Piezo1/JAK2信號(hào)通路與膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系

王勇，王強(qiáng)，邢宇慶，劉芙君，蘇日亮，馬金健

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院推拿科，濟(jì)南 250021；2 山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院推拿科

膝骨關(guān)節(jié)炎（KOA）是臨床常見的一類骨關(guān)節(jié)疾病，是引起中老年人膝痛的最常見原因，嚴(yán)重影響人們的生活和工作。60 歲以上的人群中，有癥狀的KOA 可達(dá) 50%［1］。軟骨細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是 KOA 重要的病理機(jī)制之一。軟骨細(xì)胞凋亡的數(shù)量與KOA的嚴(yán)重程度密切相關(guān)［2］。Piezo1 通道蛋白是 2010 年被發(fā)現(xiàn)的［3］，是一種機(jī)械敏感性離子通道蛋白，也是一種非常重要的膜通道。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Piezo1可以介導(dǎo)軟骨細(xì)胞膜受到牽張力所形成的內(nèi)電流，從而證實(shí)了其在軟骨細(xì)胞力學(xué)傳導(dǎo)中的作用［4］。KOA 患者膝關(guān)節(jié)力的傳導(dǎo)和分布出現(xiàn)異常，可使軟骨細(xì)胞受到異常的機(jī)械牽張應(yīng)力，從而導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的過度凋亡［5-6］。細(xì)胞學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)軟骨細(xì)胞施加不同時(shí)長(zhǎng)的機(jī)械牽張應(yīng)力，可以激活Piezo1 通道，從而介導(dǎo)軟骨細(xì)胞的凋亡［7-8］。但是目前并無動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)此加以印證。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酪氨酸激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與激活子3（JAK2-STAT3）信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［9-12］，但是目前Piezo1 與JAK2 在軟骨細(xì)胞凋亡過程中的作用鮮見相關(guān)報(bào)道。2021 年1 月—7 月，我們觀察了Piezo1/JAK2 信號(hào)通路與KOA 大鼠軟骨細(xì)胞凋亡的關(guān)系?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試劑及儀器 清潔級(jí)成年雄性SD 大鼠50 只，體質(zhì)量（120 ± 10）g，購于山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK（魯）20110014。普通飲食飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20~25 ℃，晝夜明暗交替時(shí)間為12 h/12 h。蘇木精染色試劑盒（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），小鼠抗大鼠Piezo1一抗、小鼠抗大鼠JAK2 一抗、小鼠抗大鼠p-JAK2 一抗、Caspase-3 抗體試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒（美國領(lǐng)先化學(xué)公司），HRP 標(biāo)記的二抗、DAB 染色試劑盒、抗地高辛抗體、蛋白電泳Marker（濟(jì)南檸檬生物技術(shù)有限公司），固綠染色液、番紅O染色液、酶標(biāo)儀（杭州昊鑫生物科技股份有限公司），照相顯微鏡（日本佳能公司），Image-Pro plus6.0 系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）。

1.2 動(dòng)物分組與模型構(gòu)建 將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（10只）和模型組（40只）。模型組采用Hulth 法建立大鼠KOA 模型［13］，手術(shù)當(dāng)天大鼠禁食不禁水，將其仰臥固定于手術(shù)臺(tái)上，經(jīng)腹腔注射氯胺酮（100~200 mg/kg）麻醉后剪除其右后肢膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)絨毛，于髕骨內(nèi)側(cè)剪開皮膚，手術(shù)切口約1 cm長(zhǎng)，逐層尋找膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶，充分暴露內(nèi)側(cè)副韌帶后將其剪斷；切開關(guān)節(jié)囊，觀察大鼠是否存在原發(fā)性膝關(guān)節(jié)病變，剔除存在膝關(guān)節(jié)病變大鼠。將整個(gè)內(nèi)側(cè)半月板完整切除，采用虹膜剪將大鼠前后交叉韌帶剪斷。常規(guī)縫合手術(shù)切口，無菌包扎固定。術(shù)后肌注青霉素80 000 U，1 次/天，連續(xù)肌注3 d。傷口每日換藥1次，連續(xù)換藥7 d。術(shù)后第2 天正常飲食飲水，每天觀察大鼠傷口有無感染和動(dòng)物跛行情況，并強(qiáng)迫驅(qū)趕動(dòng)物活動(dòng)30 min。假手術(shù)組充分麻醉后立即取出右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織，再斷頸處死。模型組分別于術(shù)后7、30、60、90 d 各取10 只斷頸處死，分別取出右后肢膝關(guān)節(jié)軟骨組織。所有軟骨組織置于10%甲醛以及-80°C冰箱中備用。

