不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果色色素的比例和組織定位

屈用函，袁恩平，張雪廷，王紹祥，王 燦，趙水靈，李 罡，顧 凡，張洪玲，趙昶靈，李桂瓊，陳杞臨

（1文山壯族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境資源研究所，云南文山 663000；2文山壯族苗族自治州農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，云南文山 663000；3云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，昆明 650201）

0 引言

目前，云南省文山州主栽的辣椒(Capsicum annuum)品種是有370余年種植史的丘北辣椒系列；辣椒已成為文山州繼三七(Panax notoginseng)后的第二大生物產(chǎn)業(yè)[1]?！淖辖?號’是文山州大面積種植的、葉、花和果均具觀賞性的丘北辣椒紫色品種的典型代表[2]?！淖辖?號’葉片近軸面為紫綠，遠(yuǎn)軸面的葉脈、葉柄及花瓣頂端的2/3和邊緣為紫色，莖淡紫，花瓣基部白色，具縱向紫色條紋；果實(shí)果尖向上，在果實(shí)剛形成時(shí)，果尖為紫色，其余部分為綠色，果實(shí)在生長過程中從尖端向中部、基部由綠變紫，青熟時(shí)呈濃郁、亮麗的紫色，老熟時(shí)呈紅色，即在發(fā)育過程中，果色表現(xiàn)綠紫→淡紫→濃紫→紅的規(guī)律性變化?？梢?，‘文紫椒1號’葉、莖、花和果可形成以紫為主要色相，清新淡雅，能表達(dá)神秘、冷靜和浪漫等情感的紫色審美客體[3]，極具觀賞價(jià)值。

研究表明，辣椒果色取決于其果皮中色素的組合和組織定位。果實(shí)的綠色源于葉綠素(chlorophyll，Chl)，紫色源于屬于黃酮類(flavonoid，F(xiàn)la)的花色苷(anthocyanin，AN)，且最主要的AN為花翠素3-反式香豆酰蘆丁糖苷-5-葡萄糖苷，花翠苷分子中B環(huán)上的鄰位三羥基結(jié)構(gòu)決定了果實(shí)的紫色，花翠素C3位上反式香豆酰基通過分子內(nèi)共色效應(yīng)賦予該花翠苷在細(xì)胞中擁有足夠的穩(wěn)定性，F(xiàn)la多為淡黃、黃色，而橙紅色則源于類胡蘿卜素(carotenoid，Car)類，主要為辣椒紅素(capsanthin，Cap)等[4-6]。

但是，不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實(shí)呈色的色素組合和組織定位迄今未見報(bào)道。筆者探究‘文紫椒1號’紫色果實(shí)在不同發(fā)育階段的Chl、Fla、AN和Car的含量配比及果皮中色素的組織定位[5]，旨在為丘北辣椒在觀賞園藝中的應(yīng)用和觀賞型新奇果色新品種的選育提供參考[7]。

1 材料與方法

1.1 大田試驗(yàn)和材料的采集與預(yù)處理

2019年4月26日，在文山州硯山縣江那鎮(zhèn)子馬社區(qū)（104°21'28″E，23°35'12″N，平均海拔1541.90 m）完成‘文紫椒1號’苗的壟作式移栽，壟的長、寬和高分別為10 m、1 m和10 cm，株行距為45 cm×50 cm，壟上覆蓋銀灰色塑料農(nóng)膜；7月15日和8月2日，分別隨機(jī)采集開花結(jié)果期、健康的植株12株，將其假植于塑料桶中，加土和水適量。在室內(nèi)，據(jù)果長并結(jié)合老熟期紅色果色將果實(shí)分為5個(gè)發(fā)育階段，即長0.0～1.5、1.5～3.0、3.0～4.5、4.5～6.0 cm及老熟的紅色果實(shí)；將果實(shí)隨機(jī)分為2批，一批在冰上縱剖為兩半，剔取果皮，加液氮研磨成粉，凍存于-80℃?zhèn)溆糜谏睾康臋z測，另一批在果實(shí)縱向中部進(jìn)行徒手橫切、鏡檢色素的組織定位。

