熟地黃水提液通過外泌體miR-29a-3p調節(jié)OVX大鼠的脂代謝*

梁梓雯， 胡雪靈， 鐘文強， 羅冰潔， 潘 琪， 林 青， 李小云， 王攀攀，朱曉峰， 蔡 宇， 張榮華△， 楊 麗△

（1暨南大學藥學院，廣東 廣州 510632；2暨南大學中醫(yī)學院，廣東 廣州 510632）

肥胖是一種慢性代謝性疾病，以體內脂肪細胞的體積和數(shù)量增加、體內脂肪尤其是甘油三酯（triglyceride，TG）在某些局部積聚過多為主要表現(xiàn)。肥胖即是獨立疾病，又是2 型糖尿病、高血壓以及各種癌癥的重要誘因［1］。肥胖可由多種因素引起，其中一個重要誘因是雌二醇（estradiol，E2）水平的降低。

在正常狀態(tài)下，E2可以通過調節(jié)脂蛋白脂肪酶的合成、過氧化物酶體增殖物激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）的 表達、葡萄糖轉運蛋白4 的表達等方式［2］，維持不同部位的脂代謝穩(wěn)態(tài)。因此，內源性E2水平降低的狀態(tài)下，脂代謝的狀態(tài)也會受到嚴重影響。有研究表示，與絕經(jīng)前女性相比，絕經(jīng)后女性具有更高的總脂肪量、脂肪百分比和中心脂肪積累［3］。另外一份研究報告則表示，絕經(jīng)前和絕經(jīng)后女性的身體質量指數(shù)（body mass index，BMI）相似，但絕經(jīng)后女性的腰圍較大［4］。一項基于1 049 919 樣本量的Meta 分析也發(fā)現(xiàn)，絕經(jīng)后女性的腹圍和內臟脂肪均顯著高于絕經(jīng)前女性，且脂肪組織趨于向身體中心聚集［5］。這些臨床表現(xiàn)提示，絕經(jīng)后女性體內E2的降低，不僅可導致脂肪重量增加，還可促使脂肪重新分布。

雙側卵巢切除術（ovariectomy，OVX）因能模擬人體低E2狀態(tài)引發(fā)胰島素抵抗、腹部肥胖和骨質疏松等疾病，從而成為模擬人類女性更年期表征最好、報道最多的動物模型［6］。OVX 是研究E2與脂代謝關系的經(jīng)典造模方法。Shin 等［7］發(fā)現(xiàn)，OVX 小鼠血清E2水平降低，同時伴隨小鼠體重、內臟脂肪、肝臟脂質積累和脂肪組織中巨噬細胞浸潤增加，其機制可能是在E2降低的狀態(tài)下，內臟脂肪中PPARα 抑制其下游多個與脂肪酸（fatty acids，F(xiàn)A）的β 氧化相關基因的表達，導致FA 在內臟脂肪中積累［8］。另一項研究表明，OVX 大鼠下丘腦抵抗5-羥色胺的刺激，因此攝食量增加導致肥胖的出現(xiàn)［9］。

中醫(yī)認為，絕經(jīng)前后女性天癸將竭，腎氣漸虛，沖任衰少，陰陽失衡，會出現(xiàn)心悸、煩熱和失眠等癥狀，多為肝腎陰虛所致［10］。因此，中醫(yī)多采用滋陰補腎法治療更年期綜合征。熟地黃（Rehmanniae Radix Praeparata，RR）因其補血滋陰和益精填髓的功能，常用于更年期綜合征的治療，有研究顯示RR 是治療該病中臨床使用率最高的中藥［11］。因此，本研究選用RR 水提液調節(jié)OVX 大鼠的脂代謝紊亂并探索其作用機制。