1.3 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化觀察 采用番紅O-固綠染色法［14-15］。切除的關(guān)節(jié)軟骨組織用生理鹽水洗滌，拭干后用10%甲醛溶液固定24 h，以防抗原丟失；將軟骨組織放入混合酸脫鈣液中脫鈣24 h；常規(guī)石蠟包埋，切片（厚度5 μm）。石蠟切片65 ℃脫水4 h，用不同濃度二甲苯和乙醇自動(dòng)脫蠟至水；滴加蘇木精，細(xì)胞核染色1~3 min，鏡下觀察染色深淺情況以調(diào)整染色時(shí)間；用自來水洗滌殘留的蘇木精；滴加鹽酸乙醇分化液，分化20 s，自來水洗滌；滴加0.02%固綠水溶液，使細(xì)胞外基質(zhì)染色3 min，1%冰醋酸洗滌3 次，滴加0.1%番紅水溶液，3 min 后95%乙醇浸洗，無水乙醇脫水；二甲苯透明3 次，每次2 min，中性樹膠封片。用顯微鏡（×200）觀察關(guān)節(jié)軟骨的結(jié)構(gòu)、色澤及各層軟骨細(xì)胞的形狀、數(shù)量、排列、壞死程度等。

1.4 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用TUNEL 染色法。在烤片機(jī)將待染色切片在65 ℃烘烤2 h，常規(guī)二甲苯脫蠟劑脫蠟2 次；分別用無水乙醇、90%乙醇、85%乙醇和75%乙醇脫水，直至脫蠟水化完全，PBS 浸 泡 5 min。 滴 加 3% H2O2，10 min 后 滴 加Proteinase K 工作液，37 ℃恒溫消化10 min。每張切片滴加Labeling buffer標(biāo)記的緩沖液20μL以保持其濕潤，配制工作液后甩去多余液體，然后每張切片加工作液20 μL，濕盒內(nèi)37 ℃恒溫孵育2 h；滴加封閉液50μL，封閉30 min；滴加稀釋的生物素化的抗地高辛抗體（1∶100 稀釋）50 μL，濕盒37 ℃恒溫孵育2 h。滴加SABC 抗體稀釋液（1∶100 稀釋）10 μL，濕盒37 ℃恒溫孵育2 h。滴加DAB 顯色工作液（試劑A、B、C 各50 μL，溶于 1 000 μL 蒸餾水），顯色10~15 min，呈棕黃色顆粒狀時(shí)顯色完全，蘇木精復(fù)染3 s。梯度脫水透明處理后，室溫晾干后中性樹膠小心封片，注意避免留氣泡和溢膠，晾干。200 倍光學(xué)顯微鏡下觀察，用Image-Pro plus6.0 軟件分析陽性染色面積，并根據(jù)陽性染色情況判斷軟骨細(xì)胞凋亡程度。TUNEL 染色陽性區(qū)域范圍越大，軟骨細(xì)胞凋亡程度越嚴(yán)重。

1.5 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞破壞程度評(píng)價(jià) 采用Mankin's 評(píng)分，通過膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化的情況評(píng)價(jià)大鼠 KOA 模型［16］。Mankin's 評(píng)分越高，軟骨細(xì)胞破壞越嚴(yán)重。

