何首烏治療雄激素性脫發(fā)的分子機制：基于生物信息學和分子對接方法

陳東宇， 楊曉雨， 王紅心， 樊文龍， 何玉清

1.廣東醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學系，廣東 東莞 523808;2.東莞市寮步醫(yī)院皮膚科，廣東 東莞 523400

2019年國家衛(wèi)生健康委員會數據顯示中國脫發(fā)患者患病率為19.9%，其中男性約1.63億，女性約8 800萬，并且呈現出年輕化趨勢[1]。雄激素性脫發(fā)是臨床上最常見的脫發(fā)類型，特征表現是頭發(fā)密度的彌散性減少和毛囊進行性微型化[2]。脫發(fā)患者?；加行睦斫箲]和社交恐懼癥，尤其是女性和發(fā)病年齡較低的患者，其抑郁或焦慮等精神障礙的發(fā)生率顯著增加[3-4]。非那雄胺和米諾地爾已被美國食品和藥物管理局批準為治療脫發(fā)的主要藥物[5]。然而，在臨床實際使用中并未顯示出令人滿意的結果。此外，富血小板血漿和低能量激光治療效果似乎只是局部和暫時有效，還存在著未能從根本上糾正毛囊微型化以及患者總體滿意度不高等問題[6-7]。

中醫(yī)對于脫發(fā)的認識和診治已有悠久的歷史，因其安全性較高、療效確切和不良反應少等優(yōu)勢，一直被廣泛接受和臨床應用。一項系統(tǒng)檢索中、英、韓三國數據庫對治療脫發(fā)的中藥組合、中草藥的使用頻率和特點的分析研究表明，在使用的312種內用中草藥中，以何首烏的使用次數最多[8]。在國家藥品監(jiān)督管理局公布的國產中藥育發(fā)類化妝品中，中藥涉及154種，其中何首烏的使用頻次(257次)僅次于側柏葉[9]。何首烏為蓼科植物何首烏的塊根，因具有烏發(fā)、鎮(zhèn)靜、滋養(yǎng)血液、增強肌肉和骨骼、滋補肝腎的功效而倍受關注[10]。動物實驗表明何首烏可以抑制5α還原酶活性，其抑制作用隨著用量增加而增強[11]。何首烏的毛發(fā)生長促進作用很可能是通過介導成纖維細胞生長因子7、音猬因子(sonic hedgehog，Shh)、胰島素樣生長因子、肝細胞生長因子和β-連環(huán)蛋白(β-catenin)等因子的表達來實現。局部應用何首烏可通過上調β-catenin和Shh表達，使毛囊數量、大小增加，誘導毛囊的生長期促進毛發(fā)生長[12-13]。何首烏作為最常用于治療脫發(fā)的中草藥，其促發(fā)作用的研究還只停留在動物實驗階段，關于其在雄激素性脫發(fā)發(fā)生發(fā)展中作用機制的研究很少。因此，本研究利用生物信息學、網絡藥理學和分子對接等手段，鑒定何首烏中與雄激素性脫發(fā)作用相關的有效成分，并探討生發(fā)過程的關鍵靶點。

1 資料與方法

1.1 有效成分-靶點互作網絡的構建

通過中醫(yī)藥分子機制生物信息學數據庫(BATMAN-TCM，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)得到何首烏有效成分及對應的作用靶基因(分數閾值≥20)。同時在GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)、GeneCards數據庫(https://www.genecards.org/)、OMIM數據庫(https://omim.org/)、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)和TTD數據庫(http://db.idrblab.net/ttd/)檢索雄激素性脫發(fā)相關基因。檢索詞為“androgenetic alopecia”。然后將有效成分對應的靶基因與疾病相關基因取交集，用獲得的交集基因構建何首烏有效成分-靶點互作網絡。

