復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率、抗氧化功能以及免疫功能的影響

王超普，馬現(xiàn)永，田志梅，余 苗，劉志昌，鄧 盾，容 庭，遆俊嶺，宋 敏，張輝華

（1.佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，佛山 528225；2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華南動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東畜禽肉品質(zhì)量安全控制與評(píng)定工程技術(shù)研究中心，廣州 510640；3.嶺南現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)與技術(shù)廣東省實(shí)驗(yàn)室茂名分中心，茂名 525000；4.廣東廣匯農(nóng)牧有限公司，韶關(guān) 512040）

仔豬在早期斷奶期間由于其消化系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完全，加之?dāng)嗄毯箫嬍?、環(huán)境、生理和心理壓力等因素的影響，容易引起仔豬斷奶應(yīng)激[1]。研究表明，仔豬斷奶應(yīng)激往往引起腸道結(jié)構(gòu)形態(tài)和功能的改變，仔豬機(jī)體免疫能力和抗病力降低，最終導(dǎo)致斷奶仔豬腹瀉、生產(chǎn)性能下降甚至死亡[2-5]。因此，提高斷奶仔豬機(jī)體的抗氧化能力，減少氧化應(yīng)激，促進(jìn)腸道健康，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能是提高斷奶仔豬生產(chǎn)的關(guān)鍵。

自畜禽飼料中禁止添加抗生素后，開發(fā)安全、環(huán)保的綠色飼料添加劑成為畜牧業(yè)發(fā)展的當(dāng)務(wù)之急。中藥因具有毒副作用小、無(wú)殘留、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)受到了人們的廣泛關(guān)注，被越來(lái)越多地應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)[6]。當(dāng)前中藥作為添加劑多數(shù)使用散劑和粉劑，存在粗纖維含量高、植物細(xì)胞壁難以破碎等問(wèn)題，嚴(yán)重阻礙了中藥有效成分的吸收和利用。研究發(fā)現(xiàn)，采用益生菌對(duì)中藥進(jìn)行發(fā)酵，益生菌分泌的纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶等酶類物質(zhì)能夠促進(jìn)植物細(xì)胞壁的分解，使得植物細(xì)胞內(nèi)的苷類、皂甙類、有機(jī)酸、揮發(fā)油、微量元素、多糖、小肽等功能性物質(zhì)溢出增多，不僅提高了藥物的生物利用度，增強(qiáng)了傳統(tǒng)中藥藥效，還可以產(chǎn)生新的化學(xué)活性成分并節(jié)約資源等[7]。多項(xiàng)研究表明，發(fā)酵中藥能夠提高仔豬的生產(chǎn)性能、抗氧化能力和免疫功能，增加腸道中有益菌的數(shù)量，有利于維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)腸道健康，降低腹瀉和疫病的發(fā)生[8-10]。然而發(fā)酵中藥種類繁多，且作用各不相同。在前人的研究中，使用較多的是具有抗病效果的發(fā)酵中藥，而本試驗(yàn)所用的中藥發(fā)酵粉由山楂、陳皮、雞內(nèi)金、山藥、茯苓等復(fù)方中藥發(fā)酵而成，在中醫(yī)上具有開胃健脾、促進(jìn)消化等功效，鮮有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本試驗(yàn)以斷奶仔豬為研究對(duì)象，探究此復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)仔豬生長(zhǎng)性能、養(yǎng)分表觀消化率、抗氧化功能以及免疫功能的影響，以期為發(fā)酵中藥作為一種綠色飼料添加劑應(yīng)用于仔豬生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用復(fù)方中藥發(fā)酵粉由廣州市某公司提供，主要以山楂、陳皮、雞內(nèi)金、山藥、茯苓為原料，烘干、粉碎過(guò)80目篩后，經(jīng)由乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌（每種菌的總活菌數(shù)均≥5×107CFU/mL，均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所分離篩選所得）按1∶1∶1比例混合，固態(tài)厭氧發(fā)酵48 h后而成，其主要活性物質(zhì)包括有機(jī)酸、黃酮類物質(zhì)、多糖類及三萜類物質(zhì)等。復(fù)方中藥發(fā)酵粉和添加了復(fù)方中藥發(fā)酵粉的試驗(yàn)組飼糧密封后置于陰涼處保存。