材料和方法

1 動物分組和造模

1.1 動物分組 3月齡SPF 級Sprague-Dawley 雌性大鼠40 只，購自廣州中醫(yī)藥大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（粵）2018-0034，飼養(yǎng)于SPF 級實驗動物飼養(yǎng)環(huán)境，實驗動物使用許可證號（23±2）℃、45%～50%條件下自由飲水和攝食，每籠4只；適應性喂養(yǎng)1 周后將大鼠隨機分成5 組，分別為假手術（sham）組、OVX 模型組、RR 水提液低劑量（RR-L）組、RR 水提液中劑量（RR-M）組和RR 水提液高劑量（RR-H）組，每組8 只，對大鼠行假手術或OVX，藥物灌胃12周后取材。

1.2 大鼠雙側去卵巢模型的建立與分組 參照文獻［12］進行，大鼠術前12 h禁食不禁水，手術前對大鼠進行稱重，采用3%戊巴比妥鈉1.5 mL/kg 進行腹腔注射，麻醉后，將大鼠仰臥位固定，沿腹白線切口打開腹腔約2～3 cm，找到“Y”型子宮，沿每側子宮找到粉紅色綠豆大小的卵巢，將卵巢周圍的脂肪剝離，在卵巢和子宮交接處結扎后徹底切除兩側卵巢，sham 組則僅切除卵巢周圍同等體積脂肪組織，用棉球止血后逐層縫合皮膚。術后大鼠放回籠中等待蘇醒。

2 藥物鑒定與制備

2.1 RR飲片質量鑒定 根據(jù)2020版《中國藥典》中的鑒定方法對購買的RR飲片進行質量鑒定。

以地黃苷D（CAS 號：81720-08-3）為對照品制備對照品溶液，按照2020 版《中國藥典》制備樣品溶液，色譜條件：以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇-0.1%磷酸溶液（5：95）為流動相，檢測波長為203 nm，柱溫為30 ℃，上樣量為10 μL。

2.2 RR 水提液的制備 根據(jù)動物體重的變化，藥物分3 次制備，每4 周制備1 次，制得濃縮藥液存放于-80 ℃冰箱，剩余飲片存放于4 ℃冷藏。參照文獻［13］，具體制備方法如下：藥物稱量后加入8 倍量的水浸泡30 min，電熱爐100 ℃加熱30 min；第2 次加7倍量的水，電熱爐100 ℃加熱20 min；合并2 次提取液后用濾網(wǎng)過濾藥渣，于旋轉蒸發(fā)儀中減壓濃縮至濃度為1 g/mL的浸膏，迅速分裝后于-80 ℃保存。動物給藥劑量按照人-動物體表面積進行換算，參照2020 版《中國藥典》的成人建議給藥量15 g·70 kg-1·d-1換算得大鼠灌胃劑量，RR-L 組為0.45 g·kg-1·d-1，RR-M 組 為1.35 g·kg-1·d-1，RR-H 組 為4.05 g·kg-1·d-1。

3 主要試劑

RR 飲片購自北京深港藥業(yè)有限公司；地黃苷D購自四川維克奇生物科技有限公司；大鼠雌二醇ELISA 試劑盒和大鼠胰島素ELISA 試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；甘油三酯測定試劑盒、總膽固醇測定試劑盒、高密度脂蛋白測定試劑盒和低密度脂蛋白測定試劑盒購自深圳雷杜生命科學股份有限公司；兔抗大鼠β-actin Ⅰ抗、PPARγ 兔抗大鼠Ⅰ抗、LRP5 兔抗大鼠Ⅰ抗、GSK3β 兔抗大鼠Ⅰ抗和p-GSK3β（Ser 9）兔抗大鼠Ⅰ抗購自CST；TNF-α小鼠抗大鼠Ⅰ抗、CD63 小鼠抗大鼠Ⅰ抗和Alix 兔抗大鼠Ⅰ抗購自Novusbio；CD9 兔抗大鼠Ⅰ抗、SFRP1 兔抗大鼠Ⅰ抗和HRP 標記羊抗兔Ⅱ抗購自Abcam；IL-1β 兔抗大鼠Ⅰ抗購自愛必信（上海）生物科技有限公司；HRP 標記羊抗小鼠Ⅱ抗購自康為世紀生物科技股份有限公司；ExoQuick ?試劑盒購自SBI；miRNA 第一鏈cDNA 合成試劑盒和引物購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

