DNA甲基化與哺乳動物生殖的研究進(jìn)展

劉晶瑩，陳秀娟，戴柏，張雪妍

DNA甲基化是歷史最為久遠(yuǎn)且研究最為深入的表觀遺傳修飾之一，與基因調(diào)控的關(guān)聯(lián)緊密?？稍贒NA序列不進(jìn)行變動的條件下改變遺傳基因的表達(dá)，對染色體的表觀遺傳調(diào)控起關(guān)鍵作用。2014年，以湯富酬、喬杰為核心的專家組第一次對人類早期胚胎發(fā)育中的DNA甲基化展開探索，研究發(fā)現(xiàn)基因組整體的去甲基化在2-細(xì)胞階段已經(jīng)基本實現(xiàn)[1]，甲基化除了在轉(zhuǎn)座子沉默(transposon silencing)、基因組印記、X染色體活性喪失中起作用，還參與早期胚胎發(fā)生、干細(xì)胞分化、神經(jīng)元發(fā)育調(diào)控和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等多個細(xì)胞過程[2]。早期胚胎生長發(fā)育時期均會經(jīng)歷去甲基化和重新甲基化，而幾乎全部哺乳動物發(fā)育階段的甲基化過程都被去除，隨后在子代重新構(gòu)建。更深層次地探求在早期胚胎生長發(fā)育時期的作用機制和功能特性，對人類及其相關(guān)疾病的研究有重要價值。本文綜述了近年來DNA甲基化修飾在哺乳動物生殖發(fā)育過程中的研究進(jìn)展，以期為該領(lǐng)域的研究提供有價值的參考。

1 DNA甲基化和去甲基化

1.1 DNA甲基化

DNA甲基化指借助DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT)的引導(dǎo)，將一個甲基轉(zhuǎn)移到胞嘧啶的5′C中，導(dǎo)致5′胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)?′甲基胞嘧啶的過程。DNMTs活性的增加可以使DNA發(fā)生異常甲基化并引起染色體的不穩(wěn)定。當(dāng)前，我們在哺乳動物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶家族有6種，包括：DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b、DNMT3c以及DNMT3L。

人體內(nèi)的DNMT1數(shù)量最多，在研究人類胚胎干細(xì)胞后我們發(fā)現(xiàn)敲除DNMT1后，多能性基因POU5F1、CD24等的表達(dá)下降且NODAL信號通路相關(guān)的基因NODAL、CER1、LEFTY1/2的表達(dá)被激活[3]。說明DNMT1參與胚胎干細(xì)胞分化。

DNMT2無法實現(xiàn)DNA甲基化的RNA轉(zhuǎn)移酶，其能夠?qū)е绿於彼醫(yī)RNA反轉(zhuǎn)錄環(huán)中的胞嘧啶38位甲基化，關(guān)鍵在于其影響天冬氨酸的tRNA甲基化，在生殖器官、肌肉組織和內(nèi)臟器官的胚胎期中表現(xiàn)的水平較高[4]。去除了DNMT2的小鼠，仍然擁有正常的生殖功能，且甲基化形式和基因組無異常，然而卻失去了RNA甲基化酶的活性[5]。

DNMT3家族(甲基轉(zhuǎn)移酶3a、甲基轉(zhuǎn)移酶3b、甲基轉(zhuǎn)移酶3c和甲基轉(zhuǎn)移酶3L)，主要起加快新的甲基化位點產(chǎn)生變化的作用，將該過程定義為從頭甲基化[6]。在胚胎早期發(fā)育過程中，后代胚胎著床階段的DNA甲基化模式主要依靠DNMT3a和DNMT3b來建立，之后的發(fā)育中靠DNMT1維持。即使DNMT3a和DNMT3b在作用上相近，但兩者的表達(dá)形式區(qū)別很大。前者的表達(dá)范圍更大，而后者唯有在睪丸、骨髓及甲狀腺內(nèi)擁有高的表達(dá)水平。如單一敲除DNMT3a或DNMT3b，兩者造成胚胎的致死時間不同，暗示了他們在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用的主要時期有別。Yin LJ等[7]的實驗結(jié)果顯示，當(dāng)胚胎中DNA的維持甲基化被限制，會降低胚胎著床率及升高胎兒死亡的概率。近幾年的探索將DNMT3c歸于從頭甲基轉(zhuǎn)移酶，能夠防止雄性生殖細(xì)胞被轉(zhuǎn)座子干擾，維持生殖功能。從DNMT3L角度來看，其既缺乏主要的DNMT序列，同時也沒有獲得DNMT酶活性，卻能夠擔(dān)任從頭甲基化中DNMT3a和DNMT3b的控制因子。在去除了DNMT3L的幸存小鼠中，雄性會失去生殖能力；在雌性后代中，敲除該基因的胚胎會由于神經(jīng)管缺陷不能發(fā)育到足月[5]。DNA甲基化得以實現(xiàn)有賴于DNMTs的催化作用，保證了生殖及胚胎發(fā)育過程順利發(fā)生。

