菊苣酸對內(nèi)毒素誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用及機制研究

王 齊，劉梅梅，黃焱平，楊 珺

(安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，安徽 合肥 230601)

CA是一種水溶性酚酸類化合物，是咖啡酸和酒石酸的衍生物，存在于紫錐菊、菊苣、蒲公英等天然植物中。菊苣酸是一種有效的抗氧化藥物，能通過降低脂質(zhì)過氧化物以及細(xì)胞內(nèi)活性氧的積聚、清除自由基，發(fā)揮抗氧化損傷及心血管保護(hù)的藥理作用[1]。ALI的特征是彌漫性肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮損傷引起的肺水腫和肺擴張，表現(xiàn)為呼吸窘迫和難治性低氧血癥[2]。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種嚴(yán)重的ALI形式，可迅速發(fā)展為多器官衰竭，患者預(yù)后差[3]。雖然在ALI期間激素對炎癥反應(yīng)表現(xiàn)出顯著的抑制作用，但激素藥物在臨床使用中會導(dǎo)致不可預(yù)見的不良副作用。近年來臨床和實驗研究已經(jīng)證明，肺毛細(xì)血管屏障損傷后引發(fā)肺水腫加重是ALI/ARDS最重要的病理特征[4-5]。相關(guān)研究表明，菊苣酸可通過抑制淀粉樣蛋白積聚以及淀粉樣蛋白前體蛋白和神經(jīng)元分泌酶1水平的增加，來抑制脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的記憶障礙和神經(jīng)元丟失[6-7]。然而，CA對肺水腫的潛在影響及主要機制尚未有充分研究。因此，本文旨在闡明CA對大鼠模型中LPS引起的ALI和肺水腫的影響和相關(guān)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和藥品雄性SD大鼠90只，體重(180～200) g,(6±1)周，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。飼養(yǎng)期間將動物安置在(24±1)℃、相對濕度為(50±1)%、光/暗周期為12 h的環(huán)境條件中。動物喂食標(biāo)準(zhǔn)谷物飼料，自由飲用自來水，飼養(yǎng)1周。菊苣酸由成都瑞芬思生物科技有限公司提供，純度>98%。徠卡熒光顯微鏡，德國Leica公司。722N分光光度儀，江蘇天睿精密科學(xué)儀器公司。超薄切片機，美國RMC。醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)BI2000，成都泰盟科技有限公司。電泳儀1704150，美國伯樂。LSRFortessa流式細(xì)胞分析儀，美國BD公司。

1.2 分組、造模和給藥將90只雄性SD大鼠隨機分為6組：假手術(shù)組、CA組、LPS組、低劑量CA組、中劑量CA組、高劑量CA組，每組15只。假手術(shù)組灌胃給予生理鹽水(5 mL/kg)1 h后，腹腔注射生理鹽水;CA組將CA(40 mg/kg)溶解于生理鹽水灌胃1 h后，腹腔注射生理鹽水;LPS組灌胃給予生理鹽水(5 mL/kg)1 h后，腹腔內(nèi)注射LPS(10 mg/kg);低劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(10 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg) ;中劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(20 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg);高劑量CA組給予溶解于生理鹽水CA(40 mg/kg)灌胃1 h后，腹腔注射LPS(10 mg/kg);LPS注射6 h后，腹腔注射2%的青藤巴比妥(60 mg/kg)麻醉大鼠。

1.3 HE染色和免疫組織化學(xué)檢測

1.3.1 HE染色 LPS給藥6 h后，麻醉安樂死大鼠取右肺中葉，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h，進(jìn)行石蠟切片(5 μm)。在二甲苯和乙醇梯度分離后，在室溫下用蘇木精染色5 min，伊紅染色15 s。在光學(xué)顯微鏡物鏡(×10)下觀察肺組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.3.2 髓過氧化物酶(MPO)免疫組化染色 麻醉安樂死大鼠取右肺中葉，4%多聚甲醛4 ℃固定48 h，進(jìn)行石蠟切片(5 μm)。切片用梯度酒精脫水，二甲苯透明后在0.01 M檸檬酸緩沖液(pH 6.0)中微波爐加熱修復(fù)抗原，并在室溫下過氧化氫(0.3%)封閉30 min。滴加兔MPO多克隆一抗(1∶200;Abcam)在4 ℃孵育過夜。然后將切片與生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(HRP)在室溫下孵育30 min，并使用DAB底物試劑盒觀察顯色情況。在光學(xué)顯微鏡物鏡下(×20)觀察肺組織樣本中MPO陽性細(xì)胞的位置和表達(dá)水平。

