HLA-DR聯(lián)合AMH評(píng)估年輕不孕婦女卵巢功能的臨床價(jià)值

李紅寧，王美美，趙旭，劉亞靜，馬春明，崔淑英，王哲

不孕癥是指育齡夫婦有正常性生活且同居1年以上，在沒(méi)有避孕的情況下未能懷孕的疾病。近年來(lái)受全球氣候環(huán)境和工業(yè)化發(fā)展等影響，不孕癥在育齡期女性中的發(fā)病率也隨之增加，且有低齡化趨勢(shì)[1]。據(jù)調(diào)查資料顯示，不孕癥在我國(guó)的發(fā)病率約為10%，目前仍處于上升趨勢(shì)[2-3]。卵巢儲(chǔ)備功能是指女性的卵巢皮質(zhì)區(qū)存在卵泡生長(zhǎng)發(fā)育和受精的能力，可反映女性的生殖能力。育齡婦女的不孕與卵巢儲(chǔ)備功能下降有關(guān)，既往研究發(fā)現(xiàn)，年齡、促卵泡生成激素(follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH)、雌二醇(estradiol，E2)、促黃體生成激素(luteinizing hormone，LH)、竇卵泡數(shù)(antral follicle count，AFC)等指標(biāo)均可反映女性的卵巢儲(chǔ)備功能，但敏感性不高，且隨著女性月經(jīng)周期而變化，對(duì)于女性卵巢功能的診斷并不理想[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞DR抗原(human leukocyte antigen-DR，HLA-DR)在卵巢組織細(xì)胞中異常表達(dá)，是判斷女性不孕的有效指標(biāo)之一[7]；抗繆勒管激素(anti-mullerian hormone，AMH)因其檢測(cè)方便、預(yù)測(cè)時(shí)間早也成為診斷女性卵巢功能的重要指標(biāo)[8]。本研究旨在通過(guò)應(yīng)用HLA-DR和AMH聯(lián)合診斷，探究其在預(yù)測(cè)和評(píng)估年輕不孕婦女卵巢功能的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年9月至2020年8月在保定市第一中醫(yī)院就診的年輕不孕女性患者110例作為研究對(duì)象，納入標(biāo)準(zhǔn)為：① 月經(jīng)周期規(guī)律，性激素水平正常；② 既往無(wú)子宮、卵巢等婦科手術(shù)史；③ 最近3個(gè)月內(nèi)未服用過(guò)避孕藥和性激素等藥物；④ 患者及家屬對(duì)本研究方案均知情同意；⑤ 年齡20～35歲，且不孕時(shí)間超過(guò)1年。排除標(biāo)準(zhǔn)：① 合并心腦血管疾病、免疫性疾病或因化療、手術(shù)導(dǎo)致的卵巢衰竭等；② 有卵巢早衰或多囊卵巢等疾?。虎?合并有心、肝、腎等嚴(yán)重疾??；④ 患者為原發(fā)性不孕或因子宮器質(zhì)性因素、輸卵管因素等導(dǎo)致的不孕。參考人民衛(wèi)生出版社《婦產(chǎn)科學(xué)》第八版中卵巢儲(chǔ)備功能低下的診斷標(biāo)準(zhǔn)：基礎(chǔ)FSH水平>10 U/L；基礎(chǔ)卵泡刺激素/黃體生成素>3；早卵泡期FSH正常，而基礎(chǔ)E2值>60～80 pg/mL。將所有研究對(duì)象分為卵巢儲(chǔ)備功能低下組(觀察組)48例和卵巢儲(chǔ)備功能正常組(對(duì)照組)62例。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)審查同意，所有入選研究對(duì)象均知情并簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 內(nèi)分泌激素檢測(cè) 所有患者在入院時(shí)填寫(xiě)姓名、編號(hào)、年齡等一般資料，月經(jīng)周期第3天空腹抽取肘靜脈血5 mL，用低速離心機(jī)(中科中佳，KDC-1044)4 000 r/min離心15 min，取上清液，采用全自動(dòng)免疫分析儀(貝克曼庫(kù)爾特UniCel Dxl 800)檢測(cè)血清中FSH、LH、E2和AMH水平。所有操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)操作規(guī)程進(jìn)行。

1.2.2 HLA-DR水平檢測(cè) 所有研究對(duì)象月經(jīng)周期第3天空腹抽取肘靜脈血5 mL，用肝素鈉抗凝，離心分離出淋巴細(xì)胞，制成淋巴細(xì)胞懸液用于細(xì)胞濃度的測(cè)定。采用免疫雙熒光染色方法，通過(guò)BD流式細(xì)胞儀(Accuri C6，美國(guó))測(cè)定外周血中T淋巴細(xì)胞(CD3+)中HLA-DR的表達(dá)。使用CellQuest軟件計(jì)算目標(biāo)細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)量的百分比。

1.2.3 免疫細(xì)胞水平測(cè)定 抽取所有研究對(duì)象靜脈血5 mL，4 000 r/min的速度分離5 min后取上清細(xì)胞，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3+、CD4+和CD8+中的T細(xì)胞亞群占總細(xì)胞的比例，并計(jì)算CD4+/CD8+的比值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較