4 指標檢測

4.1 大鼠血脂水平 用無添加取血管進行腹主動脈采血，室溫靜置2 h 后，3 000 r/min 離心15 min，得到大鼠血清；采取臨床全自動生化分析儀檢測檢測總膽固醇（total cholesterol，TC）、TG、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）和低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）水平。

4.2 大鼠血清E2和胰島素水平 根據(jù)大鼠雌二醇ELISA 試劑盒及大鼠胰島素ELISA 試劑盒說明書對大鼠血清樣本進行處理并檢測。向孔中加入標準品/樣品后37 ℃避光孵育30 min；洗滌后加入酶標試劑；37 ℃避光孵育30 min；加入顯色劑后37 ℃避光顯色15 min；最后加入終止液終止反應，酶標儀測量吸光度并計算。

4.3 大鼠肝臟和腹部脂肪組織HE 染色 取材時，將取出的肝臟和腹部脂肪組織浸入多聚甲醛中，4 ℃下固定，對組織進行適當切割后流水下沖洗，去除多聚甲醛；于50%、60%、70%和80%乙醇中分別脫水1 h；95%和100%乙醇中分別脫水40 min，2次；在二甲苯中透明后，對組織進行包埋和切片；依次將切片放入二甲苯中20 min，2 次；無水乙醇5 min，2 次；75%乙醇5 min；自來水洗滌后，將切片放入蘇木素染液中染3～5 min；自來水洗滌；分化液分化；自來水洗滌；返藍液返藍；再將切片依次放入85%、95%的梯度乙醇中脫水各5 min 后，放入伊紅染液中染色5 min；依次將切片放入無水乙醇中5 min，3 次；二甲苯中5 min，2 次；使之透明后用中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照。

4.4 大鼠肝臟油紅O 染色 取材時，將取出的肝臟放在干冰中速凍。實驗前將肝臟從-80℃冰箱中取出，用手術刀將組織修平整；在周圍滴上OCT包埋劑后用冰凍切片機進行速凍包埋；切片后在固定液中固定15 min；油紅染液浸染8～10 min；60%異丙醇分化；蘇木素復染3～5 min；分化液中分化2～8 s；返藍液中返藍1 s；洗滌后鏡下檢查染色效果并在顯微鏡下進行圖像采集分析。

4.5 血清外泌體的提取 按照外泌體提取試劑盒說明書，吸取250 μL 血清于新的滅菌EP 管中，并加入63 μL ExoQuick 試劑后上下顛倒離心管，混勻；4 ℃孵育30 min 后，4 ℃，1 500 ×g離心30 min，管底可見白色沉淀，即為外泌體，吸去上清液；1 500 ×g繼續(xù)離心5 min，小心去除殘余的液體組分，加入500 μL PBS重懸沉淀。

4.6 RT-qPCR 檢測脂代謝相關基因的表達 用Trizol 法提取大鼠腹部脂肪組織的總RNA 后，取800 ng 總RNA，加入3 μL 逆轉錄試劑（包括1 μL gDNA Clean Reagent 和2 μL 5×gDNA Buffer），并用RNase free water 補足至10 μL，逆轉錄后加入上下游引物（各0.4 μL）、SYBR Premix EX Taq Ⅱ10 μL、RNase free water 8.8 μL 后進行實時熒光定量PCR。進行Ploy（A）加尾反應和逆轉錄反應時，逆轉錄反應體系為：2×miRNA RT Solution mix 10 μL、miRNA RT Enzyme mix 2 μL、micro RNA 100 ng、RNase free water 加至20 μL，逆轉錄得到cDNA 后再進行實時熒光定量PCR。利用2-ΔΔCt法計算各基因的相對表達水平。