1.6 膝關(guān)節(jié)軟骨組織中Piezo1、JAK2、p-JAK2、Caspase-3 蛋白表達(dá)檢測(cè) 采用Western blotting 法。將膝關(guān)節(jié)軟骨組織置冰上，用顯微剪將組織剪碎，按20 mg 組 織 加 入 200 μL 裂 解 液 和 PMSF 混 合 液（100∶1），研磨器研磨組織；組織裂解完全后，轉(zhuǎn)移至EP管中，15 000 r/min離心30 min（離心半徑10 cm）；吸取上清液2 μL，用蒸餾水稀釋，檢測(cè)蛋白濃度。BCA法測(cè)定蛋白濃度，緩慢加入電泳緩沖液，用70 V恒壓預(yù)電泳30 min。向側(cè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)Marker 蛋白，首先30 V 恒壓電泳，待樣品濃縮在濃縮膠與分離膠之間并呈一條線后，調(diào)整電壓為100 V，溴酚藍(lán)條至膠板下緣時(shí)，停止電泳。將大小適宜的PVDF膜浸泡于甲醇中10 min，按順序安裝后閉合夾子，將夾子置轉(zhuǎn)膜槽，電壓100 V，電流220 mA 進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。將轉(zhuǎn)膜的PVDF 膜在含5%脫脂牛奶的TBST 緩沖液浸泡，室溫封閉1 h，傾去封閉液，然后將PVDF 膜浸泡在稀釋好的小鼠抗大鼠Piezo1、JAK2、p-JAK2 及Caspase-3 一抗（稀釋比均為 1∶100）中，水平搖床4 ℃過夜，第2 天回收。加入HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG 熒光二抗（稀釋比1∶100），室溫孵育1 h，棄去二抗加入ECL 發(fā)光液，以GAPDH 為內(nèi)參照。Image J 軟件分析蛋白電泳條帶灰度值。蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白電泳條帶灰度值/內(nèi)參照蛋白電泳條帶灰度值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料用表示，多組比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；指標(biāo)間的相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理變化比較 假手術(shù)組軟骨正常呈紅色，軟骨下骨呈藍(lán)色。番紅O-固綠染色可見軟骨縱切片潮線，潮線上方透明軟骨，潮線下方鈣化層，鈣化層底部粘合線界限明顯。潮線與粘合線口間可見齒梳樣結(jié)構(gòu)鈣化軟骨，厚度可達(dá)300μm，薄處不足10μm，結(jié)構(gòu)致密，潮線附近可見少量肥大軟骨細(xì)胞。術(shù)后7~90 d，模型組膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨破壞逐漸加重。術(shù)后7 d，關(guān)節(jié)軟骨變?yōu)榉奂t色，出現(xiàn)多條潮線，鈣化層增厚；術(shù)后30 d，鈣化層進(jìn)一步變寬，伴少量血管顯現(xiàn)；術(shù)后60~90 d，鈣化層及非鈣化層進(jìn)一步退變，表現(xiàn)為局部有纖維樣增生潮線距離進(jìn)一步增大，軟骨細(xì)胞明顯減少并集中在潮線附近。

2.2 兩組軟骨細(xì)胞凋亡情況 假手術(shù)組及術(shù)后7、30、60、90 d 模型組 TUNEL 染色陽性區(qū)域分別為（3.17 ± 0.05）% 、（10.98 ± 2.01）% 、（18.62 ±4.37）%、（25.34 ± 6.81）%、（47.55 ± 7.10）%。與假手術(shù)組比較，術(shù)后7、30、60、90 d模型組TUNEL 染色陽性區(qū)域均增大（P均＜0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)TUNEL染色陽性區(qū)域逐漸增大。

2.3 兩組軟骨破壞情況比較 假手術(shù)組及術(shù)后7、30、60、90 d 模型組 Mankin's 評(píng)分分別為（0.36 ±0.08）、（4.75 ± 0.72）、（7.67 ± 0.22）、（9.07 ±0.32）、（10.67 ± 0.22）分。與假手術(shù)組比較，術(shù)后7、30、60、90 d 模型組 Mankin's 評(píng)分均高（P均＜0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)Mankin's評(píng)分逐漸升高。