1.2 DNA去甲基化

主動和被動去甲基化均屬于DNA去甲基化過程，指的是胞嘧啶取代5-甲基胞嘧啶的反應(yīng)。哺乳動物完成受精后，分別源于精卵的不同母源DNA沒有在同一時刻完成甲基化，父源部分的去甲基化過程快速且覆蓋廣，稱為主動去甲基化，而母源部分在胚胎的生長前期發(fā)生卵裂和DNA復(fù)制的途中逐漸完成去甲基化，該過程屬于依賴型DNA復(fù)制，將其定義為被動去甲基化[5]。主動甲基化指的是借助相關(guān)酶的功效，去除甲基的過程。在哺乳動物配子發(fā)生和胚胎生長前期中，該反應(yīng)始終遍布于基因組區(qū)域[8]。被動去甲基化基本處于S期，其主要功能在于確保DNA復(fù)制途中DNMT的活性喪失，避免新的DNA鏈發(fā)生甲基化[8]。主動甲基化的功能基本由TET(ten-eleven translocation)家族引導(dǎo)，該類蛋白的主要種類有TET1、2和3。該家族能夠?qū)?-甲基胞嘧啶氧化，獲得5-甲?；奏?5 formylcytosine，5-fC)、5-羥甲基胞嘧啶(5-hydroxymethyluracil，5-hmC)和5-羧甲基胞嘧啶(5 carboxylcytosine，5-caC)[9]。

TET1在胚胎生長中首先被激活，這對確保功能多樣的干細(xì)胞干性至關(guān)重要，該蛋白在干細(xì)胞中的表達(dá)水平下降能使該細(xì)胞失去分化與多樣性[10]。胚胎一旦缺乏TET1就無法獲得正常的囊胚，呈現(xiàn)出異常形態(tài)。在四倍體互補實驗過程中，缺少TET1的小鼠胚胎可發(fā)育至足月且能夠生存并繁殖，但后代的幼兒體型偏小[5]。

TET2基本在全部組織中表達(dá)，尤其在造血細(xì)胞和干細(xì)胞中為高表達(dá)，影響造血干細(xì)胞的增殖與分化，如表達(dá)缺失將導(dǎo)致血液細(xì)胞分化受阻，使造血干細(xì)胞室進(jìn)行性增大，最終引起體內(nèi)骨髓增生，如脾臟腫脹、單核細(xì)胞惡性增殖以及髓外造血，均可導(dǎo)致惡性血液腫瘤的出現(xiàn)[11]。

TET3在胚胎發(fā)育早期向神經(jīng)分化時期表達(dá)水平提高[12]，加快了神經(jīng)元發(fā)育。另有研究表明TET3可介導(dǎo)配子基因組的甲基化調(diào)控，并在配子發(fā)育過程中持續(xù)表達(dá)[13]。凡去除TET1或3基因的小鼠胚胎發(fā)育10.5天后對比普通胚胎存在發(fā)育緩慢、細(xì)胞死亡等狀況，無法完成持續(xù)生長[14]，表明兩類蛋白在胚胎前期發(fā)育過程中都發(fā)揮至關(guān)重要的作用。

