COX-2/NLRP3/IL-18 信號通路在尼羅替尼對癲癇大鼠神經保護中的作用

羅勇，畢文歡，袁威峰

邵陽學院附屬第二醫(yī)院神經內科一區(qū)，湖南邵陽 422000

尼羅替尼是一種用于慢性粒細胞白血病治療的酪氨酸激酶抑制劑，可穿透血腦屏障，對神經炎癥具有抑制作用［1］。研究顯示，尼羅替尼可能通過促進抗氧化、抗炎、抗凋亡通路和抑制自噬，對戊四唑（PTZ）誘發(fā)的癲癇發(fā)作具有良好的神經保護和治療作用，可作為一種新的抗癲癇藥物［2］。環(huán)氧合酶2（COX-2）是一種促炎癥介質合成的前列腺素酶，癲癇發(fā)作期間大腦COX-2 水平上調，導致促炎介質產生增加，抑制COX-2 已被認為可能是癲癇潛在的神經治療靶點［3］。NOD 樣受體蛋白 3（NLRP3）炎癥小體由NLRP3蛋白、凋亡相關斑點蛋白（ASC）、前半胱天冬酶1組成，其活化后可將pro-IL-1β、pro-IL-18分別裂解為成熟的IL-1β、IL-18。研究報道，COX-2 對上述NLRP3 炎癥小體衍生的IL-1β 產生具有調節(jié)作用［4］。為探討尼羅替尼抗癲癇作用的分子機制，2021 年7 月—9 月，我們就尼羅替尼對癲癇大鼠COX-2/NLRP3/IL-18信號通路的影響進行了觀察。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 成年雄性SD大鼠68只，6～8周齡，體質量150～200 g，SPF 級，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司，許可證號為SCXK（魯）2019-0003。大鼠飼養(yǎng)在溫度（23 ± 1）°C、光照條件固定（12 h 黑暗和12 h 光照循環(huán)）、濕度（60±2）%和自由獲取水和食物的環(huán)境中7 d。

1.2 主要試劑及儀器 尼羅替尼膠囊（瑞士諾華制藥有限公司）、PTZ（Sigma-Aldrich）、COX-2 抑制劑SC-58125（美國ChemeGen 公司）。HE 染色試劑、RIPA 裂解液、BCA 試劑盒購自碧云天生物科技有限公司；兔源一抗NLRP3、裂解的半胱天冬氨酸蛋白酶-1（Cleaved Caspase-1）、β-actin 和二抗山羊抗兔IgG H + L 購自美國 Cell Signaling Technology 公司；兔源一抗COX-2、IL-1β、IL-18購自英國Abcam 公司。iMark680 多功能酶標儀（美國Bio-Rad 公司）、BX61電動顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.3 模型制備與分組 68只大鼠隨機取12只為對照組，其余56 只采用PTZ（35 mg/kg）腹腔注射法誘導建立癲癇模型［5］，隔日1次，連續(xù)注射4周（每周稱量大鼠體質量，調整給藥劑量）。每次注射后，在隔離的透明盒子中單獨觀察動物30 min，使用Racine量表進行驚厥強度評分。0分為無反應；1分為節(jié)律性耳或面部抽搐；2 分為點頭并伴更嚴重的面部抽搐；3分為單側前肢陣攣；4分為出現雙側前肢陣攣；5 分為全身強直-陣攣抽搐，姿勢失控。一旦動物在至少3 次連續(xù)實驗中表現出4 或5 分的癲癇發(fā)作評分，則認為它已被點燃，不再對這些動物進行PTZ注射。造模過程中有5只大鼠因癲癇大發(fā)作死亡，3只發(fā)作評分未達到4 分或4 分以上，均予以剔除，成功制作癲癇發(fā)作模型48 只。停藥1 周后，再次注射等劑量PTZ，以確認點燃持續(xù)性，然后將48 只癲癇大鼠隨機分為模型組、SC-58125 組、尼羅替尼組、尼羅替尼+SC-58125組，每組12只。SC-58125組每天給予10 mg/kg SC-58125 灌胃，尼羅替尼組每天給予25 mg/kg尼羅替尼灌胃，尼羅替尼+SC-58125組每天給予25 mg/kg尼羅替尼和10 mg/kg SC-58125 灌胃，對照組和模型組給予等量溶劑灌胃，每天1次，連續(xù)4周。

1.4 大鼠行為學變化觀察 末次給藥1 h后，除對照組外，其余各組再次腹腔注射PTZ（35 mg/kg），觀察大鼠的癲癇發(fā)作情況，記錄最終發(fā)作等級、癲癇發(fā)作潛伏期及持續(xù)時間。