2.4 兩組膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，術(shù)后7、30、60、90 d 模型組 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)均高（P＜0.05），且隨時(shí)間延長(zhǎng)各蛋白表達(dá)逐漸升高。見表1。

表1 兩組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

表1 兩組膝關(guān)節(jié)軟骨組織Piezo1、JAK2、p-JAK2及Caspase-3蛋白表達(dá)比較（）

注：與假手術(shù)組比較，P＜0.05。

組別假手術(shù)組模型組術(shù)后7 d術(shù)后30 d術(shù)后60 d術(shù)后90 d n 10 Piezo1 0.21±0.02 JAK2 0.23±0.02 p-JAK2 0.24±0.01 Caspase-3 0.20±0.01 0.26±0.03*0.27±0.01*0.31±0.05*0.56±0.07*10 10 10 10 0.25±0.02*0.26±0.05*0.32±0.08*0.60±0.09*0.27±0.03*0.30±0.07*0.39±0.05*0.60±0.09*0.27±0.02*0.31±0.05*0.38±0.04*0.59±0.08*

2.5 軟骨細(xì)胞凋亡情況與Mankin's 評(píng)分及Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)的關(guān)系 Pear-son 相關(guān)分析結(jié)果顯示，關(guān)節(jié)軟骨TUNEL 染色陽性區(qū)域與 Mankin's 評(píng)分（r=0.781，P＜0.05）、Piezo1 蛋白表達(dá)（r=0.577，P＜0.05）、JAK2 蛋白表達(dá)（r=0.725，P＜0.05）、p-JAK2 蛋白表達(dá)（r=0.798，P＜0.05）以及Caspase-3 蛋白表達(dá)（r=0.691，P＜0.05）存在正相關(guān)關(guān)系。

3 討論

KOA 是臨床最常見的一種無菌性炎癥性骨關(guān)節(jié)病，是由多種因素導(dǎo)致的一種以軟骨破壞、軟骨下骨骨化或囊性變、滑膜炎癥、關(guān)節(jié)囊攣縮、肌無力等為特征的慢性疾病。目前，大多數(shù)研究者認(rèn)為，生物力學(xué)因素在KOA 的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用［17］。膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞能夠感受力學(xué)的變化，通過力敏感離子通道激活相關(guān)的信號(hào)傳導(dǎo)通路影響軟骨細(xì)胞的分化、凋亡等，從而影響KOA 的病程發(fā)展與變化［18］。

KOA 的發(fā)生發(fā)展與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是KOA 發(fā)生發(fā)展的重要病理機(jī)制之一，已經(jīng)成為了目前研究的熱點(diǎn)。KOA 軟骨細(xì)胞凋亡的機(jī)制與信號(hào)通路的研究越來越受到重視。Piezo 離子通道屬于機(jī)械敏感性離子通道，可將細(xì)胞膜接收到的機(jī)械力學(xué)信號(hào)、電信號(hào)或化學(xué)信號(hào)，傳遞至胞內(nèi)，引起一系列 生化 反應(yīng)［19］，并 能 調(diào)節(jié) 細(xì)胞 體積 的穩(wěn) 態(tài)［20］。Piezo1 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中幾乎無處不在，是一種非常重要的膜通道，軟骨細(xì)胞受到細(xì)胞外界環(huán)境中的力學(xué)刺激后通過Piezo1影響其增殖、分化及凋亡［21］。軟骨細(xì)胞中Piezo1、Piezo2 高表達(dá)，在軟骨細(xì)胞中應(yīng)用 siRNA 能夠抑制 Piezo1 和 Piezo2 表達(dá)，從而消除機(jī)械反應(yīng)。同時(shí)，通過原子力顯微鏡/Ca2+成像平臺(tái)檢測(cè)Ca2+流入的機(jī)械響應(yīng)發(fā)現(xiàn)，Piezo1 和Piezo2 均可導(dǎo)致軟骨細(xì)胞在超生理壓迫下的機(jī)械轉(zhuǎn)導(dǎo)［22］。因此，本研究復(fù)制了大鼠KOA 模型，圍繞不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠軟骨細(xì)胞Piezo1的變化展開研究。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，對(duì)細(xì)胞膜施以不同的牽張力可以激活Piezo1，加快膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡［7-8］。本實(shí)驗(yàn)中，我們觀察了不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Piezo1 的表達(dá)，并與軟骨細(xì)胞凋亡進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)二者具有正相關(guān)性，與文獻(xiàn)［7-8］報(bào)道一致。

