HPLC測定復(fù)方氨酚葡鋅片中的有關(guān)物質(zhì)對氨基酚的含量

劉凱雙，閆 研，殷 果，王鐵杰*

（1. 深圳市藥品檢驗研究院，廣東 深圳 518057；2. 深圳藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室，廣東 深圳 518057）

復(fù)方氨酚葡鋅片是由對乙酰氨基酚、葡萄糖酸鋅、鹽酸二氧丙嗪和板藍(lán)根浸膏粉組成的中西藥結(jié)合的復(fù)方制劑，具有解熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘和抗病毒作用[1]。目前國內(nèi)共有3家生產(chǎn)企業(yè)，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為3個國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[2-4]，國內(nèi)外藥典均未收載。經(jīng)查詢《中國藥典》2020年版二部[5]對乙酰氨基酚及其相關(guān)制劑標(biāo)準(zhǔn)，均有對氨基酚的檢查項。本品含有對乙酰氨基酚，但現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)均未對其特征物質(zhì)對氨基酚進(jìn)行控制。查詢文獻(xiàn)[6-8]發(fā)現(xiàn)目前缺少中西藥復(fù)方制劑中西藥有關(guān)物質(zhì)檢測的相關(guān)研究。復(fù)方氨酚葡鋅片為典型的中西藥結(jié)合復(fù)方制劑，由1個中藥浸膏成分和3個西藥成分組成，為了更好控制復(fù)方氨酚葡鋅片質(zhì)量，徹底去除中藥浸膏成分對對氨基酚檢測結(jié)果的干擾，前處理采用乙醇提取、流動相稀釋的方法，檢測采用HPLC檢測對氨基酚。本方法經(jīng)方法學(xué)驗證，回收率、準(zhǔn)確度良好，且專屬性強，靈敏度高，為復(fù)方氨酚葡鋅片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高提供依據(jù)，也為中西藥復(fù)方制劑中有關(guān)物質(zhì)研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ultimate 3000高效液相色譜儀（DAD3000檢測器，德國賽默飛）；XS105DU型電子天平。

1.2 試藥

復(fù)方氨酚葡鋅片（成人規(guī)格處方為對乙酰氨基酚100.0 mg，葡萄糖酸鋅70.0 mg，鹽酸二氧丙嗪1.0 mg，板藍(lán)根浸膏粉250 mg；兒童規(guī)格處方為對乙酰氨基酚30.0 mg，葡萄糖酸鋅21.0 mg，鹽酸二氧丙嗪0.3 mg，板藍(lán)根浸膏粉75 mg，均由河北恒利集團(tuán)制藥股份有限公司提供），原輔料（由河北恒利集團(tuán)制藥股份有限公司提供），對氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100802-201604，含量：100 %），對乙酰氨基酚對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100018-201610，含量：99.9 %）。乙醇、甲醇（色譜純，Merck公司），超純水，醋酸銨為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱為Waters XBridge C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相為0.05 mol/L醋酸銨溶液-甲醇（97:3）；流速1.0 ml/min；檢測波長230 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μl，按外標(biāo)法以峰面積計算。理論板數(shù)按對乙酰氨基酚峰計算應(yīng)不低于5 000，對氨基酚和對乙酰氨基酚峰的分離度應(yīng)符合要求。

2.2 溶液的配制

2.2.1 混合對照品溶液 取對氨基酚對照品10 mg和對乙酰氨基酚對照品25 mg，精密稱定，置入100 ml量瓶，加無水乙醇適量，振搖使對氨基酚和對乙酰氨基酚溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液1 ml，置入5 ml量瓶，加無水乙醇稀釋至刻度，再精密量取上述溶液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動相稀釋制成每1 ml中分別約含對氨基酚2 μg和對乙酰氨基酚5 μg的混合溶液。

2.2.2 供試品溶液 取復(fù)方氨酚葡鋅片20片（兒童規(guī)格30片），精密稱定，研細(xì)，取本品細(xì)粉適量（約相當(dāng)于對乙酰氨基酚100 mg），精密稱定，置入5 ml量瓶，加無水乙醇適量，振搖使對乙酰氨基酚溶解，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。精密量取上述續(xù)濾液1 ml，置入10 ml量瓶，加流動相稀釋制成每1 ml中約含對乙酰氨基酚2 mg的溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 分別按成人規(guī)格和兒童規(guī)格處方和說明書，稱取除對乙酰氨基酚外的其他主藥、輔料和包衣劑，置入5 ml量瓶，按2.2.2項方法，分別配制陰性對照溶液（1）和陰性對照溶液（2）。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性與專屬性試驗 分別精密吸取2.2項下制得的混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各10 μl，按上述方法和色譜條件測定，記錄色譜圖，結(jié)果見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