1.2 試驗(yàn)分組及飼糧

試驗(yàn)采用單因素完全隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選取48頭初始體重為（8.290±0.140）kg、健康的28日齡三元（杜×長(zhǎng)×大）雜交去勢(shì)斷奶仔豬，按照體重隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4頭豬。對(duì)照組飼喂基礎(chǔ)飼糧，試驗(yàn)組飼喂基礎(chǔ)飼糧+3%復(fù)方中藥發(fā)酵粉（前期進(jìn)行了梯度試驗(yàn)，確定推薦的劑量為3%，等量替代基礎(chǔ)飼糧中的玉米）制成的試驗(yàn)飼糧。試驗(yàn)期為28 d，分為前期（第1～14天）和后期（第15～28天）兩個(gè)階段。試驗(yàn)基礎(chǔ)飼糧為玉米-豆粕型，基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 基礎(chǔ)飼糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平（干物質(zhì)基礎(chǔ)）Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets （DM basis） %

1.3 飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)在廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所仔豬場(chǎng)進(jìn)行。豬舍內(nèi)溫度控制在25 ℃左右。試驗(yàn)期間保證仔豬自由采食和飲水，每天早晚觀察斷奶仔豬的精神狀態(tài)。每天不定時(shí)打掃豬舍，定期對(duì)豬舍消毒。消毒、免疫程序均按照豬場(chǎng)常規(guī)程序進(jìn)行。

1.4 樣品采集和處理

試驗(yàn)第26～28天，每天早上08:00開始采集各組飼糧樣和每個(gè)重復(fù)的新鮮糞樣。飼糧樣和糞樣采集、處理以及保存參照余苗等[11]的方法。試驗(yàn)第28天結(jié)束后，所有斷奶仔豬禁食12 h，于試驗(yàn)結(jié)束后第2天每個(gè)重復(fù)選取1頭接近平均體重的斷奶仔豬頸靜脈采血，用含抗凝劑（肝素鈉）的采血管收集血液，混勻，室溫靜置30 min后，3 500 r/min，4 ℃離心10 min，收集血漿，-80 ℃保存。采血結(jié)束后屠宰，取肝臟組織，用生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，迅速切小塊分裝于滅菌的凍存管并轉(zhuǎn)移至液氮中速凍，-80 ℃保存。

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能 試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)，所有斷奶仔豬空腹稱重；試驗(yàn)期間記錄每天的采食量；仔細(xì)觀察斷奶仔豬的糞便并進(jìn)行評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及計(jì)算公式參照謝全喜等[12]方法。試驗(yàn)結(jié)束后計(jì)算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）、料重比（F/G）以及腹瀉率。

1.5.2 養(yǎng)分表觀消化率 用內(nèi)源指示劑（鹽酸不溶灰分（AIA））標(biāo)記法計(jì)算養(yǎng)分表觀消化率，計(jì)算公式為：

養(yǎng)分表觀消化率（%）=[1-（b×c）/（a×d）]×100%

其中，a為飼糧中某養(yǎng)分的含量，c為飼糧中酸不溶灰分的含量，b為糞樣中某養(yǎng)分的含量，d為糞樣中鹽酸不溶灰分的含量。

飼糧和糞樣中總能（GE）用Parr-6400型全自動(dòng)氧彈量熱儀測(cè)定；干物質(zhì)（DM）、粗蛋白質(zhì)（CP）、粗脂肪（EE）、粗纖維（CF）、粗灰分（Ash）、鈣（Ca）、磷（P）、鹽酸不溶灰分含量測(cè)定方法按表2中的方法操作。

表2 飼糧和糞樣各養(yǎng)分測(cè)定方法Table 2 Methods for determination of nutrients in diets and manure samples