1.2 果實(shí)色素含量配比的測定

1.2.1 色素含量的測定

（1）Chl和Car含量。果實(shí)的Chl含量([Chl])和Car含量([Car])用比色法測定，參考文獻(xiàn)[8]操作并略作修改。取果皮粉1.0000 g，加5～7 mL 80% CH3COCH3快速研磨成勻漿，濾入預(yù)先以鋁箔包裹的25 mL容量瓶，用80% CH3COCH3沖洗濾渣、定容，用“T6新世紀(jì)”紫外-可見分光光度計(jì)（北京普析通用有限責(zé)任公司）檢測濾液的A663.0、A646.0和A470.0，以鮮重(fresh weight，F(xiàn)W)計(jì)算果實(shí)的[Chl]和[Car]。

（2）總黃酮類含量。果實(shí)的總黃酮類含量(total flavonoid content，TFC)用 AlCl3比色法測定[9]，以蘆丁(rutin,Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)為標(biāo)樣[10]；取果皮粉0.5000 g，加25 mL 60% C2H5OH[11]，在85℃水浴加熱2 h；取出冷卻，過濾、定容至50 mL；取5 mL濾液，加1 mL 10% NaNO2；5 min后，加1 mL 10% AlCl3·6H2O；10 min后，加8.0 mL 10% NaOH；靜置15 min后測反應(yīng)液的A510.0；TFC 用標(biāo)準(zhǔn)曲線方程 Y=0.8268X+0.0068[R2=0.9996，Y為A510.0，X為蘆丁濃度(μg/mL)]計(jì)算，表示為“mg rutin equivalent(RE)/(g·FW)”。

（3）總花色苷含量。果實(shí)的總花色苷含量(total anthocyanin content，TAC)以色價(jià)度量[12-13]；取果皮粉0.5000 g，加含1% HCl(v/v)的CH3OH 30 mL研磨成勻漿，濾入以鋁箔包裹的50 mL容量瓶，定容，計(jì)算如式(1)[14]。

式中，A539.0和A657.0分別表示在539.0 nm和657.0 nm處的吸光值。

（4）Cap含量。果實(shí)的Cap含量([Cap])參照《食品添加劑辣椒紅》(GB 10783—2008)以及文獻(xiàn)[15]和[16]測定。取果皮粉1.0000 g，加CH3COCH3（含0.1%2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚）約20 mL研磨成勻漿，定容至100 mL。果實(shí)[Cap]表示為

1.2.2 色素含量配比的計(jì)算 果實(shí)的色素含量配比，即[Chla]/[Chlb]、[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC、[Chl(a+b)]/TAC、[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]，均據(jù)各色素的含量計(jì)算。

1.3 果實(shí)色素組織定位的檢測

果實(shí)色素的組織定位用Zeiss蔡司Primo Star（北京汗盟紫星儀器儀表有限公司）基于徒手切片檢測，鏡檢果實(shí)縱向中部橫切片，據(jù)色相（綠、紫和橙紅）和色度判斷色素的定位和積累量[17-18]。

1.4 數(shù)據(jù)分析

生物學(xué)重復(fù)和含量檢測均重復(fù)2次；雙因素相關(guān)分析用SPSS 20.0完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實(shí)的色素組合特征

2.1.1 [Chla]/[Chlb]特征在階段3，‘文紫椒1號’果實(shí)的[Chla]/[Chlb]最大，約為3.137，分別比階段1、2、4、5的[Chla]/[Chlb]約高18.83%、20.12%、0.34%、168.79%，而且，階段1的[Chla]/[Chlb]接近階段2的，階段3的[Chla]/[Chlb]又接近階段4的（圖1）。可見，從階段1到3時(shí)，果實(shí)的藍(lán)綠色加深，到階段4時(shí)，藍(lán)綠色仍較穩(wěn)定，從階段4到5（即老熟期）時(shí)，[Chla]/[Chlb]降至最低，果實(shí)由藍(lán)綠轉(zhuǎn)向黃綠（圖2A）；但是，果實(shí)在階段1到4時(shí)的藍(lán)綠均被AN的紫色掩蓋，階段5的黃綠則被Car的紅色掩蓋。