4.7 Western blot 檢測脂代謝相關蛋白 將大鼠腹部脂肪組織從-80 ℃冰箱取出，剪取適量組織放入液氮中研磨，研磨充分后裝入1.5 mL EP 管中，并向其中加入400 μL 配好的RIPA 裂解液（含1% PMSF 和1%磷酸酶抑制劑）；冰上裂解20 min 后離心，取上清；用BCA法測定各樣品蛋白濃度后，將蛋白濃度調至一致，并加入5×蛋白上樣緩沖液混勻后變性。將等量樣品加至10%SDS-PAGE 上進行分離、轉膜、封閉后于4 ℃孵育Ⅰ抗過夜。次日將條帶從Ⅰ抗取出并用TBST 洗滌后，用相應的Ⅱ抗進行室溫孵育1 h，取出；TBST 洗滌；超靈敏ECL 化學發(fā)光試劑顯色；于凝膠成像系統(tǒng)中成像，并用配套軟件Image Lab 進行灰度值分析。

5 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)通過SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進行分析，所有實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。兩組間差異采用非配對t檢驗進行評估，各組多變量之間的比較使用單因素方差分析（One-way ANOVA）進行檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

1 熟地黃飲片的質量鑒定

使用分析性液相色譜儀對RR 飲片中的地黃苷D 進行含量測定，結果見圖1。對照品出峰時間約為39 min，對照品溶液的濃度分別為16、32、48、64、80 mg/ L，對應峰面積分別為108.65811、226.05743、332.17926、456.75543、591.25354 mAU*s，對其作標準曲線得y=7.4743x-15.786（R2=0.9982），樣品溶液在該處峰面積為240.0496 mAU*s，代入得飲片中地黃苷D 含量為0.0855%，符合標準，該批飲片可用于水提液的制備及后續(xù)實驗。

Figure 1. Liquid chromatogram of RR.圖1 RR液相色譜圖

2 各組大鼠血清E2水平及子宮系數(shù)

為了觀察給藥后大鼠體內的E2變化，用ELISA法測定血清E2水平，發(fā)現(xiàn)OVX組顯著低于sham組（P＜0.05），說明雙側去卵巢手術使大鼠血清E2顯著減少；給藥后各組的血清E2水平顯著回升（P＜0.05），且RR-L組血清E2水平高于sham 組（P＜0.05），見圖2A。麻醉大鼠后剝離sham、OVX、RR-L、RR-M 及RR-H 組的子宮進行稱重和拍照，計算子宮系數(shù)，結果如圖2所示，OVX 組大鼠子宮出現(xiàn)明顯萎縮，給藥后依然呈現(xiàn)萎縮狀態(tài)，OVX 組與給藥組的子宮系數(shù)顯著低于sham組（P＜0.05），與子宮狀態(tài)相符。

3 各組大鼠體重及腹圍變化

在給藥干預的12 周內，每周稱1 次體重，并在第12 周時測量腹圍，結果見圖3。各組體重均呈增長趨勢，其中OVX、RR-L、RR-M 和RR-H 組的增長幅度均比sham 組高（P＜0.05）。在第1 周時，OVX、RR-L和RR-M 組的體重顯著高于sham 組和RR-H 組（P＜0.05），但從第2 周開始，其他4組大鼠的體重均顯著高于sham 組（P＜0.05）。在第12 周時，OVX 組的腹圍顯著大于sham 組（P＜0.05），而RR-M 組較OVX 組腹圍顯著降低（P＜0.05），但其他兩個劑量的給藥組則未顯著降低（P＞0.05）。

4 各組大鼠血脂四項和胰島素水平變化

進一步對血清中的血脂四項和胰島素（insulin，INS）進行測定。結果顯示，OVX 組的INS、TC 和LDL-C 水平均顯著高于sham 組（P＜0.05），但TG 和HDL-C 則無顯著變化（P＞0.05）；與OVX 組相比，RR水提液給藥后可顯著降低INS 和LDL-C 水平（P＜0.05），但并未降低TC水平（P＞0.05），見圖4。

Figure 2. The level of serum E2（A）and the morphology and index（B）of uterus. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖2 血清E2水平、子宮形態(tài)與系數(shù)

Figure 3. The body mass（A）and abdominal circumference（B）in rats. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖3 大鼠的體重及腹圍