1.5 海馬組織病理學變化觀察 在實驗結束時，每組隨機選取6 只大鼠，斷頭取腦，用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，5μm 厚連續(xù)切片，進行蘇木精和伊紅染色以進行常規(guī)組織學檢查，使用光學顯微鏡對切片進行觀察和拍照。

1.6 海馬組織COX-2/NLRP3/IL-18 通路相關蛋白表達檢測 采用Western blotting法。每組另外6只大鼠，斷頭取腦，分離海馬組織液氮速凍后置于-80 ℃冰箱保存。取凍存海馬組織，在RIPA 裂解液中勻漿，置于冰上，靜置后以12 000× g 離心10 min，取上清液。在10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）上分離等量的蛋白質（每泳道30μg），然后轉移到0.22μm聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上。用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，并與一抗COX-2、NLRP3（1∶500）、Cleaved Caspase-1（1∶1 000）、IL-18（1∶500）、IL-1β（1∶500）和 β-actin（1∶2 000）在 4 °C 下孵育過夜，然后用TBST（含 Tween 20 的TBS）洗滌膜，隨后與山羊抗兔IgG 二抗（1∶5 000）室溫孵育1 h。ECL顯色，以 β-actin 為內參，使用 Image-Pro Plus 6.0 軟件進行定量分析，測定COX-2/NLRP3/IL-18 信號通路各相關蛋白的相對表達量。

1.7 統(tǒng)計學方法 使用SPSS22.0統(tǒng)計軟件。計量資料先行正態(tài)分布檢驗，符合正態(tài)分布以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組行為學變化 對照組均無癲癇發(fā)作。與模型組相比，SC-58125組和尼羅替尼組癲癇最終發(fā)作評分降低和癲癇發(fā)作持續(xù)時間縮短、發(fā)作潛伏期延長（P均＜0.05）；與SC-58125組和尼羅替尼組相比，尼羅替尼+SC-58125組癲癇最終發(fā)作評分降低和持續(xù)時間縮短、發(fā)作潛伏期顯著延長（P均＜0.05）。見表1。

表1 各組行為學指標變化（）

表1 各組行為學指標變化（）

注：與模型組比較，bP＜0.05；與SC-58125組、尼羅替尼組比較，cP＜0.05。

組別對照組模型組SC-58125組尼羅替尼組尼羅替尼+SC-58125組n 發(fā)作潛伏期（s） 持續(xù)時間（min）20.36±2.48 14.78±1.65b 15.03±1.82b 9.26±1.47c 12 12 12 12 12驚厥強度評分（分）0 4.52±0.67 3.18±0.55b 3.25±0.46b 2.30±0.38c 158.27±19.53 244.64±25.16b 237.85±28.49b 306.32±34.55c

2.2 各組海馬組織病理學變化 對照組海馬神經元結構清晰、完整，呈圓形或橢圓形，胞質透明，核仁清晰。模型組海馬組織神經元顯示出退化跡象，可見神經元脫失、胞質深染、細胞核縮小。與模型組相比，SC-58125 組和尼羅替尼組海馬神經元數量較多，具有固縮核的細胞減少。尼羅替尼+SC-58125 組神經元分布較為緊密，細胞形態(tài)改善接近正常，偶見染色較深的細胞。

2.3 各組海馬組織COX-2/NLRP3/IL-18 信號通路相關蛋白表達比較 見表2。

表2 各組大鼠海馬組織COX-2/NLRP3/IL-18通路相關蛋白相對表達量比較（）

表2 各組大鼠海馬組織COX-2/NLRP3/IL-18通路相關蛋白相對表達量比較（）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與SC-58125組、尼羅替尼組比較，cP＜0.05。

組別對照組模型組SC-58125組尼羅替尼組尼羅替尼+SC-58125組IL-1β 0.44±0.07 0.89±0.10a 0.69±0.08b 0.72±0.09b 0.53±0.07c n 6 6 6 6 6 COX-2 0.61±0.07 1.41±0.13a 1.05±0.11b 1.12±0.10b 0.87±0.09c NLRP3 0.57±0.06 1.23±0.10a 0.86±0.08b 0.92±0.11b 0.71±0.08c Cleaved Caspase-1 0.38±0.05 0.95±0.09a 0.76±0.08b 0.80±0.10b 0.62±0.07c IL-18 0.65±0.08 1.30±0.14a 0.99±0.12b 1.03±0.10b 0.80±0.13c