混合對照品溶液色譜圖中各色譜峰峰形良好，對氨基酚和對乙酰氨基酚之間的分離度為33.39，理論板數(shù)按照對乙酰氨基酚峰計算為19304，均符合要求（圖1，B）。

供試品溶液色譜圖中在與對照品溶液色譜圖中相應(yīng)位置，未檢測出對氨基酚峰，只檢測出對乙酰氨基酚峰。提取方法和檢測方法可完全去除中藥成分板藍(lán)根浸膏峰的干擾，基線較平，對氨基酚峰的保留時間可延長至6 min，不受溶劑峰干擾，且與對乙酰氨基酚峰之間分離度較好（圖1，C～D）。陰性對照溶液（1）和陰性對照溶液（2）在兩種主成分相應(yīng)位置處均無色譜峰出現(xiàn)，表明空白輔料和其他主成分對主峰無干擾（圖1，E～F）。

2.3.2 線性試驗 精密量取對氨基酚對照品的無水乙醇溶液（20 μg/ml）0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 ml，分別置入10 ml量瓶，用流動相稀釋至刻度，搖勻，制成每1 ml含對氨基酚0.8，1.2，1.6，2.0，2.4，2.8 μg的對照品溶液。

分別精密吸取上述各濃度對照品溶液10 μl，注入液相色譜儀，測定峰面積，以對氨基酚濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，得到的線性回歸方程（n=6）為：A=0.5852C+0.0020，r=0.9998。結(jié)果表明，對氨基酚在0.8～2.8 μg/ml濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.3 精密度試驗 精密量取線性試驗項下對氨基酚對照品溶液（2.0 μg/ml）10 μl，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄對氨基酚峰峰面積，對氨基酚峰峰面積RSD為0.87 %（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.3.4 檢測限和定量限 取2.3.2項中2.0 μg/ml的對氨基酚對照品溶液，用流動相逐級稀釋，按上述色譜條件進(jìn)樣10 μl，以信噪比為3:1時測得對氨基酚的最低檢測濃度為0.05 μg/ml，即最低檢測限為0.05 μg；以信噪比為10:1時測得對氨基酚的定量檢測濃度為0.20 μg/ml，即定量限為0.20 μg。

2.3.5 回收率試驗 精密稱取樣品細(xì)粉適量（成人規(guī)格、兒童規(guī)格）（相當(dāng)于對乙酰氨基酚100 mg）共9份，分為3組，分別置入5 ml量瓶，每組加入0.1 mg/ml的對氨基酚對照品溶液0.8，1，1.2 ml（各3份），用無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，過濾。分別精密量取上述溶液各1 ml，置入10 ml量瓶，用流動相稀釋至刻度，分別制得對氨基酚濃度為1.6，2.0，2.4 μg/ml的3組加標(biāo)溶液。取上述加標(biāo)溶液，按2.2項色譜條件測定含量，記錄色譜，計算回收率，結(jié)果見表1～2。

表1 回收率試驗結(jié)果（n=9）（成人規(guī)格）

表2 回收率試驗結(jié)果（n=9）（兒童規(guī)格）

2.3.6 耐用性試驗 取含對氨基酚2.0 μg/ml成人規(guī)格的和兒童規(guī)格的供試品加標(biāo)溶液，另取兩根250 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Kinetex C18、Agilent ZORBAX SBAq C18）和兩根150 mm（4.6 mm×250 mm，5 μm）的色譜柱（Phenomenex Luna C18、Waters SunFire C18），分別精密吸取供試品加標(biāo)溶液和對照品溶液各10 μl按2.2項下色譜條件測定。

在更換色譜柱后，對氨基酚峰的保留時間變化范圍較大，約4.763～7.817 min。在不同色譜柱上，僅對流動相組成比例（分別考察95:5和98:2兩個比例）與柱溫（分別考察25和35 ℃）稍作調(diào)整，對氨基酚峰均可與其他峰分離良好（分離度＞1.5），分離效果、理論板數(shù)均符合要求，表明系統(tǒng)耐用性較好。供試品加標(biāo)溶液色譜圖見圖2～3。

