalograss germplasm resources

2.2 野牛草種質(zhì)資源坪用特性評價

由表2可知，29份野牛草種質(zhì)資源的7個坪用指標(biāo)的變異系數(shù)介于1.88%～25.27%，其中，變異系數(shù)最大的是擴(kuò)展面積，為25.27%，其變化范圍在1.35～3.79 m2，平均值為2.65 m2。變異系數(shù)最小的指標(biāo)是蓋度，變化范圍在92.13%～100%，平均值為98.14%，從總體來看，野牛草的坪用特性的變異程度要小于個體形態(tài)特征的變異。

表2 29份野牛草種質(zhì)資源坪用特性測定結(jié)果Table 2 Turf characteristics of 29 species of buffalograss germplasm resources

2.3 野牛草形態(tài)特征和坪用特性相關(guān)性分析

對29份野牛草種質(zhì)材料的14個形態(tài)特征和坪用特性指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)野牛草形態(tài)特征間廣泛存在相關(guān)性(表3)。葉長與葉寬、株高、匍匐莖節(jié)間長、匍匐莖直徑存在極顯著正相關(guān)；株高與匍匐莖長、節(jié)間長、存在極顯著正相關(guān)，與匍匐莖直徑存在顯著正相關(guān)；匍匐莖長與匍匐莖節(jié)間長、莖節(jié)數(shù)、直徑存在極顯著正相關(guān)。野牛草的坪用特性與其形態(tài)特征也存在相關(guān)性。葉長與質(zhì)地存在極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.57，與密度、綠期極顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.68和-0.51，與均一性顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為-0.39；葉寬與密度存在顯著負(fù)相關(guān)，與質(zhì)地存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，這與質(zhì)地的評價方法有關(guān)；株高與質(zhì)地、擴(kuò)展面積存在顯著正相關(guān)，與密度存在極顯著負(fù)相關(guān)；匍匐莖長度、節(jié)間長與擴(kuò)展面積存在極顯著正相關(guān)，而與密度存在顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；匍匐莖直徑與質(zhì)地存在極顯著正相關(guān)，與密度存在極顯著負(fù)相關(guān)。坪用特性的某些指標(biāo)間也存在相關(guān)性，比如質(zhì)地與顏色之間存在極顯著正相關(guān)，與密度間存在極顯著負(fù)相關(guān)；綠期與密度、顏色、均一性顯著正相關(guān)。總體而言，坪用特性指標(biāo)中密度和質(zhì)地與較多形態(tài)指標(biāo)相關(guān)，即更容易受到比如葉長、葉寬、匍匐莖直徑的影響。

表3 野牛草形態(tài)特征和坪用特征相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of buffalograss between phenotypic traits and turf appraising

2.4 野牛草形態(tài)特征和坪用質(zhì)量主成分分析

主成分分析可以在不損失或很少損失原有信息的前提下，將原來個數(shù)較多且彼此相關(guān)的指標(biāo)轉(zhuǎn)換為新的個數(shù)較少且彼此獨(dú)立的綜合指標(biāo)[17]。本研究首先對29份野牛草的14個指標(biāo)進(jìn)行KMO和Bartlett球形度檢驗(yàn)，得到KMO值為0.616>0.5，Bartlett檢驗(yàn)結(jié)果顯著性為0.000<0.05，適宜進(jìn)行主成分分析。

以特征值大于1為標(biāo)準(zhǔn)提取主成分，從主成分分析結(jié)果(表4)可以看出，共提取主成分4個，累計貢獻(xiàn)率為77.244%，可基本代表14個性狀的大部分信息。第一主成分特征值為4.997，貢獻(xiàn)率為35.694%，其中載荷較大的因子包括葉長(0.831)、株高(0.834)、密度(-0.785)、匍匐莖節(jié)間長(0.749)。第二主成分特征值為2.915，其貢獻(xiàn)率為20.823%，載荷較大的因子是顏色(0.843)。第三主成分特征值為1.785，其貢獻(xiàn)率為12.747%，作用最大的因子是匍匐莖節(jié)數(shù)，載荷量為0.879。第四主成分特征值為1.117，其貢獻(xiàn)率為7.981%，其中載荷較大的因子是綠期(0.477)和匍匐莖節(jié)間長(0.473)。

在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建4個新的變量y1～y4來反映這4個主成分的得分，

y=∑cx

式中：c為特征向量，x為標(biāo)準(zhǔn)化后的性狀值。

同時以各主成分的方差貢獻(xiàn)率為系數(shù)，構(gòu)建綜合評價模型[18-19]，F(xiàn)= 0.356 94y1+0.208 23y2+0.127 47y3+0.079 81y4，以此來對各野牛草種質(zhì)進(jìn)行綜合評價，評價結(jié)果(表5)中，BD003，BD007，BD0013，BD019，BD022，BD026，BD027，BD029，這8份材料綜合評價值F>0.8，綜合表現(xiàn)整體優(yōu)良。