圖1 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的葉綠素a/b和[葉綠素(a+b)]/[類胡蘿卜素]

2.1.2 [Chl(a+b)]/[Car]特征在階段2，‘文紫椒1號’果實(shí)的[Chl(a+b)]/[Car]最大，約為3.992，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/[Car]約高11.63%、3.54%、19.41%、11607.62%（圖1）?？梢?，果實(shí)在階段2和5時(shí)分別最綠、最紅（圖1，圖2A、B、E），但綠色被AN的紫色掩蓋。

2.1.3 [Chl(a+b)]/TFC特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實(shí)的[Chl(a+b)]/TFC的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Car]的相似（圖1、3）；階段2的[Chl(a+b)]/TFC也最大，約為0.011，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TFC約高9.28%、2.91%、9.28%、381.82%（圖3）?？梢?，在階段1～4時(shí)，F(xiàn)la導(dǎo)致的（淡）黃色的變幅較小，且（淡）黃色被Chl的綠色和AN的紫色掩蓋，而在階段5時(shí)，（淡）黃色則貢獻(xiàn)于果實(shí)的老熟果色（圖2C）。

圖2 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的色素含量

圖3 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的[葉綠素]/[總黃酮類]

2.1.4 [Chl(a+b)]/TAC特征在階段2，‘文紫椒1號’果實(shí)的[Chl(a+b)]/TAC最大，約為0.290，分別比階段1、3、4、5的[Chl(a+b)]/TAC約高 5.87% 、36.36%、141.51%、402.25%（圖4）。可見，在階段1和2時(shí)，果實(shí)因AN合成和積累較少而表現(xiàn)紫綠和綠變紫；從階段3到4時(shí)，果實(shí)因AN合成和積累量不斷增加而表現(xiàn)為紫色越來越濃；在階段5時(shí)，Chl和AN均迅速降解，不再貢獻(xiàn)于老熟期的果色（圖2A、D）。

2.1.5 [Chl(a+b)]/[Cap]特征在階段1，‘文紫椒1號’果實(shí)的[Chl(a+b)]/[Cap]最大，約為0.521，分別比階段2、3、4、5 的 [Chl(a+b)]/[Cap]約 高 38.84% 、32.22% 、256.71%、10316.00%（圖4）。可見，在階段4時(shí)，果實(shí)Cap合成量開始明顯增加，但Cap的紅色被Chl的綠色和AN的紫色掩蓋；在階段5時(shí)，Cap合成量最大，同時(shí)Chl和AN大量、迅速降解，果實(shí)主要展示Cap的紅色（圖2A、E，圖4）。

圖4 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的[總?cè)~綠素]/[總花色苷]和[葉綠素]/[辣椒紅素]

2.1.6 TFC/TAC特征從階段1到4，‘文紫椒1號’果實(shí)的TFC/TAC持續(xù)下降至最低值，即從約28.20下降至約12.34；從階段4到5，TFC/TAC重新上升至約接近階段2時(shí)的水平（圖5）?？梢?，在階段3至4時(shí)，果實(shí)Fla主要為AN而導(dǎo)致果實(shí)的紫色在階段4最濃，而階段5時(shí)TFC/TAC的上揚(yáng)應(yīng)與老熟期果實(shí)中AN的大量、快速降解有關(guān)；在整個(gè)發(fā)育過程中，F(xiàn)la主要充當(dāng)AN的共色素而穩(wěn)定AN的紫色[19]（圖2C、D，圖5）。

