核磁共振氫譜法測(cè)定果汁中主要糖類的含量

馮翠萍，劉一諾，許紫薇，樊雙喜，岳紅衛(wèi)，辛剛，姜楠，鐘其頂,5*

1(中輕食品檢驗(yàn)認(rèn)證有限公司，北京，100015)2(北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京，100091)3(國(guó)投中魯果汁股份有限公司， 北京，100070)4(國(guó)投中魯果汁股份有限公司乳山研發(fā)中心，山東 威海，264513)5(國(guó)家食品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)中心，北京，100015)

糖含量高低是決定果汁品質(zhì)重要指標(biāo)之一，也是果汁中重要的營(yíng)養(yǎng)成分和風(fēng)味成分[1-2]，糖類分子不但負(fù)擔(dān)著能源和結(jié)構(gòu)支架的職能，而且作為信息分子，在細(xì)胞黏著、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、發(fā)育分化、免疫細(xì)胞成熟活化、生殖受精，以及共生寄生等一系列維持生命所需的重要生理過程中，起著介導(dǎo)和調(diào)節(jié)作用[3]。果汁中主要的糖類包括果糖、葡萄糖和蔗糖[4]。GB/T 21731—2008《橙汁及橙汁飲料》等果汁質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中均對(duì)果糖、葡萄糖、蔗糖含量做了明確規(guī)定。所以準(zhǔn)確測(cè)定果汁中的果糖、葡萄糖、蔗糖的含量對(duì)于研究果汁的品質(zhì)具有重要的意義。

通?？偺堑臏y(cè)定方法均是先利用酸水解法使沒有還原的雙糖和多糖徹底水解成有還原性的單糖，再利用還原糖的測(cè)定方法來測(cè)總糖的含量[5-7]。但總糖的測(cè)定方法無法對(duì)單糖含量準(zhǔn)確測(cè)定，且前處理步驟繁瑣，測(cè)試耗時(shí)長(zhǎng)。高效液相色譜法、高效毛細(xì)管電泳法雖然可對(duì)葡萄糖、果糖、蔗糖單項(xiàng)含量進(jìn)行準(zhǔn)確測(cè)定，但涉及的條件多，操作復(fù)雜，耗時(shí)也較長(zhǎng)[8-10]。而且，這些常規(guī)技術(shù)一般無法實(shí)現(xiàn)對(duì)同一樣品中多種成分的同時(shí)測(cè)定，檢出限和定量限也相對(duì)較高。

目前核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)在飲料及其他食品方面的定性定量應(yīng)用越來越廣泛[11-15]，此種方法前處理簡(jiǎn)單測(cè)試用時(shí)少，可提供復(fù)雜基質(zhì)體系中多種物質(zhì)的結(jié)構(gòu)信息，并能夠同時(shí)實(shí)現(xiàn)多種物質(zhì)的定量測(cè)定。除定性定量檢測(cè)外，NMR譜還可用于非目標(biāo)指紋譜圖檢測(cè)技術(shù)[16]，如用于食品類別、非法摻假、產(chǎn)地檢測(cè)等。但定性定量的目標(biāo)性檢測(cè)目前還是NMR的主要應(yīng)用，2017年ACKERMANN等[17]通過使用基于PULCON原理的外標(biāo)定量法，同時(shí)定量分析了糖、調(diào)味料、甜味劑、有機(jī)酸、乙醇、維生素和氨基酸等11種化合物，回收率在80%～106%，樣品制備和分析僅需25 min，相比常規(guī)方法有非常明顯的優(yōu)勢(shì)。基于此，本研究旨在開發(fā)水峰壓制的1H NMR內(nèi)標(biāo)法及外標(biāo)法定量檢測(cè)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)果汁中主要糖類物質(zhì)(葡萄糖、果糖、蔗糖)快速、同步、準(zhǔn)確定性定量測(cè)定，同時(shí)為建立果汁NMR指紋圖譜真實(shí)性鑒別技術(shù)奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檸檬酸(99%)、蔗糖(99%)，Vetec公司；果糖(99%)、葡萄糖(99.5%)，Sigma公司；鄰苯二甲酸氫鉀(99%)，北京百靈威科技有限公司；3-(三甲基硅基)氘代丙酸鈉[2,2,3,3-d(4)-3-(trimethylsilyl)propionic acid sodium salt, TSP，98%]、KH2PO4(98%)，CIL公司；疊氮化鈉(NaN3，高純)，Biotopped公司；D2O(99.9%)，青島騰龍微波科技有限公司；各類水果及果汁樣品，部分由國(guó)投中魯果汁股份有限公司提供，部分購(gòu)自某電商平臺(tái)(包括各類桃、蘋果、梨、橙子及其果汁)。