JAK 蛋白包括 JAK1、JAK2、JAK3 以及 Tyk2。JAK 包含 1 個(gè) FERM 域、1 個(gè) SH2 相關(guān)域、1 個(gè)激酶結(jié)構(gòu)域和1 個(gè)假激酶域。其中激酶域?qū)AK 活性至關(guān)重要，因?yàn)橹挥型ㄟ^激酶域才能使JAK 磷酸化。JAK-STAT通路的研究主要集中在炎癥性疾病、影響免疫系統(tǒng)的疾病及腫瘤性疾病，關(guān)于關(guān)節(jié)軟骨凋亡的研究較少，目前主要集中在JAK2-STAT3 這個(gè)通路。通過檢索共發(fā)現(xiàn)4 篇文獻(xiàn)認(rèn)為JAK2-STAT3 信號(hào)通路與軟骨細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［9-12］。我們研究發(fā)現(xiàn)，隨著KOA 的進(jìn)展，JAK2 蛋白表達(dá)升高，這與以上文獻(xiàn)［9-12］結(jié)果一致。同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)，JAK2 蛋白表達(dá)升高與軟骨細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，JAK2蛋白表達(dá)越高，軟骨細(xì)胞凋亡越嚴(yán)重。Caspase途徑是細(xì)胞凋亡的主要途徑［23］，Caspase-3 在細(xì)胞凋亡中起至關(guān)重要的作用，是細(xì)胞凋亡過程中最重要的終末剪切酶，被稱為“死亡蛋白酶”，主要在凋亡的執(zhí)行階段發(fā)揮重要作用，損傷DNA，導(dǎo)致其復(fù)制、轉(zhuǎn)錄及修復(fù)受到嚴(yán)重?fù)p害［24-25］。陳喜德等［26］用大鼠制作 KOA 模型，采集不同時(shí)間段模型鼠的軟骨組織，并檢測(cè)Caspase-3蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Caspase-3與軟骨細(xì)胞凋亡程度呈正比。本研究結(jié)果與文獻(xiàn)［26］報(bào)道一致。

本研究構(gòu)建了KOA 大鼠模型，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨TUNEL 染色的陽性區(qū)域也隨之增加，Mankin's評(píng)分逐漸升高，提示大鼠膝關(guān)節(jié)的病理性破壞程度逐漸加重，KOA 逐漸進(jìn)展。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著骨關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展，KOA 大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)Piezo1蛋白表達(dá)也隨之升高，并伴有JAK2的激活。Pearson相關(guān)性分析顯示，關(guān)節(jié)軟骨TUNEL染色的陽性區(qū)域與 Piezo1、JAK2、p-JAK2 及 Caspase-3 蛋白表達(dá)存在明顯的正相關(guān)關(guān)系。說明Piezo1/JAK2信號(hào)通路可能參與了KOA 膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的凋亡過程。

在研究過程中，因考慮雌性大鼠性別或體內(nèi)激素水平可能對(duì)本實(shí)驗(yàn)造成的影響，本實(shí)驗(yàn)未選用雌性大鼠。同時(shí)，因?qū)嶒?yàn)條件受限，樣本量較少；也未能對(duì)JAK2 的下游信號(hào)STAT3 做進(jìn)一步研究，這將是我們未來研究的方向。