Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化壯藥黃杞中總黃酮的回流提取工藝

陳丹丹　班曉敏　林夏　楊溢　岑杏蔓

【摘 要】 目的：采用Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化壯藥黃杞的提取工藝。方法：以總黃酮為指標(biāo)，以液料比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為因素，正交試驗(yàn)初步篩選工藝參數(shù)，BoxBehnken 響應(yīng)面法作進(jìn)一步優(yōu)化。結(jié)果：最優(yōu)工藝條件為：提取時(shí)間1.5 h，乙醇量為10倍，提取2次。結(jié)論：方法合理可靠，穩(wěn)定，可預(yù)測(cè)性較優(yōu)。

【關(guān)鍵詞】 壯藥;黃杞;總黃酮; 回流提取;Box-Behnken響應(yīng)面法

【中圖分類(lèi)號(hào)】R284.2【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A? 【文章編號(hào)】1007-8517（2022）05-0046-06

基金項(xiàng)目：廣西高校中青年教師科研基礎(chǔ)能力提升項(xiàng)目（2019KY1531）;廣西來(lái)賓市科技局科技攻關(guān)與新產(chǎn)品試制（來(lái)科攻202411）。

作者簡(jiǎn)介：陳丹丹（1981-），女，壯族，碩士，講師，研究方向?yàn)樯帉W(xué)。E-mail：76001566@qq.com

通信作者：林夏（1987-），女，漢族，博士，講師，研究方向?yàn)樗幬镏苿?。E-mail：237161741@qq.com

Response Surface Method Was Use to Optimize the Extraction of Astilbin and Engelitin

From Zhuang Medicine of Engelhardia Roxburghiana Wall.

CHEN Dandan1 BAN Xiaomin2 LIN Xia^1*YANG Yi3 CEN Xingman4

1.Guangxi Health Vocational and Technical College， Nanning 5300232，China;

2.Guangxi Nanning the Sixth People's Hospital，Nanning 5300232，China;

3.The 923 Logistic Support Unit hospital of the PLA，Nanning 5300232，China;

4.Guangxi Guiping People's Hospital，Guiping 537200，China

Abstract：Objective Optimization of extraction technology of Zhuang medicine Engelhardia roxburghiana Wall. by orthogonal test and Box-Behnken response surface method. Methods According to the total flavonoids， the ratio of liquid to material， extraction time and extraction times were taken as factors， and the process parameters were preliminarily selected by orthogonal， test BoxBehnken the response surface method for further optimization. Results The optimum conditions were as follows： extraction time 1.5 h， ethanol 10 times， extraction 2 times. Conclusion The method is reasonable， reliable， stable and predictable.

Key words：Zhuang Medicine;Engelhardtia Roxburghiana Wall;Total Flavonoid;Reflux Extraction;Box-Behnken Response Surface Method

黃杞是胡桃科黃杞屬植物黃杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥葉，主要分布在廣西、廣東、云南等亞熱帶地區(qū)?！吨腥A本草》^[1]記載黃杞樹(shù)皮行氣化濕;葉可作茶飲，具有清熱解毒、生津止渴、解暑利濕的作用，可用于脾胃濕滯、胸腹脹悶、感冒發(fā)燒等的治療。1996年曾收載在《廣西中藥材標(biāo)準(zhǔn)》（第二冊(cè)），2011年收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)·第二卷》，壯醫(yī)認(rèn)為黃杞味微甜，性涼。清熱毒，除濕毒，調(diào)氣道，谷道。用于痧?。ǜ忻埃l(fā)得（發(fā)熱），東郎（食滯），貨煙媽?zhuān)ㄑ恃祝┡c中醫(yī)對(duì)其的認(rèn)識(shí)基本一致^[2]。作為壯族常用藥之一，其藥用資源豐富，藥用歷史悠久，壯族地區(qū)的群眾常以葉煮水當(dāng)茶飲，民間又稱“甜茶”，可消除暑熱口渴、食滯、腹痛，有降血脂，降血壓等功效^[3-4]，有部分壯族群眾利用黃杞的樹(shù)汁或樹(shù)皮的水提物來(lái)治療麻疹、皮炎等皮膚病^[5]。研究^[6-9]表明黃杞中含有豐富的次生代謝產(chǎn)物，主要含有黃酮類(lèi)成分，此外還有醌類(lèi)、甾類(lèi)、三萜類(lèi)等，黃酮類(lèi)成分藥理作用廣泛，在抗凝血，抗血栓，降血脂，降血糖等方面表現(xiàn)出較強(qiáng)的藥理活性。在提取方面的報(bào)道僅見(jiàn)宋明明等^[10]采用正交試驗(yàn)優(yōu)選黃杞葉總黃酮的最佳提取工藝，制劑方面未見(jiàn)報(bào)告。