1.4 測定肺干濕重比注射LPS 6 h后，麻醉安樂死大鼠，取右上葉肺組織各100 mg，稱重。在80 ℃的真空烘箱中干燥48 h，再次稱重肺組織。計算烘干前后肺重量的比值。

1.5 肺血管通透性檢測大鼠腹腔注射LPS 6 h后，注射2%的青藤巴比妥(60 mg/kg)麻醉大鼠，再將2%伊文思藍(lán)(EB)溶液(30 mg/ kg)從大鼠頸內(nèi)靜脈注入。30 min后，通過右心室用生理鹽水灌注，直到心臟驟停，沖洗肺組織中的血管內(nèi)EB，收集每只大鼠的部分左下葉肺組織，稱重并放于離心管中。將100 mg左下葉肺組織加入1 mL甲酰胺，放置在37 ℃的水浴中24 h，在室溫下離心30 min，然后提取上清液。用620 nm波長的分光光度計測量上清液的吸光度值。采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法計算每個樣品的EB含量。肺微血管通透性以EB含量與濕肺重之比表示。

1.6 支氣管肺泡灌洗液(BALF)的收集和分析腹腔注射LPS后6 h，麻醉大鼠，氣管內(nèi)插入塑料套管，無菌生理鹽水抽吸收集BALF，共3次。BALF樣品在4 ℃下離心10 min，提取上清液。采用BCA法檢測BALF樣品中的總蛋白濃度。在室溫下用Wright-Giemsa染色1 min，使用細(xì)胞計數(shù)評估細(xì)胞總數(shù)，并在物鏡(×4)下觀察。

1.7 Western blot分析腹腔注射LPS后6 h，麻醉安樂死大鼠，取右肺上葉組織，采用一步RIPA法從大鼠肺組織中提取總蛋白后采用BCA法測定蛋白含量。經(jīng)過8%SDS-PAGE電泳(每組100 mg蛋白質(zhì))分離后，將蛋白質(zhì)樣品轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5%脫脂牛奶在室溫下密封1 h。使用的主要抗體和濃度如下：ZO-1(1∶1000，Thermo Fisher Scientific公司)，Occludin(1∶500，Thermo Fisher Scientific公司)、JAM-1(1∶1000，Santa Cruz Biotechnology公司)和GAPDH(1∶5000，Cell Signaling Technology公司)。所有一抗在4 ℃下孵育過夜。以GAPDH為內(nèi)參。Western blot條帶的平均光密度采用Quantity One圖像分析軟件測定，計算目標(biāo)帶的平均光密度與GAPDH的平均光密度的比值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析計量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。使用SPSS 15.0進(jìn)行ANOVA方差分析和Tukey檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CA抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI和肺部炎癥HE染色結(jié)果顯示，在假手術(shù)組和CA組中，大鼠肺結(jié)構(gòu)顯示肺泡腔完全透明，肺泡間隔內(nèi)無水腫或炎癥細(xì)胞浸潤。而LPS組肺間質(zhì)組織明顯水腫增厚(圖1 A，箭頭)，并伴有肺泡萎縮。CA預(yù)處理防止了LPS誘導(dǎo)的ALI和對肺泡結(jié)構(gòu)的損傷(圖1 A和B)。免疫組化檢測顯示與假手術(shù)組和CA組相比，注射LPS后大鼠肺組織中MPO陽性細(xì)胞染色明顯增加。與LPS組相比，CA預(yù)處理組的MPO陽性染色較弱(圖1 C和D)。這表明CA阻止了LPS誘導(dǎo)的白細(xì)胞浸潤和大鼠肺組織損傷。

圖1 CA對LPS注射后急性肺組織損傷及肺組織MPO表達(dá)水平的影響注：A：各組大鼠肺組織HE染色圖像(標(biāo)尺，200 μm)，箭頭表示間質(zhì)水腫和增厚(×40);B：各組大鼠肺組織MPO免疫組化圖像(×40)(標(biāo)尺，200 μm);C：肺損傷量化評分;D：各組肺組織中MPO陽性細(xì)胞的統(tǒng)計分析;與假手術(shù)組比較，*P<0.05;與LPS模型組比較，#P<0.05