兩組年齡、體質(zhì)量指數(shù)、初潮年齡、孕次等一般資料比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)下頁(yè)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組激素水平比較

觀察組FSH、LH水平明顯高于對(duì)照組，E2、AMH水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)下頁(yè)表2。

表2 兩組激素水平比較

2.3 兩組免疫細(xì)胞和HLA-DR水平比較

觀察組外周血中CD3+和CD8+細(xì)胞、HLA-DR的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，CD4+和CD4+/CD8+水平明顯低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見(jiàn)表3。

表3 兩組免疫細(xì)胞和HLA-DR水平比較

2.4 AMH與HLA-DR聯(lián)合診斷效能分析

以AMH與HLA-DR的水平為自變量，進(jìn)行Logistic 回歸分析并建立ROC曲線，評(píng)估AMH與HLA-DR的診斷價(jià)值。結(jié)果顯示，聯(lián)合診斷不孕女性卵巢功能低下的靈敏度最高(89.58%)，明顯高于AMH和HLA-DR單獨(dú)檢測(cè)(75.00%和70.83%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聯(lián)合診斷在靈敏度較高的同時(shí)，還有著良好的準(zhǔn)確度(78.18%)和約登指數(shù)(0.589)。詳見(jiàn)表4。AMH與HLA-DR單獨(dú)診斷以及聯(lián)合檢診斷女性卵巢功能的ROC曲線，見(jiàn)圖1。

表4 AMH與HLA-DR聯(lián)合診斷效能分析[% (例)]

圖1 ROC曲線分析

3 討論

據(jù)相關(guān)資料顯示，全球不孕癥人數(shù)約為6 000～8 000萬(wàn)，而我國(guó)不孕癥的發(fā)病率高達(dá)10%左右。不孕癥的病因復(fù)雜，只有明確不孕患者的具體病因，才能提供更為有效的解決辦法。環(huán)境污染、推遲生育年齡、生殖系統(tǒng)疾病、心理壓力大等因素都可能導(dǎo)致不孕發(fā)病率增加，目前我國(guó)不孕癥發(fā)病率仍呈持續(xù)上升的趨勢(shì)，嚴(yán)重影響夫妻間的關(guān)系和家庭生活的穩(wěn)定，也成為年輕育齡夫婦首要解決的問(wèn)題[9-11]。卵巢儲(chǔ)備功能是指卵泡在卵巢皮質(zhì)區(qū)生長(zhǎng)、發(fā)育并形成可受精的卵母細(xì)胞的能力，是由卵巢內(nèi)卵泡的質(zhì)量和數(shù)量決定的，可反映女性的生育能力，臨床上評(píng)估卵巢功能的指標(biāo)只能在女性卵巢儲(chǔ)備功能下降而出現(xiàn)臨床表現(xiàn)時(shí)才能檢測(cè)出，以致錯(cuò)過(guò)女性治療不孕的最佳時(shí)期[12-14]。由于女性的生殖細(xì)胞不能再生，若卵巢儲(chǔ)備出現(xiàn)耗竭將不可逆轉(zhuǎn)，因此對(duì)于不孕女性，尤其是未生育的年輕女性，準(zhǔn)確評(píng)估卵巢功能顯得尤為重要。目前對(duì)于卵巢儲(chǔ)備功能的評(píng)估，有年齡、激素水平、AFC等指標(biāo)，但這些指標(biāo)對(duì)評(píng)價(jià)卵巢功能也有一定的局限性，如單獨(dú)采用年齡估測(cè)年輕婦女的生殖潛力時(shí)，準(zhǔn)確性較差；對(duì)于激素水平檢測(cè)要在女性月經(jīng)周期的第2～4天進(jìn)行，且需要排除卵巢囊腫的影響；超聲測(cè)量AFC也受到特定時(shí)間、盆腔顯影及受試者情況等影響，診斷效果欠佳。有文獻(xiàn)推薦AMH和HLA-DR可作為檢測(cè)女性卵巢儲(chǔ)備功能的指標(biāo)，可更早期反映女性卵巢的儲(chǔ)備功能，了解不孕婦女的生殖潛能，對(duì)于提高女性不孕的診斷準(zhǔn)確率，減少漏診率極為重要[6，15]。