Figure 4. Lipid metabolism indicators in serum. The level of INS，TC，TG，HDL-C and LDL-C were detected. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖4 血清中的脂代謝指標

5 各組大鼠肝臟組織形態(tài)變化

肝臟作為脂代謝的重要器官，其中的脂質積累水平也可反映體內的脂代謝水平。為了觀察肝臟的狀態(tài)，對肝臟進行HE 染色發(fā)現(xiàn)，sham 組大鼠肝臟大部分細胞形態(tài)完好、排列緊密有規(guī)則；而OVX 組有較多脂肪細胞空泡，并出現(xiàn)較多炎癥浸潤細胞；RRL、RR-M 和RR-H 組脂肪空泡較OVX 組少，但依然存在部分炎癥浸潤細胞（圖5A）。進一步對肝臟進行油紅O 染色發(fā)現(xiàn)，OVX 組的脂質積累較sham 組增多，給藥后脂質積累減少，且RR-M 組減少量較其他兩組明顯（圖5B）。綜上，后續(xù)實驗選用中劑量RR水提液進行后續(xù)機制研究。

Figure 5. Liver metabolic status. HE staining（200×）and Oil red O staining（200×）were used to observe the liver metabolic status in rats.圖5 肝臟代謝狀態(tài)

6 大鼠腹部脂肪細胞的變化

腹部脂肪HE染色結果顯示，OVX組大鼠腹部脂肪細胞體積明顯增大，細胞間排列緊密；給藥后脂肪細胞體積減小，細胞間隙增大，見圖6A。對各組脂肪細胞面積進行定量分析，發(fā)現(xiàn)OVX 組的面積顯著大于sham 組（P＜0.05），RR 組的面積則顯著低于OVX 組；但與sham 組比較無顯著差異（P＞0.05），見圖6B。

Figure 6. HE staining of abdominal adipose in rats（×200）. Mean±SD. n=5.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖6 腹部脂肪HE染色

腹部脂肪細胞的形成與脂形成相關基因PPARγ有關，其代謝功能與炎癥因子腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和肥胖相關因子-糖蛋白非轉移性黑色素瘤蛋白B（glycoprotein non-metastatic melanoma protein B，GPNMB）有關，因此對以上基因在腹部脂肪中的表達水平進行檢測。

RT-qPCR 結果顯示，OVX 組大鼠脂肪中的PPARγ、TNF-α、IL-1β 和GPNMB 的mRNA 表達量均顯著高于sham 組（P＜0.05）；RR 水提液能顯著降低以上基因的轉錄水平（P＜0.05），見圖7。

Western blot 結果的趨勢與RT-qPCR 結果的趨勢相似，OVX 組脂肪組織中的PPARγ、TNF-α 和IL-1β蛋白表達量均顯著高于sham組（P＜0.05）；給藥后該趨勢被逆轉（P＜0.05），見圖8。

7 血清外泌體的鑒定及其中miR-29a-3p 的差異表達

通過透射電子顯微鏡觀察到，通過試劑盒提取方法可提取到呈雙層膜結構、直徑小于200 nm 的囊泡（圖9A）。激光納米粒度儀結果顯示，提取產(chǎn)物的平均直徑為100 nm，且絕大部分不超過200 nm（圖9B）。Western blot 結果顯示，該產(chǎn)物高表達CD63、CD9和Alix 蛋白（圖9C）。以上結果說明該產(chǎn)物為外泌體，使用該提取方法可成功提取血清中的外泌體。

根據(jù)本課題組以往的實驗結果，對各組血清外泌體中的miR-29a-3p 的表達量進行驗證，發(fā)現(xiàn)OVX組中miR-29a-3p 的表達量明顯降低（P＜0.05）；給藥后miR-29a-3p 的水平明顯升高（P＜0.05），因此認為RR 水提液可能通過調節(jié)血清外泌體中的miR-29a-3p水平從而對腹部脂肪代謝起作用（圖9D）。