2.1.7 TFC/[Cap]特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實(shí)的TFC/[Cap]的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Cap]的相似（圖4～5）。在階段1，果實(shí)的TFC/[Cap]最高，約為53.57，分別比階段2、3、4、5的TFC/[Cap]約高51.10%、40.26%、257.43%、2246.42%（圖5）?？梢?，在階段1至4時(shí)，果實(shí)TFC/[Cap]維持在較高水平，但呈現(xiàn)下降趨勢，在階段5時(shí)，Cap合成量劇增，故TFC/[Cap]驟降至最低（圖2C、E，圖5）。

圖5 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的[總黃酮類]/[總花色苷]和[總黃酮類]/[辣椒紅素]

2.1.8 TAC/[Cap]特征在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果實(shí)的TAC/[Cap]的變化趨勢與[Chl(a+b)]/[Cap]和TFC/[Cap]的相似（圖4～6）。在階段1，果實(shí)的TAC/[Cap]最高，約為1.90，分別比階段2、3、4、5的TAC/[Cap]約高47.04%、2.65%、56.35%、2085.73%（圖6）?？梢?，在階段1至4時(shí)，果實(shí)TAC/[Cap]波動式維持在較高水平，在階段5時(shí)，Cap合成量加劇，導(dǎo)致TFC/[Cap]驟降至最低（圖2E，圖6）。

圖6 ‘文紫椒1號’果實(shí)在不同發(fā)育階段的[總花色苷]/[辣椒紅素]

2.2 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實(shí)色素的組織定位特征

‘文紫椒1號’果實(shí)果皮橫切面上細(xì)胞群的呈色模式表明，果色相關(guān)色素主要定位在中果皮細(xì)胞中；在果實(shí)發(fā)育中，果皮細(xì)胞群的色相和色度變化趨勢與果色的高度一致（圖7）。在階段1，綠色的Chl和較少的紫色AN主要集中于中果皮細(xì)胞中；階段2～4，紫色的AN在中果皮、外果皮細(xì)胞中的積累量增加，AN同時(shí)向內(nèi)果皮擴(kuò)展，將Chl的綠色完全掩蓋，該現(xiàn)象與積累AN的綠色葉片的呈色恰好相反[20]，到階段4時(shí)，外、中和內(nèi)果皮成片呈紫褐色；在階段5時(shí)，外、中和內(nèi)果皮中紫色的AN和綠色的Chl快速消失，果皮顯示Car的橙紅色[21]（圖7）。

圖7 不同發(fā)育階段‘文紫椒1號’果實(shí)果皮中色素的組織定位和積累量

2.3 ‘文紫椒1號’果實(shí)在發(fā)育過程中[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相關(guān)性特征

Pearson相關(guān)系數(shù)（表1）表明，在發(fā)育過程中，‘文紫椒1號’果色色素含量之間呈不同的相關(guān)性。其中，[Chla]與[Chlb]之間、[Chla]與[Chl(a+b)]之間、[Chlb]與[Chl(a+b)]之間以及[Car]與[Cap]之間均呈極顯著正相關(guān)；[Chla]與TFC、TAC之間，[Chlb]與TAC之間，[Chl(a+b)]與TAC之間，[Car]與TFC之間以及TFC與TAC、[Cap]之間均呈不顯著正相關(guān)；[Chlb]與[Car]之間呈極顯著負(fù)相關(guān)；[Chla]與[Car]、[Cap]之間，[Chlb]與[Cap]之間以及[Chl(a+b)]與[Car]、[Cap]之間均呈顯著負(fù)相關(guān)；[Chlb]與TFC之間、[Chl(a+b)]與TFC之間、[Car]與TAC之間以及TAC與[Cap]之間均呈不顯著負(fù)相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