1.2 儀器與設(shè)備

Bruker Avance III HD 400 MHz波譜儀、Bruker pH自動(dòng)調(diào)節(jié)裝置BTpH、Bruker SampleJet 5 mm高通量核磁管，Bruker Biospin，Rheinstetten公司；Bruker 579位自動(dòng)進(jìn)樣器，SampleJet；AB204-N天平，METTLER TOLEDO公司；KH19A離心機(jī)，北京雷勃爾離心機(jī)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 緩沖溶液、外標(biāo)、內(nèi)標(biāo)溶液及標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

緩沖溶液配制：用天平準(zhǔn)確稱取0.13 g NaN3和1.0 g TSP于10 mL容量瓶中，用D2O將其溶解并準(zhǔn)確定容至10 mL，得到100 g/L TSP溶液和13 g/L NaN3溶液。準(zhǔn)確稱取8.0 g KH2PO4，轉(zhuǎn)移至200 mL容量瓶中，加入100 mL D2O將其溶解，然后加入5 mL 磷酸以及2 mL 100 g/L TSP溶液和13 g/L NaN3溶液，最后再加入50 mL D2O。24 h后，準(zhǔn)確測(cè)定該緩沖溶液pH值，若pH>2.0，則加入少量磷酸調(diào)整，若pH<2.0，則加入KH2PO4固體粉末，直至pH穩(wěn)定在2.0±0.02。

內(nèi)標(biāo)液配制：稱取100 mg(精確至0.1 mg)鄰苯二甲酸氫鉀于10 mL容量瓶中，用重水定容，混勻。0～4 ℃密封保存。

外標(biāo)液配制：稱取20.0 mg(精確至0.1 mg)檸檬酸至10 mL容量瓶，用蒸餾水定容，混勻。0～4 ℃密封保存。取800 μL檸檬酸溶液，再加入200 μL緩沖液，取600 μL于核磁管中待測(cè)。

果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取400 mg果糖標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40 g/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶儲(chǔ)備溶液。再用蒸餾水逐級(jí)稀釋，配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的果糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液槍取800 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，移取600 μL與核磁管中測(cè)定。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取400.0 mg葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。再用蒸餾水逐級(jí)稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。移液槍取800 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，移取600 μL于核磁管中測(cè)定。

蔗糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制：準(zhǔn)確稱取400.0 mg蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品于燒杯中，加入適量蒸餾水，待其完全溶解后，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中并用蒸餾水定容，搖勻后得到質(zhì)量濃度為40.0 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液溶。再用蒸餾水逐級(jí)稀釋，依次配制成質(zhì)量濃度分別為40.0、20.0、10.0、5.0、2.5、1.25、0.625 g/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。用移液槍取800 μL標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，移取600 μL于核磁管中測(cè)定。

1.3.2 水果、澄清果汁、不澄清果汁及濃縮果汁上機(jī)樣品制備

水果樣品：選取新鮮、飽滿、無病斑、無劃痕的水果(包括各類桃、蘋果、梨、橙子)，去除果皮和果核后榨汁，經(jīng)3層紗布過濾后，保留濾液。取3 mL濾液于5 mL 離心管中，8 000 r/min離心10 min，保留上清液待用，用0.45 μm水系微孔濾膜過濾至樣品瓶中，取800 μL，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測(cè)。

澄清果汁樣品：取800 μL果汁樣品，再加入100 μL 緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測(cè)。

不澄清果汁樣品：取果汁樣品于離心管中，6 000 r/min 離心10 min，取上清液，再用0.45 μm水系微孔過濾膜過濾至樣品瓶，再取800 μL，加入100 μL 緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測(cè)。

濃縮果汁樣品：稀釋濃縮果汁樣品使其濃度為原濃度0.5倍。取稀釋后的果汁樣品800 μL，再加入100 μL緩沖溶液和100 μL鄰苯二甲酸氫鉀內(nèi)標(biāo)液，充分搖勻，取600 μL于核磁管中待測(cè)。