Figure 7. Relative mRNA expression of PPARγ，TNF-α，IL-1β and GPNMB in abdominal adipose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖7 腹部脂肪中PPARγ、TNF-α、IL-1β和GPNMB的mRNA表達

Figure 8. The protein expression of PPARγ，TNF-α and IL-1β in abdominal adipose. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖8 腹部脂肪中PPARγ、TNF-α和IL-1β的蛋白表達

8 腹部脂肪中的miR-29a-3p 及其靶基因核因子I A（nuclear factor I A，NFIA）的表達

為了探討RR 水提液是否通過血清外泌體中的miR-29a-3p 對OVX 大鼠起到調節(jié)脂代謝的作用，利用RT-qPCR 法對3 組大鼠的腹部脂肪中的miR-29a-3p 進行定量分析。結果顯示，miR-29a-3p 在OVX 組大鼠的腹部脂肪中的表達量顯著低于sham 組（P＜0.05）；給藥后miR-29a-3p 表達水平得到顯著提高（P＜0.05），見圖10A。因此說明RR 水提液可通過富集血清外泌體中的miR-29a-3p，從而提高腹部脂肪中的miR-29a-3p水平，進而調節(jié)脂代謝。

由于miR-29a-3p 在人與大鼠之間具有高度保守性，因 此 利 用rno-miR-29a-3p 和has-miR-29a-3p 在TargetScan 8.0［14］、miRWalk 3.0［15］和DIANA-microT 5.0［16-17］數(shù)據(jù)庫中檢索與去除重復值后，篩選得到靶基因NFIA。對NFIA 在脂肪中的表達進行驗證，發(fā)現(xiàn)OVX 組的NFIA 在腹部脂肪中的mRNA 表達量均顯著高于sham 組（P＜0.05）；該表達量在RR 組則顯著低于OVX 組（P＜0.05），表達趨勢與miR-29a-3p 相反，說明NFIA 可能是miR-29a-3p 的靶基因，見圖10B。

Figure 9. Identification of serum exosome and the expression of miR-29a-3p in it. Transmission electron microscope（A），laser nanoparticle size analyzer（B）and Western blot（C）were used for exosome identification. The expression of miR-29a-3p in exosome was detected by RT-qPCR（D）. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖9 血清外泌體的鑒定及其中miR-29a-3p的表達

Figure 10. The expression of miR-29a-3p（A）and the mRNA expression of NFIA（B）in abdominal adipose were detected by RT-qPCR. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖10 腹部脂肪中miR-29a-3p及NFIA的mRNA表達

9 miR-29a-3p對腹部脂肪中Wnt信號通路的影響

有研究發(fā)現(xiàn)，NFIA 作為轉錄因子，可結合并促進經(jīng)典Wnt 信號通路抑制劑-SFRP1 的轉錄，因此對腹部脂肪中的Wnt 信號通路的關系進行研究［18］。對腹部脂肪中的SFRP1 mRNA 和蛋白水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)二者趨勢一致，在OVX 組大鼠中均被顯著提高（P＜0.05），而在RR組大鼠中較OVX組顯著降低（P＜0.05）。Wnt 信號通路中的下游關鍵蛋白-LRP5、磷酸化糖原合成酶激酶3β（phospho-glycogen synthase kinase-3β，p-GSK-3β）（Ser 9）和糖原合成酶激酶3β（glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β）同樣在OVX組中被顯著抑制（P＜0.05），而在RR組中則被顯著促進（P＜0.05），說明OVX 組腹部脂肪中經(jīng)典Wnt 信號通路被抑制，給藥后可促進Wnt 信號通路的表達，見圖11。