作為丘北辣椒紫色品種的典型代表，‘文紫椒1號’的果色在果實(shí)發(fā)育過程中呈現(xiàn)由綠變紫，最終由紫快速變紅，極具觀賞價(jià)值的規(guī)律性變化[2]，但該品種果色色素的組合和組織定位特征迄今未見報(bào)道。通過將‘文紫椒1號’果實(shí)的發(fā)育過程分為5個(gè)階段，本研究發(fā)現(xiàn)，在‘文紫椒1號’果實(shí)發(fā)育中，果實(shí)[Chla]/[Chlb]的最大值出現(xiàn)在發(fā)育階段3，[Chl(a+b)]/[Car]、[Chl(a+b)]/TFC和[Chl(a+b)]/TAC的均出現(xiàn)在階段2，而[Chl(a+b)]/[Cap]、TFC/TAC、TFC/[Cap]和TAC/[Cap]的均出現(xiàn)在階段1（圖1）；[Chla]、[Chlb]、[Chl(a+b)]、[Car]、TFC、TAC和[Cap]的相關(guān)性不盡一致，其中，TAC與[Chl(a+b)]、TFC之間均呈不顯著正相關(guān)，而與[Car]之間呈不顯著負(fù)相關(guān)，[Cap]則與[Chl(a+b)]、[Car]、TFC和TAC之間分別呈顯著負(fù)相關(guān)、極顯著正相關(guān)、不顯著正相關(guān)和不顯著負(fù)相關(guān)（表1），這與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的結(jié)果不完全一致，意味著‘文紫椒1號’果色隨果實(shí)發(fā)育階段的變化在色素組合層面具備特殊性；同時(shí)，果色色素主要定位在中果皮細(xì)胞中，在果實(shí)發(fā)育中，果皮細(xì)胞的色相和色度變化趨勢與果色的高度一致（圖7）。所以，‘文紫椒1號’的果色源于果皮細(xì)胞Chl、Car（含Cap）和Fla（含AN）色素的發(fā)育階段差異性組合。但是，本研究暫未探究‘文紫椒1號’果實(shí)Chl、Fla、AN、Car和Cap合成、降解相關(guān)的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因種類及其果實(shí)發(fā)育階段依賴性表達(dá)模式，所以，挖掘這些結(jié)構(gòu)基因和以轉(zhuǎn)錄因子基因?yàn)榇淼恼{(diào)節(jié)基因，澄清其在果實(shí)發(fā)育過程中的表達(dá)動態(tài)和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，將有望在基因?qū)用婷鞔_果色色素代謝對‘文紫椒1號’等丘北辣椒果色的決定及其對辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)形成的效應(yīng)[22]。

表1 ‘文紫椒1號’果實(shí)在發(fā)育過程中各色素含量間的Pearson相關(guān)系數(shù)

近年來，丘北辣椒已成為云南文山州的經(jīng)濟(jì)支柱產(chǎn)業(yè)之一[23]，在全州乃至全省經(jīng)濟(jì)發(fā)展、鄉(xiāng)村脫貧致富和振興方面發(fā)揮著重要作用，但是，丘北辣椒長期以來主要作為蔬菜類經(jīng)濟(jì)作物創(chuàng)造效益。事實(shí)上，300余年來，器官顏色的豐富變化一直是丘北辣椒地方特色的重要內(nèi)涵和表現(xiàn)之一[24]。目前，丘北辣椒觀賞價(jià)值的開發(fā)與利用已見端倪。以‘文紫椒1號’為代表的丘北辣椒紫色品種極具觀賞性的屬性有望從觀賞園藝作物開發(fā)的角度為丘北辣椒產(chǎn)業(yè)鏈的延伸和經(jīng)濟(jì)效益的提升打開一個(gè)新的視角。具體而言，‘文紫椒1號’紫色的葉、莖、花和果，尤其是變化的果色，可構(gòu)建成清新淡雅、神秘浪漫的審美客體，同時(shí)具備觀葉、觀花和觀果價(jià)值[3]，可用于室內(nèi)和庭院擺放以及公園綠化、花壇、花境和現(xiàn)代農(nóng)業(yè)觀光園等的布置[7,25]?？梢?，以紫果為代表的表型可實(shí)現(xiàn)丘北辣椒從傳統(tǒng)、單純的蔬菜用經(jīng)濟(jì)作物向觀賞型經(jīng)濟(jì)作物的轉(zhuǎn)型，從而拓展、提升丘北辣椒的社會、經(jīng)濟(jì)價(jià)值。