1.2 蛋白互作網絡及其核心子網絡的篩選

將交集基因導入STRING在線數據庫，設定最低相互作用閾值為0.900(最高置信度)并去除游離蛋白，并通過Cytoscape 3.8.2中的CytoNCA工具計算節(jié)點度中心性(degree centrality，DC)、中介中心性(betweenness centrality，BC)、接近中心性(closeness centrality，CC)、特征向量中心性(eigenvector centrality，EC)、基于局部平均連接度方法(local average connectivity-based method，LAC)和網絡中心性(network centrality，NC)等網絡的拓撲學參數；以大于等于上述各參數中位值為標準依次進行過濾。使用過濾后的基因構建次級子網絡，再次進行過濾以獲取最終的核心子網絡。此外，我們利用CytoHubba插件基于最大團中心性(MCC)分析該核心子網絡，選取連接度最高的前10個基因進行后續(xù)分子對接分析。

1.3 富集分析

利用R軟件中的clusterprofile包對核心子網絡中的基因進行基因本體論(GO)和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路分析。通過CytoscapeMCODE算法對核心子網絡進行蛋白質緊密度識別和模塊劃分并進行功能富集，分析每個模塊顯著的富集項。

1.4 分子對接分析

對核心子網絡中最重要的10個基因進行分子對接分析。在Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)中搜索所選基因編碼的受體蛋白，以及在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/pdb/)中下載蛋白質的3D結構。從PubChem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下載分子配體的2D結構。ChemBio 3D軟件用于通過最小化能量來計算和輸出3D結構。采用PyMOL 2.5軟件對受體蛋白進行脫水，采用AutoDock Tools軟件進行蛋白質的氫化。受體蛋白對接位點的參數設置為包括小分子配體結合的活性口袋位點。最后，Autodock Vina用于將受體蛋白與小分子配體對接。將結合能<-9 kcal/mol的對接結果進行可視化。

2 結果

2.1 有效成分和潛在靶點的篩選

使用BATMAN-TCM數據庫，得到何首烏的7個關鍵有效成分：扁蓄苷、大黃酚、奎硫醇、大黃素甲醚、單甲醚、大黃酸和大黃素。共獲得16 452個藥物靶基因。此外，分別從Genecards、OMIM、TTD和DrugBank數據庫中獲得了1 103、11、14和11個與雄激素性脫發(fā)相關的基因。對從GEO檢索到的GSE84839數據集進行標準化，按照|Log2FoldChange|≥2和校正后P值<0.05的條件篩選，共得到884個差異表達基因，并繪制熱圖(圖1A)和火山圖(圖1B)進行可視化。去除重復并對上述數據庫取并集，總共獲得1 969個疾病基因(圖1C)。最后，將藥物靶基因和疾病相關基因取交集，最終獲得1 357個共同靶基因(圖1D)。

圖1 何首烏有效成分和疾病潛在靶點的篩選 1A：GSE84839熱圖；1B：GSE84839火山圖；1C：通過結合來自5個數據庫的所有結果來識別雄激素性脫發(fā)的相關基因；1D：藥物靶基因和疾病相關基因的交集Figure 1 Screening of effective ingredients of polygonum multiflorum and underlying disease targets. 1A: Heat map of GSE84839 dataset; 1B: Volcano plot of GSE84839 dataset; 1C: Venn plot of disease targets among Genecards, OMIM, TTD, DrugBank and GSE84839 dataset; 1D: Venn plot of effective ingredients of polygonum multiflorum and underlying disease targets of androgenic alopecia.

2.2 蛋白互作網絡及其核心子網絡的篩選

將共同的靶點基因提交到STRING平臺，按照設定參數生成蛋白互作網絡。將結果導入到Cytoscape獲得初級蛋白互作網絡；經CytoNCA插件計算其拓撲學參數并第一次過濾得到一個包括294個節(jié)點和5 810條邊的次級子網絡，其BC、CC、DC、EC、LAC和NC的中位值分別為281.91743515、0.024403565、11、0.008760369、5.6和7；經再次過濾得到一個包括67個節(jié)點和1 761條邊的核心子網絡，其BC、CC、DC、EC、LAC和NC的中位值分別為114.47539055、0.453560372、25、0.03552299、11.68825911和13.888418445。利用CytoHubba插件得到連接度最高的10個基因：SOS1、PIK3CA、PIK3R1、HRAS、PIK3CB、KRAS、NRAS、LCK、RHOA和EGFR(圖2)。

圖2 基于MCC篩選核心子網絡連接度最高的前10個基因Figure 2 Screening the top 10 genes with the highest connectivity of core sub-network based on MCC.