表4 主成分分析結(jié)果Table 4 Principal component analysis results

表5 29種野牛草種質(zhì)資源綜合評價得分Table 5 the comprehensive evaluation scores of 29 bison grass germplasm resources

2.5 聚類分析

根據(jù)不同的利用方向或育種目標(biāo)，選擇相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類分析，并對表現(xiàn)良好的類群各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行基本統(tǒng)計。

選擇擴(kuò)展面積和匍匐莖相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行聚類，可從中選擇出適宜作為培育強(qiáng)擴(kuò)繁能力的親本或適宜應(yīng)用在生態(tài)修復(fù)和需要快速建植區(qū)域的材料。聚類方法采用瓦爾德法，由圖1A可知，在平方歐氏距離為13.2處，可以將這29份材料分成3大類，第Ⅰ類群包括BD004,BD005兩份材料，這一類群匍匐莖短(28.80 cm)而莖節(jié)數(shù)多(9.72)，擴(kuò)展速度慢，第Ⅱ類群包括12份種質(zhì)，分別為BD001，BD007，BD010，BD011，BD012，BD013，BD015，BD016，BD017，BD020，BD021，BD027，這一類群的各項(xiàng)指標(biāo)平均值最大，其中匍匐莖長75.16 cm,莖節(jié)數(shù)為11.52，擴(kuò)展能力最強(qiáng)。剩下的材料聚在第Ⅲ類群，擴(kuò)展性處于適中水平。

選擇葉長、葉寬、株高、質(zhì)地、密度、蓋度、顏色和均一性進(jìn)行聚類，來初步篩選適宜用來觀賞的材料。由圖1B可知，在平方歐氏距離為11.2處，可以將材料分為3大類群，第Ⅰ類群包括BD004，BD005兩份材料，其葉短(10.73 cm)而窄(1.45 mm)，質(zhì)地細(xì)膩，密度最高(71株·100 cm-2)。第Ⅱ類群包括11份材料，分別為BD002，BD003，BD006，BD007，BD013，BD019，BD022，BD025，BD026，BD027，BD0029，這一類群植株高大(29.12 cm)，葉長(21.08 cm)且色深(25.51)，不足是密度較低(47株·100 cm-2)。第Ⅲ類群包括剩下的16份材料，這一類群蓋度、顏色、均一性與其他兩個類群接近，其他性狀處于中等水平。

圖1 29份野牛草種質(zhì)資源聚類分析Fig.1 Cluster analysis of 29 buffalograss resources注：A圖為依據(jù)野牛草擴(kuò)展相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類，B圖為依據(jù)觀賞用相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類Note：Figure A shows clustering based on expansion related indexes,and figure B shows clustering based on ornamental related indexes

3 討論

野牛草種質(zhì)資源的形態(tài)特征和坪用特性受到遺傳因素和環(huán)境因素的共同影響[20]。在本試驗(yàn)中，29份野牛草種質(zhì)資源的生長條件一致、管理措施相同，研究其形態(tài)特征和坪用特性可以直觀了解野牛草的遺傳多樣性，為種質(zhì)資源的收集、保存、鑒定和種質(zhì)資源創(chuàng)新、新品種培育奠定基礎(chǔ)[21-22]。

變異系數(shù)主要反映各種質(zhì)資源中特征性狀的變異程度，變異系數(shù)值越大，說明相應(yīng)的特征性狀在種質(zhì)間的差異越大，對種質(zhì)變異和創(chuàng)新的貢獻(xiàn)率越高[23]，利用這些性狀對種質(zhì)進(jìn)行鑒別的可能性越大[24]。在本研究中，葉長、匍匐莖長、匍匐莖節(jié)間長、莖節(jié)數(shù)在各種質(zhì)中差異較大，變異系數(shù)均高于17%，說明這些性狀在種質(zhì)遺傳中不太穩(wěn)定，易于改變，具有優(yōu)良的開發(fā)潛力；而葉寬、匍匐莖直徑變異相對較小，低于10%，說明這兩個性狀遺傳較為穩(wěn)定，難以通過系統(tǒng)選育的方式進(jìn)行改良。成凱凱[2]在對30種野牛草種質(zhì)資源的形態(tài)特征進(jìn)行顯著性差異評價時認(rèn)為各資源之間葉長、葉寬、株高、匍匐莖長度和匍匐莖節(jié)數(shù)存在極顯著差異(P<0.01),除葉寬這一指標(biāo)，其他具有極顯著差異的指標(biāo)與本研究變異系數(shù)較大的形態(tài)特征基本相符，這可能與變異程度的評價標(biāo)準(zhǔn)不同有關(guān)。野牛草的坪用特性變異系數(shù)范圍為1.88%～25.29%，草坪蓋度變異系數(shù)最小，擴(kuò)展面積即匍匐莖的生長速度變異范圍最大，與匍匐莖長變異系數(shù)(23.44%)大相對應(yīng)。說明對于野牛草種質(zhì)資源來說，蓋度這一性狀比較穩(wěn)定，而匍匐莖的生長速度在材料間差異較大，說明這一性狀容易改良，可以經(jīng)選育獲得成坪速度快的優(yōu)良品系。