1.3.3 測(cè)定參數(shù)

核磁管不旋轉(zhuǎn)；檢測(cè)溫度：(300±0.1) K；空掃次數(shù)：4次；掃描次數(shù)：16次；譜寬：20.00 ppm；采樣點(diǎn)數(shù)：64 k；接收增益：16；弛豫延遲：4 s；以TSP(δ= 0)作為化學(xué)位移的零點(diǎn)；采用布魯克標(biāo)準(zhǔn)脈沖序列noesygppr1 d用于水峰信號(hào)抑制的氫譜測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用MestReNova 12.0軟件(Mestrelab Research S.L.，MestReNova(Mnova)NMR，美國(guó))對(duì)1H NMR譜圖進(jìn)行傅里葉變換、基線校正、相位調(diào)整。線寬因子為0.3。相位校正選擇metabonomics算法，先自動(dòng)優(yōu)化，后針對(duì)特定區(qū)域進(jìn)行手動(dòng)校正，使盡可能多的積分值為正值?；€校正選擇polynomial fit擬合方式。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品配制方法討論

如果果汁樣品不澄清，會(huì)影響測(cè)試時(shí)的勻場(chǎng)效果，從而影響譜圖的分辨率。所以如果果汁不澄清，需要過濾，從而保證譜圖的質(zhì)量。

pH值會(huì)影響水峰位置，如果每個(gè)樣品水峰位置相差大，那么就不能用相同的水峰壓制位置來壓制水峰，不利于批量測(cè)試，所以在樣品配制時(shí)加了緩沖溶液以穩(wěn)定pH值。

為使定量結(jié)果準(zhǔn)確，樣品測(cè)試時(shí)需要統(tǒng)一增益值，濃縮果汁和普通果汁相比微量物質(zhì)濃度大，如果和普通果汁用同樣的增益值，信號(hào)就會(huì)溢出，譜圖會(huì)發(fā)生畸變，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。所以對(duì)濃縮果汁樣品需要進(jìn)行稀釋，但稀釋的倍數(shù)太大，又會(huì)影響定量的檢測(cè)限和定量限，研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于大部分濃縮果汁，只需要稀釋一倍，同普通果汁使用相同的增益值，信號(hào)就不會(huì)發(fā)生溢出的現(xiàn)象。

2.2 果汁中水峰的壓制

由于樣品中主要是水，水的強(qiáng)共振信號(hào)會(huì)對(duì)樣品信號(hào)產(chǎn)生掩蓋作用，故需對(duì)溶劑信號(hào)進(jìn)行壓制[18-19]，使果汁中微量成分的信號(hào)強(qiáng)度明顯提高。經(jīng)過溶劑峰壓制之后，果汁中糖物質(zhì)的信號(hào)顯著提高，水峰的信號(hào)對(duì)定量結(jié)果也不造成干擾。

2.3 定量方法的選擇

常用的定量方法有外標(biāo)法[17,20-21]和內(nèi)標(biāo)法[22-23]，二者各有其優(yōu)缺點(diǎn)。內(nèi)標(biāo)法定量不確定度優(yōu)于外標(biāo)法，內(nèi)標(biāo)物和待測(cè)樣品只需經(jīng)過一次檢測(cè)即可，但需仔細(xì)選擇內(nèi)標(biāo)物質(zhì)避免內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測(cè)物之間的相互作用，避免信號(hào)重疊，內(nèi)標(biāo)物質(zhì)和待測(cè)物必須可溶于所選的NMR溶劑中。外標(biāo)法無需考慮分析物和參考物質(zhì)之間的相互作用和信號(hào)重疊，但需要分別測(cè)定外標(biāo)物質(zhì)和待測(cè)樣品的譜圖和脈沖寬度。所以本研究采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法同時(shí)對(duì)樣品中的果糖、蔗糖、葡萄糖進(jìn)行檢測(cè)。

PULCON外標(biāo)法定量使用外部參考樣品，將外部參考樣品的校準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到實(shí)際樣品中，因此無需考慮分析物和參考樣品之間的相互作用和信號(hào)重疊。此外，采用PULCON外標(biāo)法成本相對(duì)較低，可重復(fù)多次利用，進(jìn)一步降低了NMR的檢測(cè)成本，簡(jiǎn)化了前處理操作。檸檬酸結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，以水做溶劑的1H NMR譜中僅在δ2.65和δ2.52處有檸檬酸2個(gè)亞甲基的4個(gè)氫的2組雙峰，用于定量分析結(jié)果準(zhǔn)確，因此選擇檸檬酸作為外部參考物，用公式(1)計(jì)算待測(cè)物的含量：