2.3 富集分析

對得到的核心子網絡進行功能富集分析，其中GO分析共富集到2 209條具有統(tǒng)計學意義的條目(圖3A),例如:蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的正調控、MAP激酶活性的調節(jié)、MAP激酶活性的正調控、細胞粘附的正調控和細胞間粘附的調節(jié)等。KEGG富集得到160條具有統(tǒng)計學意義的條目，可視化與雄激素性脫發(fā)致病過程最相關的16條結果(圖3B)：趨化因子信號通路、PI3K-Akt信號通路、JAK-STAT信號通路、Ras信號通路、FoxO信號通路、血管內皮生長因子信號通路、細胞衰老、MAPK信號通路、雌激素信號通路、細胞凋亡、壽命調節(jié)途徑、自噬-動物、NF-kappaB信號通路、TGF-β信號通路、細胞周期和Wnt信號通路。將MCODE算法運用到核心子網絡中，共得到3個MCODE網絡。其中，MCODE1共包含31個基因，與藥物的肝毒性有關；MCODE21共包含12個基因，與細胞凋亡有關；MCODE31共包含17個基因，與炎癥有關。

2.4 分子對接

將核心子網絡中連接度最高的10個基因與何首烏7個有效成分進行分子對接，分別得到兩兩間的分子對接結合自由能。其中EGFR和KRAS不完全與7個有效成分都有交互作用，故排除在外。有效成分與蛋白靶標兩兩對接的結合能見表1。其中PIK3CA-大黃素、PIK3CA-大黃酚、PIK3CA-扁蓄苷和PIK3CB-大黃素結合能均<-9 kcal/mol(圖4A～4D)。

圖4 何首烏主要有效成分與核心基因的分子對接 4A：PIK3CA-大黃素；4B：PIK3CA-大黃酚；4C：PIK3CA-扁蓄苷；4D：PIK3CB-大黃素Figure 4 Molecular docking of effective ingredients of polygonum multiflorum and core sub-network. 4A: PIK3CA-Emodin; 4B：PIK3CA-Chrysophanol; 4C: PIK3CA-Guaijaverin; 4D: PIK3CB-Emodin.

表1 何首烏有效成分與蛋白靶標的結合能 (kcal/mol)Table 1 The binding energy between effective ingredients of polygonum multiflorum and protein targets (kcal/mol)

3 討論

本研究發(fā)現，何首烏主要通過調節(jié)炎癥反應、細胞凋亡、氧化應激、自噬等通路發(fā)揮生物學功能。文獻報道何首烏具有清除DPPH自由基的能力，并通過調控炎癥反應、氧化應激和凋亡等多種信號通路來發(fā)揮抗氧化、抗衰老、抗炎等功效的[16-17]，本研究結果與此一致。進一步對蛋白互作網絡中靶基因基于MCC模式分析得到相互作用關系最強的10個核心目標靶標，并進行分子對接以驗證它們和何首烏有效成分之間的相互作用?；衔锱c受體所形成的構象能量越低，結構越穩(wěn)定，結合活性較高。一般認為當結合能<0，表明配體分子均能和受體蛋白自發(fā)結合，結合能<-5.0 kcal/mol時，表明結合性好，結合能越低，對接結果越佳[18]。本研究發(fā)現何首烏中的大黃素與PIK3CA、PIK3CB的結合能最低，均低于-9 kcal/mol。推測何首烏主要通過其有效成分大黃素作用于PIK3CA、PIK3CB來發(fā)揮功能，與其他研究結果相一致[16,19]。

圖3 核心子網絡基因的GO、KEGG富集分析 3A：GO富集結果；3B：KEGG富集結果
Figure 3 The GO and KEGG enrichment analysis of core sub-network. 3A: GO enrichment analysis; 3B: KEGG pathway enrichment analysis.