實(shí)驗(yàn)開(kāi)展黃杞總黃酮提取工藝的優(yōu)化研究，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)為變量，總黃酮提取率為指標(biāo)，利用Box-Behnken應(yīng)面法進(jìn)一步優(yōu)化回流提取工藝，響應(yīng)面優(yōu)化法與已有文獻(xiàn)報(bào)告的正交試驗(yàn)優(yōu)化比較，更能體現(xiàn)不同因素之間的交互作用對(duì)藥材提取率影響，更全面的和真實(shí)的反應(yīng)提取過(guò)程中各個(gè)因素的交互作用，本研究的結(jié)果以期為黃杞的后續(xù)制劑開(kāi)發(fā)提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和奠定了基礎(chǔ)^[11-19]。A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

1 儀器與試藥

1.1 儀器 TU-1901紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本島津公司）;PRACYUM124-LCN電子分析天平（賽多利斯電子儀器公司）;KQ-250DB循環(huán)式多用真空;恒溫水浴鍋。

1.2 試藥 黃杞采自于廣西南寧賓陽(yáng)縣陳平鎮(zhèn)，經(jīng)本校中藥鑒定教研室劉安韜副教授鑒定為胡桃科植物黃杞Engelhardia roxburghiana Wall.的干燥葉。蘆丁對(duì)照品（中國(guó)上海詩(shī)丹德生物技術(shù)有限公司;批號(hào)：5981;純度：99%）。乙醇、甲醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純（廣東光華科技股份有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆丁對(duì)照品10 mg，甲醇定容至50 mL，加無(wú)水甲醇溶解，并稀釋至刻度，搖勻，制成濃度為0.2 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 稱取黃杞藥粉5 g，加90%乙醇（料液比1∶10），提取2次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，精密吸取續(xù)濾液1 mL，揮干乙醇，用20 mL水溶解，超聲使其溶解，移入分液漏斗，加20 mL石油醚萃取，重復(fù)2～3次，至無(wú)色。棄去石油醚層，水層轉(zhuǎn)入分液漏斗，加20 mL乙酸乙酯萃取，重復(fù)3次，棄去水層，將乙酸乙酯層置于錐形瓶中水浴揮干，加入甲醇洗滌容器，將洗滌液轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取配置好的蘆丁對(duì)照品0、1、2、3、4、5、6 mL，分別置25 mL量瓶中，各加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，混勻，靜置6 min，加10% Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻，靜置6 min，加4% NaOH溶液10 mL，再加水定容，搖勻，放置15 min，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見(jiàn)分光光度法，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，以吸光度（A）為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)（C）進(jìn)行回歸，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線為A=0.0115C-0.0099（R2=0.9991），在0.008～0.049 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 取蘆丁對(duì)照品溶液適量，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，連續(xù)6次，計(jì)算RSD為1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，在60 min內(nèi)從起始時(shí)間開(kāi)始每隔5 min測(cè)定1次吸光度，計(jì)算RSD為1.7%，表明溶液在60 min內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取6份黃杞藥材粉末，按照2.2供試品溶液的制備得供試品溶液6份，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，各平行測(cè)定3次，取平均值，帶入回歸方程，計(jì)算樣品中總黃酮的含量和RSD值，RSD為1.8%，表明此方法重復(fù)性性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取6份已知總黃酮含量的供試品溶液中，每份1 mL（已測(cè)得其總黃酮含量為0.0201 mg/mL），分別加入蘆丁溶液（濃度為0.01 mg/mL） 1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL各 2份，按照“2.3.1”項(xiàng)下進(jìn)行制備并測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，平均回收率為98.48%，RSD=1.06%，表明該方法科學(xué)合理。

2.4 供試品中總黃酮的測(cè)定 精密吸取“2.2供試品溶液的制備”中的溶液3 mL，定容至25 mL，按照“2.3.1”項(xiàng)下方法操作，在500 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，各平行測(cè)定3次，取平均值，測(cè)定樣品中總黃酮的含量。

3 單因素試驗(yàn)

3.1 料液比 取黃杞粉末，過(guò)20目篩，稱取5 g，95%乙醇，提取1.5 h，提取2次，考察1∶8、1∶10、1∶12、1∶14、1∶16料液比對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖1所示，提取率隨著料液比的增加而升高，當(dāng)料液超過(guò)到1∶14后，提取率基本變化不大，為節(jié)約溶劑，故選用1∶8、1∶10、1∶12進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析。

3.2 提取時(shí)間 取黃杞粉末，過(guò)20目篩，稱取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取2次，考察0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、2.5 h不同時(shí)間對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖2所示，1 h提取率最高，隨著時(shí)間的增加，總黃酮提取率變化不大，故選擇1 h、1.5 h、2 h進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