2 DNA甲基化與生殖

哺乳動物的胚胎發(fā)育時，胚胎早期發(fā)育階段和配子體形成階段分別發(fā)生兩次整體范圍的去甲基化和再甲基化。第一次的重編程始于原始生殖細(xì)胞(primordial germ cells，PGCs)中全局甲基化的消除，并在生殖細(xì)胞發(fā)育的后期建立性別特異性甲基化模式。第二次發(fā)生在受精后，包括從配子中遺傳的大多數(shù)甲基化標(biāo)記的擦除和隨后胚胎甲基化模式的建立[6]。PGCs可以得到雌雄兩性的生殖細(xì)胞，在分化過程中即開始去甲基化，并在一段時間后進(jìn)行重新甲基化，引發(fā)單親系特定印記有關(guān)范圍在內(nèi)的特異性甲基化位點重新組合[15]。在小鼠的PGCs發(fā)育過程中，PGCs分化始于第6.5天，第13.5天甲基化的平均值位于峰谷，此時全基因組的DNA甲基化水平基本為5%[16]。雄性PGCs在13.5天后重構(gòu)甲基化體系，雌性相比于雄性開始時間更晚。待完成再甲基化，雄性PGCs的甲基化程度相比雌性水平更高，最終得到精卵。

2.1 精子發(fā)生與DNA甲基化

精子的誕生過程屬于細(xì)胞嚴(yán)密且復(fù)雜的分化，如成熟分裂、基因重組、精子頂體和鞭毛的出現(xiàn)、染色質(zhì)的重塑和凝集等[17]。精子在完成受精前呈現(xiàn)高度DNA甲基化，然而之后精原核進(jìn)行活躍、積極、迅速、且不依賴DNA復(fù)制去甲基化，使甲基化程度保持較低狀態(tài)直至進(jìn)入桑椹階段[18]。所以，精子甲基化程度的異常變化或許是造成原因不明的早期流產(chǎn)或胚胎生長停滯的關(guān)鍵因素[19]?，F(xiàn)有證據(jù)認(rèn)為,印記基因中DNA甲基化的異常與男性的不育癥關(guān)聯(lián)緊密。H19基因的甲基化不正常能夠干擾精子的產(chǎn)生，引起精子數(shù)量的下降。對比患有少精癥的患者和健康男性精子DNA內(nèi)該基因的甲基化程度后得知，在少精患者中,H19-DMR的CpG島甲基化程度相對較低，而在健康精子的DNA當(dāng)中，未觀測到甲基化水平變化[20],所以該基因可能會成為評估人體精子健康的指標(biāo)[21]。Xu J等[22]對FAM50B和GNAS兩種印記基因的CpG島的調(diào)查結(jié)果表明，患有少精子癥患者的這兩種印記基因甲基化程度相比于健康男性較低，提示GNAS和FAM50B基因的異常甲基化與精子活力低下相關(guān)。Poplinski A等[23]對無法生育患者和健康男性的精子中母源印記基因的甲基化開展調(diào)查，在精子健康率小于5%的患者中,母源印記基因MEST的甲基化水平的平均值為7%，對比對照組的3.5%以及健康形態(tài)大于5%的患者甲基化為6.3%，表現(xiàn)為顯著的高度甲基化，這暗示母源印記基因的高度甲基化能夠引起精子總量、形態(tài)的變化。Botezatu A等[24]調(diào)查得知母源印記基因甲基化水平較低可以導(dǎo)致精子活性降低,進(jìn)而降低生殖能力。深入探討研究男性不育的病因,可以很大程度上幫助篩查、診斷和治療男性不育，有助于提高生育能力。

2.2 卵子發(fā)生及DNA甲基化

卵子產(chǎn)生過程可細(xì)化為：雌性生殖細(xì)胞增殖、分化以及成熟[25]。在卵細(xì)胞產(chǎn)生及胚胎附植前的進(jìn)程中，DNA甲基化在嚴(yán)密控制與發(fā)育有關(guān)基因的激活或抑制，并在快速構(gòu)建雙親印記上發(fā)揮著不可估量的作用。在卵細(xì)胞形成過程中，卵細(xì)胞特異的H3K4去甲基化酶KDM1B在建立一些印記基因的差異甲基化模式時是必不可少的[26]。GV期的卵母細(xì)胞甲基化隨出生時長增加而增大，并于青春期到達(dá)MII卵母細(xì)胞中的峰值。甲基轉(zhuǎn)移酶和MII期的卵母細(xì)胞染色質(zhì)關(guān)系緊密，并在附植前的發(fā)育時期一直儲存于細(xì)胞核內(nèi)[27]。