在前人的研究中，野牛草表型性狀與其坪用特性存在顯著相關(guān)性，葉長、單叢分株數(shù)與坪用等級存在極顯著負(fù)相關(guān)[25]。在研究中，草坪質(zhì)地與葉寬相關(guān)性高，這與質(zhì)地的評價標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)，一般來說，葉片寬度越細(xì)，觀賞效果越好，草坪的質(zhì)地越好。匍匐莖直徑與質(zhì)地存在顯著正相關(guān)，直徑越細(xì)，草坪質(zhì)地也越好。草坪密度與葉長、葉寬、株高、匍匐莖長、節(jié)間長、直徑存在極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，這與前人研究結(jié)果類似。孫宗玖等[26]在對新疆狗牙根農(nóng)藝性狀評價時認(rèn)為，草坪處于低密度時，群體所處空間較大，植株會獲得更多營養(yǎng)從而植株生長旺盛，表型更高大。代保清等[27]的研究結(jié)果表明，在不同密度條件下，結(jié)縷草的無性系構(gòu)件會采取不同的適應(yīng)性對策，比如低密度條件下，匍匐莖總數(shù)、總長、節(jié)間長等都會增加，迅速占領(lǐng)空間，而在高密度條件下則會減緩生長。草坪的蓋度與擴(kuò)展面積呈顯著正相關(guān)，說明在建坪時間較短的情況下，擴(kuò)展面積越大即匍匐莖長的越快的，蓋度也越高；但是并未發(fā)現(xiàn)蓋度與匍匐莖長存在顯著相關(guān)性。

主成分分析法可以將植物多個性狀指標(biāo)轉(zhuǎn)化為少數(shù)幾個不相關(guān)的綜合指標(biāo)，從而達(dá)到綜合和簡化的目的[28]，在水稻[29]、燕麥[30-31]、披堿草[32]等多種植物種質(zhì)資源評價過程中廣泛應(yīng)用。在本研究中，14個指標(biāo)經(jīng)主成分分析化為4個主成分，累計貢獻(xiàn)率達(dá)77.244%，包含了大部分信息，根據(jù)這4個主成分信息，可有針對性地進(jìn)一步選擇符合預(yù)期目標(biāo)的可利用資源，并且，基于主成分分析的綜合評價值中，BD003，BD007，BD0013，BD019，BD022，BD026，BD027，BD029這8份材料綜合表現(xiàn)良好，且在聚類分析中，這8份材料同屬于觀賞用聚類第Ⅱ類群。

聚類分析是指將物理或抽象對象的集合分組為由類似的對象組成的多個類的分析過程，已成為植物育種的必要手段之一。應(yīng)用聚類分析可以很好反映種質(zhì)資源間的遺傳差異和各類群的特點(diǎn)[33]。本研究中根據(jù)育種目標(biāo)或利用方式選擇相應(yīng)的指標(biāo)進(jìn)行聚類，以期為選擇優(yōu)良的育種親本或栽培材料提供參考，提高效率。根據(jù)和擴(kuò)展性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類，選出第Ⅱ類群12份擴(kuò)展性強(qiáng)的種質(zhì)，根據(jù)與觀賞性相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行聚類，選出第Ⅰ類群BD004，BD005兩份低矮型材料和第Ⅱ類群11份高大型材料，可根據(jù)實(shí)際觀賞用途或育種目標(biāo)從中再進(jìn)一步選擇。

4 結(jié)論

本研究中的29份野牛草種質(zhì)資源具有豐富的變異，形態(tài)特征和坪用特性之間具有廣泛相關(guān)性。其中，基于主成分綜合得分篩選出8份綜合表現(xiàn)優(yōu)良的材料BD003，BD007，BD0013，BD019，BD022，BD026，BD027，BD029，并且這8份材料在基于觀賞用指標(biāo)聚類時同聚在一類，具有植株高大，葉片長且色深的特點(diǎn)。在基于擴(kuò)展性和觀賞性指標(biāo)分別進(jìn)行聚類時，可將29份材料分別分為3類，本研究可為野牛草的實(shí)際應(yīng)用提供理論參考。