1.5.3 抗氧化指標(biāo) 血漿和肝臟中總抗氧化能力（T-AOC）、丙二醛（MDA）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、過(guò)氧化氫酶（CAT）等指標(biāo)均按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)。測(cè)定肝臟抗氧化指標(biāo)時(shí)，取0.1 g肝臟組織，加入9倍體積的生理鹽水制成10%的組織勻漿液，3 500 r/min，4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)行測(cè)定。

1.5.4 免疫指標(biāo) 血漿中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等免疫指標(biāo)均使用ELISA試劑盒（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，0.05≤P<0.10表示有差異顯著趨勢(shì)。

2 結(jié) 果

2.1 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

由表3可知，與對(duì)照組相比，復(fù)方中藥發(fā)酵粉組斷奶仔豬ADG顯著提高（P<0.05），腹瀉率顯著降低（P<0.05）。兩組之間F/G和ADFI均無(wú)顯著性差異（P>0.05）。

表3 各組斷奶仔豬生長(zhǎng)性能Table 3 Growth performance of weaned piglets in each group

2.2 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

由表4可知，與對(duì)照組相比，復(fù)方中藥發(fā)酵粉組粗脂肪、粗灰分和鈣的表觀消化率極顯著或顯著提高（P<0.01；P<0.05）。兩組之間總能、干物質(zhì)、粗蛋白質(zhì)、粗纖維和磷的表觀消化率均無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表4 各組斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率Table 4 Nutrient apparent digestibility of weaned piglets in each group %

2.3 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響

由表5可知，飼糧添加復(fù)方中藥發(fā)酵粉可明顯提高斷奶仔豬血漿中CAT和GSH-Px活性（P<0.05），極顯著提高血漿中的T-AOC（P<0.01），而對(duì)MDA含量和T-SOD活性均無(wú)顯著影響（P>0.05）。與對(duì)照組相比，復(fù)方中藥發(fā)酵粉組斷奶仔豬肝臟中T-SOD活性顯著提高（P<0.05），而CAT和GSH-Px活性、MDA含量以及T-AOC無(wú)顯著差異（P>0.05）。

表5 各組斷奶仔豬抗氧化功能Table 5 Antioxidant function of weaned piglets in each group

2.4 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

由表6可知，與對(duì)照組相比，飼糧中添加復(fù)方中藥發(fā)酵粉顯著提高了斷奶仔豬血漿中IgA和IgM含量（P<0.05），同時(shí)顯著降低了TNF-α含量（P<0.05），而對(duì)IgG含量無(wú)顯著影響（P>0.05）。

表6 各組斷奶仔豬免疫功能Table 6 Immune function of weaned piglets in each group

3 討 論

3.1 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬生長(zhǎng)性能的影響

仔豬斷奶應(yīng)激往往引起生長(zhǎng)性能下降、腹瀉，嚴(yán)重者甚至死亡[1]。中藥含有多種生物活性成分，添加到斷奶仔豬飼糧中能夠減少仔豬斷奶應(yīng)激，防治腹瀉，從而提高其生長(zhǎng)性能[13]。中藥經(jīng)益生菌發(fā)酵后，中藥中的大分子物質(zhì)可轉(zhuǎn)化為易吸收的小分子物質(zhì)，增加藥性并降低毒副作用[7]。武洪志等[14]在飼糧中添加0.2%發(fā)酵復(fù)方中藥（蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、山楂、甘草）顯著提高了斷奶仔豬ADG和ADFI，并且顯著降低了仔豬腹瀉率。曲浩杰等[15]研究表明，在飼糧中添加600 mg/kg的中藥復(fù)方發(fā)酵粉（黃柏、黃芩、黃連、大黃）顯著提高了斷奶仔豬ADG。董延江等[16]研究表明，在飼糧中添加3%的發(fā)酵中草藥制劑可以顯著提高斷奶仔豬ADG和ADFI，降低F/G。與上述研究基本一致，本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼糧中添加復(fù)方中藥發(fā)酵粉能顯著提高斷奶仔豬ADG，并顯著降低斷奶仔豬腹瀉率，表明復(fù)方中藥發(fā)酵粉可以降低斷奶仔豬腹瀉率，從而提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能。究其原因，一方面是因?yàn)樵搹?fù)合中藥發(fā)酵粉中含有山楂、陳皮、雞內(nèi)金等成分，具有促進(jìn)消化液分泌，增強(qiáng)消化酶活性等功能[17-19]；另一方面，復(fù)方中藥發(fā)酵粉中的芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌能夠分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶，促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)可以改善腸道健康，增強(qiáng)仔豬免疫力，降低腹瀉率[20]，從而促進(jìn)仔豬生長(zhǎng)。