3.3 提取次數(shù) 取黃杞粉末，過(guò)20目篩，稱取5g，95%乙醇，固定料液比1∶10，提取1.5 h，考察1次、2次、3次、4次、5次不同提取次數(shù)對(duì)總黃酮提取率的影響。結(jié)果如圖3所示，提取2次后，總黃酮提取率明顯下降，說(shuō)明提取2次已經(jīng)提取完全。故選擇1次、2次、3次進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化分析。

4 響應(yīng)面優(yōu)化法

4.1 優(yōu)化試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇料液比（A）、提取時(shí)間（B）、提取次數(shù)（C）作為影響因素，總黃酮提取率（Y）作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選取3因素3水平使用Design Expert 8.0.6軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)優(yōu)化。因素水平及實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，表3。

4.2 方差分析 方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，在一次項(xiàng)中，A、B、C項(xiàng)，只有C項(xiàng)對(duì)總黃酮提取率具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），交互項(xiàng)均不顯著，說(shuō)明各試驗(yàn)因子對(duì)響應(yīng)值的影響并非簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，失擬項(xiàng)F值為4.45，P=0.0924，失擬項(xiàng)不顯著，表明回歸模型和實(shí)測(cè)值能較好的擬合，可信度高，表明該模型擬合優(yōu)度較好。利用軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，對(duì)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析后得到模型的二次多項(xiàng)回歸方程為：

R=-27.972+4.197A+10.032B+5.043C+0.228AB-0.138AC-0.035BC-0.023A2-4.114B2-0.701C2A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701

影響因子對(duì)提取率的影響為：C>A>B。試驗(yàn)?zāi)Ｐ涂尚欧治觯嚓P(guān)系數(shù)R2=0.9609，說(shuō)明模型可以理解為96.09%試驗(yàn)所得的黃杞總黃酮含量的變化擬合較好。分析說(shuō)明，可用此試驗(yàn)方法來(lái)提取黃杞總黃酮的工藝研究。

4.3 響應(yīng)曲面圖分析 為了進(jìn)一步研究變量之間的相互作用，應(yīng)用Design Expert 8.0.6軟件模擬得到了各因素對(duì)黃杞總黃酮提取率的3D響應(yīng)曲面圖和等高線圖，結(jié)果如圖4～圖6所示。由圖4～圖6可知，響應(yīng)面曲面開(kāi)口朝下，響應(yīng)面曲線變化相對(duì)陡峭，等高線呈橢圓形，說(shuō)明各因素的交互作用對(duì)黃杞總黃酮提取率的影響較為明顯。

4.4 黃杞總黃酮提取的優(yōu)化和驗(yàn)證 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)的最佳提取工藝為：料液比1∶10.2，提取時(shí)1.54 h，提取次1.92次，在此工藝下總黃酮提取率預(yù)測(cè)值為（7.352±0.010）%。考慮實(shí)際情況，將最佳工藝修正為：料液比：1∶10，提取時(shí)間1.5 h，提取次數(shù)2次。在修正的工藝條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，重復(fù)5次，得到黃杞總黃酮提取率（7.328±0.010）%。結(jié)果見(jiàn)表5。

5 討論

目前，關(guān)于壯藥黃杞總黃酮提取工藝的研究報(bào)道主要是采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。實(shí)驗(yàn)先采用單因素試驗(yàn)考察了料液比、提取時(shí)間、提取次數(shù)對(duì)其提取率的影響，然后進(jìn)行Box-Behnken 試驗(yàn)優(yōu)化設(shè)計(jì)，最后以Design-Expert8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)回歸和方差分析，將因素與結(jié)果的關(guān)系進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，篩選出最佳提取工藝。測(cè)得回歸方程的相關(guān)系數(shù)為0.9609，表明方程擬合良好。根據(jù)響應(yīng)曲面及等高線圖，得到了各因素間的相互作用對(duì)黃杞總黃酮提取率的影響，響應(yīng)面曲面開(kāi)口朝下，響應(yīng)面曲線變化相對(duì)陡峭，等高線呈橢圓形，說(shuō)明各因素的交互作用對(duì)黃杞總黃酮提取率的影響較為明顯。

驗(yàn)證試驗(yàn)表明，該模型方法可靠性高。最終確定最優(yōu)工藝，料液比1∶10，提取時(shí)間1.5 h，提取次數(shù)2次，在此條件下壯藥黃杞總異黃酮提取率為7.328%，明顯高于單因素試驗(yàn)結(jié)果，為壯藥黃杞中總黃酮的后續(xù)制劑開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

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（收稿日期：2021-07-14 編輯：陶希睿）A67D4071-5767-49FE-868D-67CB7CFF2701