研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SH、LH和E2也能間接反映卵巢的儲(chǔ)備功能，當(dāng)卵巢儲(chǔ)備功能降低時(shí)，基礎(chǔ)FSH、LH水平上升，E2水平下降[16]，本研究結(jié)果顯示，觀察組的FSH、LH水平高于對(duì)照組，E2水平低于對(duì)照組，提示激素水平的變化參與女性的不孕進(jìn)程。然而基礎(chǔ)激素水平會(huì)受到多種因素的影響，預(yù)測(cè)價(jià)值較低。AMH是由竇前卵泡、小竇卵泡顆粒細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，是檢測(cè)卵巢功能較為新型的指標(biāo)之一[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，AMH的表達(dá)水平會(huì)隨著女性年齡增長(zhǎng)而升高，在女性青春期時(shí)濃度可達(dá)到高峰，此后一直保持較高的水平狀態(tài)，且不受女性月經(jīng)周期影響，AMH的濃度越高表明卵巢內(nèi)卵子數(shù)量越多，女性的生育能力越強(qiáng)。然而隨著女性年齡增長(zhǎng)及其他因素，顆粒細(xì)胞的功能將發(fā)生減退，AMH的表達(dá)水平開(kāi)始出現(xiàn)下降趨勢(shì)，直到女性出現(xiàn)絕經(jīng)后將無(wú)法被檢測(cè)出[17]。因此，AMH可用于評(píng)估女性的卵巢儲(chǔ)備功能，與年齡、FSH、卵泡數(shù)量等因素也有一定的聯(lián)系，具有較好的特異性和敏感性。但隨著近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AMH也受到如吸煙、腫瘤、口服避孕藥等多種因素的干擾，存在一定的波動(dòng)性，影響診斷效能。

目前發(fā)現(xiàn)部分女性不孕癥與患者自身免疫異常有關(guān)，卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡是其發(fā)病的主要原因[18]。在不孕女性患者卵泡細(xì)胞膜上存在漿細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，并伴有淋巴細(xì)胞群的變化：CD3+、CD8+細(xì)胞水平升高，CD4+和CD4+/CD8+水平下降。隨著患者卵泡逐漸增大、成熟，卵泡顆粒細(xì)胞受到主要組織相容性抗原-Ⅱ(major histocompatibility complex，MHC-Ⅱ)的不斷浸潤(rùn)和破壞，顆粒細(xì)胞逐漸減少。伴隨著CD8+等淋巴細(xì)胞的分化誘發(fā)機(jī)體免疫反應(yīng)，使卵泡顆粒細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致卵巢儲(chǔ)備能力下降[18]。HLA-DR是MHC-Ⅱ類分子的產(chǎn)物，主要表達(dá)在單核細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞等，可呈遞抗原肽，在啟動(dòng)機(jī)體免疫應(yīng)答過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用[19]，因此患者外周血中T細(xì)胞亞群各水平的變化可反映患者體內(nèi)存在T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答。相關(guān)研究證實(shí)，免疫相關(guān)細(xì)胞的表達(dá)水平可通過(guò)參與免疫反應(yīng)影響HLA-DR的水平變化[20]。本研究結(jié)果顯示，觀察組外周血中CD4+和CD4+/CD8+水平明顯低于對(duì)照組，說(shuō)明不孕癥患者體內(nèi)發(fā)生T細(xì)胞誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。研究證實(shí)在卵巢功能不全患者卵巢組織中的HLA-DR表達(dá)明顯增高，而在正常卵巢組織中呈陰性表達(dá)[21]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，觀察組患者與對(duì)照組在HLA-DR水平上有較大差異，這提示血清HLA-DR可參與女性不孕的致病過(guò)程，激活人體中輔助T淋巴細(xì)胞識(shí)別自身抗原，誘發(fā)自身免疫反應(yīng)。然而某些患者血清中針對(duì)HLA-DR抗原的污染物結(jié)合，可導(dǎo)致假陽(yáng)性，極易增加女性不孕患者的漏診率和誤診率[22]。

既往研究證實(shí)，采用多項(xiàng)血清標(biāo)記物聯(lián)合檢測(cè)有利于提高疾病診斷效能，故本文探討采用AMH與HLA-DR聯(lián)合檢測(cè)對(duì)女性卵巢能力的診斷效能。研究結(jié)果顯示，經(jīng)AMH與HLA-DR聯(lián)合診斷條件下評(píng)估卵巢儲(chǔ)備功能的靈敏度最高(89.58%)，明顯高于AMH和HLA-DR單獨(dú)檢測(cè)(75.00%和70.83%)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。聯(lián)合診斷在特異度較高的同時(shí)，還有著良好的約登指數(shù)(0.589)，且準(zhǔn)確度(78.18%)最高；聯(lián)合檢測(cè)ROC曲線下面積為0.839，顯著高于AMH與HLA-DR單獨(dú)檢測(cè)及系列聯(lián)合檢測(cè)(0.767、0.720)，推測(cè)將AMH與HLA-DR聯(lián)用對(duì)女性卵巢功能進(jìn)行更全面評(píng)估，更有利于提高診斷效能，可以更準(zhǔn)確地指導(dǎo)年輕女性不孕患者的最佳治療時(shí)間。但本研究也存在一些局限性，例如對(duì)不孕患者其他病理性原因的相關(guān)因素未納入分析；本研究的病例數(shù)較少，依靠簡(jiǎn)單的分組數(shù)據(jù)不能完全可靠，可能導(dǎo)致結(jié)果發(fā)生一定的偏差。因此，還需要對(duì)年輕不孕女性患者進(jìn)行樣本數(shù)量的擴(kuò)大，并考察其他相關(guān)影響因素，對(duì)患者發(fā)生不孕的原因作進(jìn)一步研究。

綜上所述，HLA-DR及AMH聯(lián)合可提高對(duì)年輕不孕女性卵巢功能的評(píng)估診斷效能，對(duì)制定個(gè)體化方案具有重要的參考價(jià)值。