(1)

式中：C，分析物質(zhì)量濃度，mg/L；A，絕對(duì)積分面積；M，相對(duì)分子質(zhì)量；nH，質(zhì)子數(shù)；NS，掃描次數(shù)；P1，1H 90°脈沖寬度；T，檢測(cè)溫度；CF，校正因子；Quantref(Q)，外部參考樣品；Sample(S)，待測(cè)分析物。

內(nèi)標(biāo)法定量需在樣品溶液中直接加入一定量的內(nèi)部參考物，在充分弛豫的條件下，核磁共振信號(hào)強(qiáng)度(峰面積)與產(chǎn)生該信號(hào)的原子的數(shù)目成正比，而與其化學(xué)性質(zhì)和所處的化學(xué)環(huán)境無關(guān)。鄰苯二甲酸氫鉀，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，在水中有良好的溶解性，其水溶液的1H NMR譜只有2組峰，每組峰代表2個(gè)氫原子，由圖1可知其δ7.780 處的信號(hào)不與果汁中化合物信號(hào)峰發(fā)生重疊，所以選用鄰苯二甲酸氫鉀作為內(nèi)標(biāo)物。以內(nèi)標(biāo)物的相對(duì)峰面積作為參考，根據(jù)樣品指定質(zhì)子共振峰的相對(duì)峰面積計(jì)算含量，根據(jù)公式(2)計(jì)算分析物濃度：

(2)

式中：C,分析物濃度，mg/L；M,相對(duì)分子質(zhì)量；nH,質(zhì)子數(shù)；A,信號(hào)積分面積；CF,校正因子；Sample(S),待測(cè)分析物；Std,內(nèi)標(biāo)物。

2.4 校正因子

公式(1)和公式(2)中都有校正因子，校正因子是在NMR波譜儀和測(cè)量條件等因素相互影響的情況下對(duì)樣品定量結(jié)果的校正，如校正水信號(hào)的壓制及弛豫不充分對(duì)定量結(jié)果準(zhǔn)確性的影響等。標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法所得的濃度為橫坐標(biāo)，得線性回歸y=ɑx+β，ɑ即校正因子。

2.5 定量峰和定量區(qū)域選擇

2.5.1 果糖定量峰和定量區(qū)域選擇

果糖在水中可以歸屬出3種構(gòu)型，根據(jù)果糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H位移相關(guān)譜(correlation spectroscopy，COSY)、1H-13C 異核單量子相干(heteronuclear single-quantum coherence，HSQC)、1H-13C異核多健相關(guān)(heteronuclear multiple-bond correlation，HMBC)、J-分辨譜等，果糖主要以β-D-吡喃果糖、α-D-呋喃果糖和β-D-呋喃果糖3種主要構(gòu)型存在。在3種構(gòu)型中，β-D-吡喃果糖含量最高，其次為β-D-呋喃果糖，α-D-呋喃果糖含量最低。δ4.100～4.092為α-D-呋喃果糖 3-H和β-D-呋喃果糖 3-H、4-H，δ4.018～3.993歸屬為β-D-吡喃果糖6-H上一個(gè)質(zhì)子兩重峰與α-D-呋喃果糖4-H 兩個(gè)峰中一個(gè)峰。δ3.984～3.976 歸屬為β-D-吡喃果糖5-H與α-D-呋喃果糖4-H兩個(gè)峰中另一個(gè)峰。這3個(gè)區(qū)間正好包含了果糖3種構(gòu)型中每種構(gòu)型2個(gè)質(zhì)子。而β-D-吡喃果糖6-H上一個(gè)質(zhì)子兩重峰中一個(gè)峰與蔗糖的5′-H上三重峰中一個(gè)峰重疊[1]。由圖1可知，在果汁中δ4.100～4.092的信號(hào)與果汁中其他物質(zhì)信號(hào)沒有重疊，所以可將δ4.100～4.092所包含的質(zhì)子數(shù)定為1，使用校正因子來校正定量的質(zhì)子數(shù)不準(zhǔn)確的因素。