2.2 CA防止LPS誘導(dǎo)的肺微血管通透性和肺水腫與假手術(shù)組相比，大鼠腹腔注射LPS6 h后肺組織濕干重比顯著增高，表明肺組織水腫顯著增加。LPS組與假手術(shù)組相比，肺組織EB外滲和BALF蛋白含量也顯著升高，提示LPS破壞了肺血管和肺泡上皮屏障的完整性。此外注射LPS后BALF的總細(xì)胞數(shù)量也顯著增加。與LPS組相比，中劑量CA組和高劑量CA組的肺濕/干重比、EB外滲、BALF蛋白濃度和BALF總細(xì)胞數(shù)均顯著降低(表1)。這些數(shù)據(jù)表明，CA預(yù)處理可有效抑制LPS誘導(dǎo)的肺水腫，并增加肺微血管通透性。

表1 CA對脂多糖誘導(dǎo)的肺微血管通透性和肺組織水腫的影響

2.3 CA抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織緊密連接蛋白的下調(diào)Western blotting結(jié)果表明，LPS誘導(dǎo)后大鼠肺組織中緊密連接蛋白ZO-1、Occludin和JAM-1的表達(dá)水平顯著降低(圖2和表2)。在CA 20 mg/kg和40 mg/kg劑量組中，肺組織緊密連接蛋白表達(dá)量顯著高于LPS組。這說明CA對LPS引起的肺緊密連接蛋白表達(dá)的降低有一定的抑制作用。

圖2 Western blotting檢測大鼠肺組織ZO-1、Occludin和JAM-1的定量分析圖

表2 大鼠肺組織中ZO-1、Occludin和JAM-1的定量分析

3 討論

最近的研究表明，肺微血管屏障損傷和由此引起的肺水腫是早期ALI的主要病理特征，是治療ALI/ARDS的關(guān)鍵靶點[8-9]。研究顯示脂多糖作為革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的主要成分是引起肺損傷的常見原因，因此在實驗研究中被廣泛用于建立ALI動物模型[10]。LPS通過與白細(xì)胞Toll樣受體4結(jié)合激活NF-κB，誘導(dǎo)多種炎癥因子的表達(dá)，包括TNF-α、IL-1β和IL-6，導(dǎo)致細(xì)胞旁連接的破壞[11]。因此粘附在血管壁上的白細(xì)胞通過釋放蛋白酶和過氧化物破壞微血管，使肺微血管通透性增加并引起肺水腫，最終導(dǎo)致肺順應(yīng)性降低和肺功能受損。

本研究表明，CA預(yù)處理可以阻止LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI，使MPO的表達(dá)水平降低，細(xì)胞因子的產(chǎn)生下降，下調(diào)LPS炎癥肺組織中粘附分子的表達(dá)。本研究表明了CA可以抑制LPS誘導(dǎo)的炎性細(xì)胞的浸潤并降低MPO表達(dá)的上調(diào)。LPS除了通過白細(xì)胞過度活化間接損害血管外，還直接損害微血管屏障功能，導(dǎo)致微血管通透性增加和肺水腫[12]。本研究結(jié)果顯示，與LPS組相比，CA預(yù)處理組的肺組織濕干重比、BALF蛋白含量和EB外滲率均明顯下降，說明CA可以抑制LPS誘導(dǎo)的肺微血管的通透性以及肺水腫。微血管屏障主要由微血管內(nèi)皮細(xì)胞之間的緊密和粘附連接調(diào)節(jié)。緊密連接蛋白包括Claudin，Occludin和JAM通過與細(xì)胞質(zhì)中的ZO家族蛋白連接，在穩(wěn)定細(xì)胞間緊密相互作用中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。CA不僅可以穩(wěn)定肺微血管緊密連接蛋白Occludin的表達(dá)，還可以增加JAM-1和ZO-1蛋白的表達(dá)水平。CA通過增加連接蛋白的表達(dá)水平來影響肺組織中的微血管屏障，防止LPS誘導(dǎo)的肺微血管通透性增高和肺組織水腫。

綜上所述，CA對LPS誘導(dǎo)的大鼠ALI具有保護(hù)作用并與減少肺組織微血管屏障的破壞有密切關(guān)系。