3 討論

癲癇是繼中風和阿爾茨海默病之后最常見的神經系統(tǒng)疾病，其特征是反復發(fā)作和自發(fā)性發(fā)作。神經炎癥已被確定為癲癇的起因和結果，并且是癲癇發(fā)生的促進劑［6-7］。炎癥可以促進神經元興奮性增強，有助于降低易感大腦區(qū)域（即可能加劇癲癇發(fā)作或增加癲癇發(fā)作頻率的區(qū)域）的癲癇發(fā)作閾值［8］。據報道，癲癇患者在發(fā)作間期血清中IL-1β 和IL-18等炎癥因子表達水平升高［9］。炎癥介質和細胞因子如IL-1β 可以介導神經元丟失，并影響突觸傳遞和神經元興奮性，從而促進癲癇發(fā)生，最終導致癲癇發(fā)作和復發(fā)［10］。

有研究報道，雌激素可干擾動物的神經炎癥、小膠質細胞激活以及學習、記憶活動。因此，本研究使用雄性大鼠來避免可能的雌激素對實驗的干擾［11］。在眾多癲癇模型中，PTZ 被廣泛用于誘發(fā)癲癇發(fā)作和評估抗癲癇藥物的有效性，重復PTZ 給藥誘導的點燃癲癇動物模型有助于研究人員確定癲癇的病理生理學途徑。既往研究顯示，PTZ 點燃的慢性癲癇大鼠海馬神經元受損，促炎因子上調［11］。本研究表明，癲癇模型大鼠出現癲癇發(fā)作、海馬CA1 神經元受損現象以及IL-1β、IL-18等炎癥因子水平增加，這與以往的研究結果一致。與模型組相比，尼羅替尼組癲癇發(fā)作明顯延遲，癲癇樣行為降低，海馬神經元損傷減輕，同時IL-1β、IL-18 水平也顯著降低，表明尼羅替尼對癲癇發(fā)作具有保護作用。

NLRP3 炎癥小體已被證明與神經炎癥和癲癇有關，是治療癲癇的潛在靶點［12］。研究表明，NLRP3和Caspase-1 在癲癇動物模型中上調，抑制和沉默NLRP3和Caspase-1具有抗癲癇和神經保護作用［13］。此外，NLRP3 的增加會導致促炎細胞因子IL-18、IL-1β 表達增加［14］，表明 NLRP3 炎癥小體及其下游炎癥因子在癲癇的神經元損傷中起關鍵作用。本研究顯示，模型組 NLRP3、Cleaved Caspase-1 和 IL-18、IL-1β 表達高于對照組，有效抑制NLRP3 表達可能成為防治癲癇的重要手段。

COX-2是神經炎癥的重要介質，參與癲癇發(fā)作。據報道，誘發(fā)癲癇發(fā)作后，大腦中的COX-2 上調，導致促炎介質的產生增加，從而進一步加重癲癇發(fā)作的嚴重程度［15］。癲癇發(fā)作后COX-2 的誘導可能會上調血腦屏障處的多藥外排轉運蛋白P-糖蛋白的表達，增強抗癲癇藥物的腦外流，導致藥物向大腦靶點的遞送減少，從而導致療效不佳［16］。既往報道，用COX-2抑制劑處理會抑制PTZ 在大鼠中產生的癲癇點燃［17］。我們發(fā)現，PTZ 造模癲癇大鼠COX-2 表達上調。因此，COX-2 被認為是治療癲癇的潛在神經治療靶點。有研究顯示，尼羅替尼可顯著下調COX-2和IL-1β 表達，抑制小膠質細胞激活介導的神經炎癥，防止帕金森病模型中的多巴胺能神經元死亡［1］，說明尼羅替尼可通過抑制COX-2 發(fā)揮其藥效學作用。根據文獻，NLRP3 表達受COX-2 調控，抑制COX-2 會降低NLRP3 及其下游炎癥因子的表達［4，18］。本研究顯示，與模型組相比，尼羅替尼組COX-2、NLRP3、Cleaved Caspase-1 和 IL-18、IL-1β 表達降低，且在尼羅替尼干預的基礎上聯(lián)合應用COX-2 抑制劑SC-58125 對大鼠癲癇發(fā)作和海馬神經元損傷的抑制作用顯著優(yōu)于兩者單獨應用。因此，尼羅替尼的抗癲癇和神經保護作用與抑制COX-2/NLRP3/IL-18信號通路有關。

綜上所述，尼羅替尼通過抑制COX-2/NLRP3/IL-18 信號通路降低大鼠癲癇發(fā)作和海馬神經元損傷，這可能為尼羅替尼抗癲癇和神經保護作用的機制。