3.2 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬養(yǎng)分表觀消化率的影響

養(yǎng)分表觀消化率可以反映動(dòng)物對(duì)飼糧的消化能力和飼糧的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。Zhao等[21]通過(guò)在飼糧中添加不同濃度的發(fā)酵中草藥（平臥菊三七、熟地黃、黃芩）發(fā)現(xiàn)其可以顯著提高斷奶仔豬飼糧干物質(zhì)、氮和總能的表觀消化率。Lei等[22]研究表明，飼糧添加0.05%的發(fā)酵中草藥（茵陳蒿、刺五加）可顯著提高肥育豬飼糧干物質(zhì)和氮的全腸道表觀消化率。曲浩杰等[15]研究表明，在飼糧中添加600 mg/kg的中藥復(fù)方發(fā)酵粉（黃柏、黃芩、黃連、大黃）可以顯著提高仔豬對(duì)干物質(zhì)、有機(jī)物和碳水化合物的表觀消化率。而本研究表明，飼糧中添加3%復(fù)方中藥發(fā)酵粉可顯著提高斷奶仔豬對(duì)飼糧中粗脂肪、粗灰分和鈣的表觀消化率，對(duì)干物質(zhì)、氮和總能等的消化率無(wú)顯著影響。造成這種差異的原因可能是中藥成分以及發(fā)酵菌種的不同。本研究所用復(fù)方中藥發(fā)酵粉中含有的芽孢桿菌、乳酸菌等益生菌可以分泌脂肪酶和維生素等，促進(jìn)了仔豬對(duì)脂肪以及礦物質(zhì)的消化吸收，同時(shí)中藥配方中的山楂、陳皮和雞內(nèi)金具有促進(jìn)消化液分泌、提高消化酶活性的作用[17-19]，并且山楂自身含有的解脂酶也具有促進(jìn)脂類物質(zhì)消化的作用[17]，從而提高飼糧中粗脂肪、粗灰分和鈣的表觀消化率。

3.3 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬抗氧化功能的影響

斷奶仔豬應(yīng)激時(shí)體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量自由基，導(dǎo)致機(jī)體生物大分子受損和細(xì)胞凋亡等，氧化和抗氧化系統(tǒng)平衡受到破壞[23]。機(jī)體能通過(guò)酶系統(tǒng)和非酶系統(tǒng)清除體內(nèi)自由基，其中最主要的抗氧化酶包括SOD、GSH-Px、CAT等，SOD通過(guò)催化超氧陰離子自由基歧化為過(guò)氧化氫（H2O2），再由GSH-Px和CAT將其轉(zhuǎn)化為水（H2O），因此其活性可以反映機(jī)體的抗氧化能力[24]。MDA是機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以反映細(xì)胞氧化損傷的程度[25]。T-AOC是反映機(jī)體抗氧化功能的綜合指標(biāo)[26]。方磊涵等[27]研究表明，在飼糧中添加3%的發(fā)酵中藥復(fù)方（黃芪、白術(shù)、秦皮、蒼術(shù)、黃連、何首烏、陳皮、焦三仙、松針、貫眾）可以顯著提高斷奶仔豬血清中SOD、GSH-Px活性和T-AOC，降低MDA含量。丁鵬等[28]研究表明，與對(duì)照組相比，添加15%發(fā)酵桑粉組的豬血清中T-AOC提高了27.6%。董延江等[16]研究表明，在飼糧中添加3%的發(fā)酵中草藥制劑可以顯著提高斷奶仔豬血清中GSH-Px活性，而對(duì)血清中MDA含量、SOD活性以及T-AOC無(wú)顯著影響。本研究結(jié)果表明，在飼糧中添加3%復(fù)方中藥發(fā)酵粉提高了斷奶仔豬血漿中GSH-Px、CAT活性以及T-AOC，同時(shí)提高了肝臟中T-SOD活性。這是由于復(fù)方中藥發(fā)酵粉中含有黃酮、多糖和有機(jī)酸等活性成分，通過(guò)清除自由基，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化以及增強(qiáng)抗氧化酶活性[17-19]，從而提高了仔豬機(jī)體的抗氧化能力。