2.5.2 蔗糖定量峰和定量區(qū)域選擇

根據(jù)蔗糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、J-分辨譜等，蔗糖在水中只有一種構(gòu)型[1]，定量峰為δ:5.39(d,J= 3.8 Hz)，定量區(qū)域?yàn)棣?.436～5.349，包含的質(zhì)子數(shù)為1；也可以選δ4.20(d,J= 8.7 Hz)處峰作為定量峰，定量區(qū)域?yàn)棣?.250～4.159，包含的質(zhì)子數(shù)為1。由圖1可知定量峰為δ5.39(d,J=3.8 Hz)和δ4.20(d,J=8.7 Hz)處的定量峰均不與果汁中其他的信號(hào)重疊。

2.5.3 葡萄糖定量峰和定量區(qū)域選擇

根據(jù)葡萄糖的1H NMR、13C NMR及二維譜1H-1H COSY、1H-13C HSQC、1H-13C HMBC、J-分辨譜等，葡萄糖在水中有2種結(jié)構(gòu)[1]，ɑ-D-吡喃葡萄糖和β-D-吡喃葡萄糖。ɑ-D-吡喃葡萄糖定量峰為δ5.23 (d，J=3.7 Hz)，定量區(qū)域?yàn)棣?.260～5.0204，包含的質(zhì)子數(shù)為1；β-D-吡喃葡萄糖定量峰為δ4.64(d，J=8.0 Hz)，包含的質(zhì)子數(shù)為1，定量區(qū)域?yàn)棣?.677～4.609；δ5.260～5.0204和δ4.677～4.609的積分面積之和可作為葡萄糖的積分面積，由圖1可知此兩處的定量區(qū)域與果汁中其他信號(hào)不重疊。

圖1 果汁的核磁共振氫譜圖Fig.1 1H NMR spectra of juice

2.6 方法學(xué)考察結(jié)果

2.6.1 線性考察

以標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量與溶液體積之比為縱坐標(biāo)，測(cè)定濃度為橫坐標(biāo)做線性回歸。葡萄糖、果糖和蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品在0.025～6.40 g/L質(zhì)量濃度內(nèi)作線性回歸圖。

檸檬酸作為定量外標(biāo)，果糖回歸方程為y=1.665 6x-0.118 5，R2=1；蔗糖定量峰為δ5.40時(shí)，回歸方程為y=1.152 1x-0.089 2，R2=1；蔗糖定量峰為δ4.20時(shí)，回歸方程為y=1.015 4x-0.077 3，R2=1；葡萄糖回歸方程為y=1.114x+0.057 3，R2=0.999 8。結(jié)果表明該方法線性關(guān)系非常好。

鄰苯二甲酸氫鉀作為定量?jī)?nèi)標(biāo)，果糖回歸方程為y=2.027x-0.196 8，R2=0.999 5；蔗糖定量峰為5.39 ppm時(shí)，回歸方程為y=1.492 2x+0.012 6，R2=0.999 9；蔗糖定量峰為4.20 ppm時(shí)，回歸方程為y=1.309 7x-0.011，R2=0.999 9；葡萄糖回歸方程為y=1.411 9x-0.011 8，R2=0.999 7。結(jié)果表明該方法線性關(guān)系非常好。

2.6.2 精密度考察

取其中1個(gè)果汁樣品，平行配制5份，每份用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法分別測(cè)定6次，得到果糖、葡萄糖和蔗糖的測(cè)定結(jié)果，計(jì)算精密度。從表1～表4可見同一份樣品測(cè)實(shí)多次檢測(cè)精密度均非常高，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(relative standard deviation,RSD)均小于1%。因?yàn)闃悠放渲品椒ê?jiǎn)單，所以平行配制樣品間的精密度也非常高，RSD<0.47%。

表1 果糖測(cè)定精密度(n=6)Table 1 Precision of fructose determination method (n=6)

表2 葡萄糖測(cè)定精密度(n=6)Table 2 Precision of glucose determination method (n=6)

表3 蔗糖測(cè)定精密度(n=6，定量峰δ 5.40)Table 3 Precision of sucrose determination method (n=6, quantitative peak δ 5.40)

表4 蔗糖測(cè)定精密度(n=6，定量峰δ 4.20)Table 4 Precision of sucrose determination method (n=6, quantitative peak δ 4.20)