何首烏中分離出的蒽醌衍生物大黃素是一種天然化合物，存在于許多植物的根和根莖中。2015年版《中國藥典》證實制何首烏總游離蒽醌的主要有效成分為大黃素和大黃素甲醚，而大黃素的含量最多[20]。PI3K/Akt通路已被證實與調控細胞增殖、凋亡和存活的代謝途徑等生物學活動密切相關[21]。參與RAS、MAPK和PI3K/Akt信號通路的PIK3CA和PIK3CB在原發(fā)性肝癌頻繁突變和普遍過表達[22]。雖然PIK3有許多下游靶點，但Akt是PIK3調節(jié)影響細胞存活的細胞成分的主要介體[23]。據報道，大黃素通過Akt磷酸化抑制PI3K/Akt信號通路，避免細胞過度增殖和凋亡[24]。因此，大黃素誘導的自噬對細胞凋亡有保護作用。自噬通常被認為是一種通過消除受損的細胞器維持哺乳動物細胞健康的抗凋亡過程。

Bcl-2家族蛋白作為線粒體膜外膜完整性的調節(jié)器，在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用，而促凋亡成員如Baxs則破壞這一功能[25]。大黃素通過ERK-1/2信號通路上調Bcl-2和GLT-1表達，以及下調Cleaved-cas3、Baxs、Cyt-c、AIF和Smac的表達抑制細胞凋亡和活性氧的產生來延緩皮膚衰老[26]。此外，大黃素通過MAPK、PI3K/Akt和NIK-IKK通路發(fā)揮NF-κB的抑制作用，抑制促炎介質TNF-α、IL-6、MPO、丙二醛、CINC-1、MIP-2和ICAM-1釋放[27]。據報道，何首烏主要通過MAPK、CAMP/PKA、PI3K/Akt以及Wnt信號通路誘導黑色素生成、酪氨酸酶活性和黑色素生成基因的表達，起到烏發(fā)的作用[28]。

毛囊周圍H2O2的積聚激活ERK導致黑素細胞數量減少。大黃素通過增加SIRT1和FOXO1等蛋白的表達來抑制ERK的激活，并通過激活MITF轉錄因子增加酪氨酸相關蛋白TRP-1、TRP-2和酪氨酸酶的表達，從而促進黑色素的合成[29]。2,3,5,4-四羥基二苯乙烯-2-O--D-葡萄糖苷(THSG)是何首烏特有的成分，也是目前研究較多的成分。THSG通過調節(jié)PI3K/Akt和Bcl-2/ Caspase-3信號通路，促進細胞存活，抑制細胞凋亡[30]。另外，THSG還可以激活Akt/mTOR通路部分修復微血管內皮功能障礙，維持血管的正常功能[31]。

藥物流行病學研究發(fā)現，每年的特異性藥物性肝損傷發(fā)病率為23.80/10萬，何首烏是我國藥物性肝損傷的主要病因之一[32]。與此前報道一致，大黃素和大黃酸是何首烏肝毒性的主要成分，其毒性具有濃度依賴性和時間依賴性[33]。肝損傷表現為血漿ALT、AST活性升高，肝組織匯管區(qū)大量炎性細胞浸潤和肝細胞凋亡增多[34]。其機制可能與大黃素誘導caspase3依賴途徑和線粒體介導的促進細胞凋亡有關。何首烏引起的肝損傷只發(fā)生在少數服用該藥的個體中，與個體對藥物的易感性相關。提示臨床應高度重視何首烏使用的安全性。

綜上，本研究基于藥理學網絡研究，探討何首烏在雄激素性脫發(fā)中的潛在治療機制，結果表明，何首烏主要通過大黃素在抑制細胞凋亡、改善炎癥反應、減弱氧化應激和生成黑色素等方面發(fā)揮主要的作用。此外，本研究還提供了雄激素性脫發(fā)治療的幾個潛在靶點，可能有助于解釋其發(fā)病機制和為臨床治療提供新的策略。