3.4 復(fù)方中藥發(fā)酵粉對(duì)斷奶仔豬免疫功能的影響

免疫球蛋白是一類具有抗體活性或抗體相似化學(xué)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)，可直接參與機(jī)體的體液免疫反應(yīng)，主要包括IgA、IgG和IgM[29]。IgA是人體最豐富的免疫球蛋白，主要存在于黏膜組織和分泌物中，如胃腸道、呼吸道、唾液和乳汁等，在血液中含量較少[30]。IgG是血液中含量最多的免疫球蛋白，具有抗菌、抗病毒、激活補(bǔ)體、中和毒素等功能[31]。IgM主要存在于血液中，是機(jī)體免疫應(yīng)答中最早出現(xiàn)的抗體，具有結(jié)合補(bǔ)體、溶解病原體等功能[32]。 TNF-α是一種由巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等分泌的促炎細(xì)胞因子，可以參與機(jī)體正常的炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[33]。血液中免疫球蛋白和細(xì)胞因子的含量是衡量動(dòng)物機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。段雪磊等[34]研究表明，1.0%絞股藍(lán)微粉發(fā)酵物可顯著提高斷奶仔豬血清中IgG和IgA的含量。武洪志等[14]在飼糧中添加0.2%的發(fā)酵復(fù)方中草藥（蒼術(shù)、白術(shù)、黃柏、板藍(lán)根、山楂、甘草）顯著提高了仔豬血清中IgA、IgG和IgM的含量。刁新平等[35]研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，添加0.2%的發(fā)酵白術(shù)組仔豬血清中IgA、IgG和IgM的含量顯著提高。與上述研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，飼糧添加3%的復(fù)方中藥發(fā)酵粉顯著提高了斷奶仔豬血漿中IgA和IgM的含量，同時(shí)顯著降低了血漿中TNF-α的含量，表明仔豬的機(jī)體免疫功能得到了增強(qiáng)。這可能是因?yàn)閿嗄套胸i自身免疫系統(tǒng)發(fā)育不完善，斷奶應(yīng)激更導(dǎo)致免疫功能紊亂，而中藥成分中含有的山藥多糖和茯苓多糖具有免疫調(diào)節(jié)功能[36-37]，同時(shí)，益生菌在發(fā)酵中藥的過(guò)程中可以分泌多種有機(jī)酸和抗菌物質(zhì)，抑制了腸道有害菌的生長(zhǎng)，并且可以通過(guò)刺激機(jī)體的免疫系統(tǒng)，增強(qiáng)特異性和非特異性免疫應(yīng)答[20]，從而提高斷奶仔豬的免疫力。

4 結(jié) 論

飼糧添加3%復(fù)方中藥發(fā)酵粉可提高斷奶仔豬對(duì)飼糧粗脂肪、粗灰分和鈣的表觀消化率，提高斷奶仔豬機(jī)體的抗氧化功能以及免疫功能，從而降低仔豬腹瀉率，提高斷奶仔豬的生長(zhǎng)性能。