2.6.3 加標(biāo)回收率考察

配制樣品20 份，其中5 份作為對(duì)照組，其余15份由低至高，分別添加11.11、22.22、33.33 g/L 3個(gè)質(zhì)量濃度水平的果糖、葡萄糖、蔗糖，分別采用外標(biāo)法和內(nèi)標(biāo)法對(duì)果糖、葡萄糖、蔗糖定量，計(jì)算回收率，結(jié)果見表5和表6，外標(biāo)法回收率為100.9%～104.7%，內(nèi)標(biāo)法回收率為102.1%～108.6%，均能滿足測(cè)定準(zhǔn)確性要求。

表5 外標(biāo)法加標(biāo)回收率Table 5 Recovery rate of external standard method

表6 內(nèi)標(biāo)法加標(biāo)回收率Table 6 Recovery rate of internal standard method

2.6.4 檢出限和定量限

將果糖、葡萄糖、蔗糖的標(biāo)準(zhǔn)品譜圖信噪比為3時(shí)的濃度作為檢出限，信噪比為10時(shí)的濃度作為定量限[15,24]。在1.3.3及1.4的測(cè)試參數(shù)及數(shù)據(jù)處理?xiàng)l件下，果糖的檢出限為0.005 g/L，定量限為0.018 g/L；葡萄糖的檢出限為0.007 g/L，定量限為0.022 g/L；蔗糖的檢出限為0.009 g/L，定量限為0.031 g/L。GB 5009.8—2016高效液相色譜法果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖和乳糖檢出限為 0.2 g/100g，可見上述已經(jīng)建立的1H NMR定量方法檢測(cè)限要遠(yuǎn)低于國(guó)標(biāo)方法，即靈敏度要遠(yuǎn)高于國(guó)標(biāo)方法。

2.6.5 方法精確性分析

應(yīng)用上述已經(jīng)建立的1H NMR內(nèi)標(biāo)和外標(biāo)定量方法和GB 5009.8—2016高效液相色譜法分別對(duì)市售4種果汁樣品進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)樣品平行前處理2次，重復(fù)測(cè)定2次，結(jié)果取平均值，如表7所示，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析1H NMR法與國(guó)標(biāo)法檢測(cè)結(jié)果的差異。以1H NMR內(nèi)標(biāo)法、1H NMR外標(biāo)法結(jié)果和國(guó)標(biāo)方法比較，求RSD，除個(gè)別的結(jié)果如橙汁1中的果糖、蘋果汁3中的葡萄糖、梨汁3中的蔗糖測(cè)定結(jié)果為5%

表7 核磁共振波譜法與高效液相色譜法對(duì)果汁中主要糖測(cè)定結(jié)果 單位：g/L

3 結(jié)論

本研究建立了一種采用核磁共振技術(shù)對(duì)果汁中果糖、葡萄糖和蔗糖含量進(jìn)行快速準(zhǔn)確定量的方法。果糖的檢出限為0.005 g/L，定量限為0.018 g/L；葡萄糖的檢出限為0.007 g/L，定量限為0.022 g/L；蔗糖的檢出限為0.009 g/L，定量限為0.031 g/L。該方法在0.025～6.40 g/L線性關(guān)系良好(R2>0.999)；外標(biāo)法加標(biāo)回收率為100.9%～104.7%，內(nèi)標(biāo)法加標(biāo)回收率為102.1%～108.6%，同一份樣品測(cè)多次檢測(cè)及平行配制樣品間的精密度均非常高，RSD均小于1%，可見測(cè)定方法重復(fù)性好，GB 5009.8—2016高效液相色譜法測(cè)定結(jié)果誤差在±5%以內(nèi)，滿足方法的可行性驗(yàn)證要求。該方法簡(jiǎn)化了樣品的前處理操作，無需預(yù)先將樣品中待測(cè)物分離便可直接進(jìn)行測(cè)定，極大地縮短了待測(cè)樣品的前處理時(shí)間。在確保重復(fù)性和測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確性的基礎(chǔ)上，該方法極大節(jié)約了時(shí)間與人力，在大批量樣品檢測(cè)時(shí)成本較低，可廣泛應(yīng)用于果汁質(zhì)量控制，同時(shí)為建立果汁核磁共振指紋圖譜真實(shí)性鑒別技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。