圖2 供試品加標(biāo)溶液色譜圖（成人規(guī)格）

圖3 供試品加標(biāo)溶液色譜圖（兒童規(guī)格）

2.4 樣品含量測定

取成人規(guī)格2批和兒童規(guī)格1批的的復(fù)方氨酚葡鋅片，依法制備供試品溶液。精密量取各溶液10 μl，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計算對氨基酚的含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測定結(jié)果（n=2）

3 討論

3.1 流動相的選擇和干擾峰溯源

本研究分別考察了《中國藥典》2020年版二部[5]對乙酰氨基酚有關(guān)物質(zhì)檢測項及其相關(guān)制劑標(biāo)準(zhǔn)中對氨基酚檢查項下的色譜條件，經(jīng)調(diào)整流動相比例發(fā)現(xiàn)，以0.05 mol/ml醋酸銨溶液-甲醇（97:3）為流動相和溶劑時對氨基酚色譜峰分離較好，對氨基酚峰的出峰時間可延長至6 min（圖4），但對氨基酚峰受其他峰干擾嚴(yán)重，達(dá)不到基線分離，經(jīng)干擾峰溯源發(fā)現(xiàn)，干擾峰均來自復(fù)方氨酚葡鋅片處方成分之一板藍(lán)根浸膏粉（圖5）。

圖4 對氨基酚對照品（A）和供試品溶液（B）色譜圖（以流動相為溶劑）

圖5 板藍(lán)根浸膏溶液色譜圖（以流動相為溶劑）

3.2 檢測波長的選擇

本研究使用紫外分光光度法對對氨基酚對照品溶液在190～600 nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明，對氨基酚在230nm處有較好的吸收，故選擇230 nm作為檢測波長。

3.3 提取溶劑的選擇

復(fù)方氨酚葡鋅片是由1個中藥浸膏成分和3種西藥成分共同組成的復(fù)方制劑，由于中藥成分的復(fù)雜性，且處方中板藍(lán)根浸膏占比較大，對氨基酚是對乙酰氨基酚的特殊雜質(zhì)，含量較低，上述問題給對氨基酚的檢出帶來較大困難。實驗表明，主要干擾來源于板藍(lán)根浸膏（圖5），為了去除板藍(lán)根浸膏的干擾，查詢板藍(lán)根浸膏的制備工藝可知，板藍(lán)根浸膏是采用“水提醇沉（60 %乙醇）”法制備。本研究嘗試用60 %乙醇和無水乙醇作為提取溶劑，結(jié)果表明，以無水乙醇為提取溶劑時，可完全去除板藍(lán)根浸膏的干擾（圖1，C～D）。

3.4 樣品制備方法和進(jìn)樣體積的選擇[9-10]

以無水乙醇作為提取溶劑，可完全去除板藍(lán)根浸膏的干擾，但對氨基酚對照品峰由于溶劑作用，出現(xiàn)肩縫。當(dāng)以流動相作為對氨基酚對照品的溶劑時，對氨基酚峰峰形良好，故采用先用無水乙醇提取以去除其他峰的干擾，再用流動相稀釋的方法制備對照品溶液和供試品溶液。經(jīng)考察，用無水乙醇提取后，再用流動相稀釋時，將對照品溶液和供試品溶液中的乙醇濃度控制在10 %以下，進(jìn)樣量為10 μl時，不僅可以去除供試品中板藍(lán)根浸膏峰的干擾（圖1，C～D），同時也可使對氨基酚峰峰形良好（圖6A，圖7A）。

圖6 不同乙醇終濃度對氨基酚對照品溶液色譜圖（A：10 %，B：20 %）

圖7 不同進(jìn)樣體積對氨基酚對照品溶液色譜圖（A：10 μl，B：20 μl）

4 小結(jié)

綜上所述，本研究建立的復(fù)方氨酚葡鋅片中有關(guān)物質(zhì)對氨基酚的HPLC檢查法，經(jīng)方法學(xué)驗證，本法具有前處理簡便、快捷、方法準(zhǔn)確的特點，且靈敏度高，適用于復(fù)方氨酚葡鋅片中對氨基酚檢測，有利于復(fù)方氨酚葡鋅片的質(zhì)量控制。