2.3 早期胚胎中的DNA甲基化

通過研究早期的胚胎發(fā)育得知，人類早期胚胎中甲基化變化與小鼠及其他多種哺乳動物都十分類似。大致符合生殖細(xì)胞的高水平甲基化和胚胎的低水平甲基化，親本的甲基化信息在受精卵中會經(jīng)歷大范圍的消除和重構(gòu)。當(dāng)配子結(jié)合后，雄性原核細(xì)胞中的DNA甲基化會立即顯著降低，而雌性胚胎中的8細(xì)胞期和雄性胚胎中的胚泡期的DNA甲基化會更高[28]。小鼠精子甲基化的均值約80%，卵子則為50%左右，受精結(jié)束的3.5天時的ICM時期甲基化水平最低，約為20%。胚胎從該時期生長至7.5天，在整體區(qū)域內(nèi)進(jìn)行甲基化重構(gòu)，甲基化程度的均值高達(dá)73%[16]。在體外受精過程中，著床之前進(jìn)行甲基化重構(gòu)的時間段會因生物種類的差異而有所不同，小鼠胚胎的甲基化重構(gòu)于囊胚階段開始，豬的該過程在8-細(xì)胞期開展，羊在桑椹胚階段的甲基化程度顯著提高，而牛位于16-細(xì)胞期時甲基化程度逐步提高，人類體外受精胚胎中此過程一般從囊胚期進(jìn)行。在胚胎發(fā)育早期，DNA甲基化整體的水平從1細(xì)胞至16細(xì)胞胚胎呈持續(xù)下降狀態(tài)，而在胚泡階段逐漸開始升高[29-30]。在受精卵中，親本基因組在原核生物中被分隔在不同位置，母體基因組的全局性DNA甲基化程度相比父本更低。兩者以各自方式完成全基因組DNA去甲基化。所以，胚胎在囊胚階段到達(dá)甲基化程度的最低點[31]。

DNMTs家族及TET家族均在胚胎發(fā)育過程中起作用。其中DNMT3家族的功效更為顯著，DNMT3a及DNMT3b在胚胎早期的作用是控制新生甲基化，前者屬于母源存儲并在兩性配子中構(gòu)建不同的甲基化體系[32]，后者伴隨著合子基因組的激活(zygotic gene activation，ZGA)開始轉(zhuǎn)錄，且在囊胚階段完成高度表達(dá)。去除DNMT3b的小鼠大約在9.5天死亡,而去除DNMT3a的小鼠會在出生后28天死亡。兩者聯(lián)合雙敲除的表型后果相比單獨去除更加嚴(yán)重，胚胎會在10.5天死亡。通過RNAi實驗下調(diào)TET基因的表達(dá)發(fā)現(xiàn)[33]：單雌性激活2-細(xì)胞胚胎和受精2-細(xì)胞胚胎DNA 5-caC的產(chǎn)生都受TET蛋白控制,對于前者而言，TET1的效果更明顯,而在體內(nèi)受精胚胎中TET1和TET3的作用更強。表明該基因能夠同時在1-細(xì)胞和2-細(xì)胞胚胎中引導(dǎo)5-caC產(chǎn)生。另外，RNAi研究結(jié)果還表明,TET基因表達(dá)下調(diào)對胚胎發(fā)育的囊胚率有直接作用,提示該蛋白在胚胎發(fā)育時期扮演著至關(guān)重要的角色。

3 展望

DNA甲基化在哺乳動物生殖發(fā)育階段起到不可估量作用，探索生殖階段發(fā)育的變化，表明胚胎生長前期DNA甲基化起到的修飾效果，為研究編程重構(gòu)提供了無可替代的幫助。早期胚胎甲基化的探索也為深入進(jìn)行哺乳動物DNA甲基化研究鋪平了道路。但目前仍有許多機制尚不清楚，DNA甲基化與多能因子如何相互作用，如何調(diào)控分化的，在胚胎各時期有哪些基因位點發(fā)揮作用等問題仍待解決。全面了解表觀遺傳在體內(nèi)的重編程將促進(jìn)體外實驗重編程的發(fā)展，也可能有助于開發(fā)新的治療不孕癥、印記疾病和其他發(fā)育障礙的策略。