討論

1 RR 水提液在提高OVX 大鼠血清E2的同時對子宮形態(tài)及系數(shù)無明顯影響

對于絕經(jīng)后女性由于體內E2水平低下引起的骨量下降、情緒障礙和脂代謝紊亂等疾病的治療，此前多使用激素療法，但激素療法與子宮內膜增生的風險增加有關［19］，因此更多有效的藥物以及干預方法有待進一步研究。本實驗采用RR 水提液對OVX 大鼠進行干預，結果發(fā)現(xiàn)OVX 大鼠體內E2水平和子宮系數(shù)均顯著低于sham 大鼠，子宮發(fā)生萎縮，與此前文獻所述一致［20］，說明造模成功。給藥后大鼠體內E2水平顯著提高但子宮形態(tài)、子宮系數(shù)無明顯改變，說明RR 水提液在提高體內E2水平的同時不會帶來子宮內膜增生的風險。由于體內E2的循環(huán)水平受下丘腦-垂體-性腺軸控制，體內高水平的E2可誘導下丘腦釋放大量促性腺激素釋放激素［21］，因此，RR-L 和RR-M 組的E2水平高于sham 組，可能是觸發(fā)了E2的正反饋作用。

Figure 11. The level of Wnt signaling pathway in abdominal adipose. The mRNA expression of SFRP1（A），the protein expression of SFRP1，LRP5，GSK-3β（Ser 9）and GSK-3β（B and C）were detected and quantified. Mean±SD. n=3.*P＜0.05 vs sham group；#P＜0.05 vs OVX group.圖11 腹部脂肪的Wnt信號通路水平

2 RR-M組大鼠腹圍較OVX組大鼠減小

目前針對絕經(jīng)后女性脂代謝紊亂的治療方法，大多只針對一個指標進行對癥治療，或從飲食控制和運動方式方面進行全身脂代謝調節(jié)，對于藥物從多方面進行脂代謝調節(jié)的研究仍待進一步發(fā)展。本實驗聚焦于RR 水提液對OVX 大鼠的脂代謝多項指標的調節(jié)作用。結果顯示，RR-M 組大鼠的腹圍顯著低于OVX 組大鼠，但二者體重卻無明顯差異。此前，大量證據(jù)證明，腹圍是心血管疾病和2 型糖尿病的重要預測因子，與BMI 升高的肥胖無關［22］；較高的腹部脂肪量與所有種族群體中心臟代謝風險的增加有關［23］；腹部脂肪的減少與體重減輕后心血管疾病的危險因素減少顯著相關［24］。由于不少實驗證明，更年期的發(fā)生導致脂肪組織從四肢向軀干轉移［25］；絕經(jīng)后婦女的雌激素替代療法被證明可以有利地調節(jié)體脂分布，降低心臟代謝風險［26］。因此認為RR 水提液可能是通過調節(jié)體脂分布來改善OVX 大鼠的脂代謝狀態(tài)，降低心臟代謝風險。

3 RR 水提液降低OVX 大鼠的血清INS、LDL-C和肝臟脂質積累

肥胖通常伴隨胰島素抵抗。臨床研究發(fā)現(xiàn)，腹型肥胖者INS 水平較周圍型顯著升高［27］，另外也有動物實驗證明OVX 大鼠血清INS 水平顯著高于對照組［28］，本實驗亦得到相同結果，并且發(fā)現(xiàn)給藥后可顯著降低血清INS水平。

在人體內，脂類物質都需經(jīng)血液運轉于各組織之間，血脂含量可以反映體內脂類代謝的情況。本實驗發(fā)現(xiàn)，OVX 組中TC 和LDL-C 水平顯著升高，與接受OVX 手術后的女性血清中TC 和LDL-C 的趨勢一致［29］。前瞻性研究的Meta 分析發(fā)現(xiàn)，較高濃度的LDL-C 與冠心病風險較高有關［30］，降低LDL-C 對心血管疾病的預防具有明顯的益處［31］。本實驗中，RR水提液可顯著降低OVX大鼠體內升高的的LDL-C的水平，但對TC 水平?jīng)]有影響，說明RR 水提液對血脂的調節(jié)主要是通過降低血清LDL-C 進行。肝臟是調節(jié)全身脂代謝的重要器官。多項臨床研究表明，非酒精性脂肪肝的患病率在絕經(jīng)后女性中顯著高于絕經(jīng)前女性［32-33］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，OVX 組有較多脂肪細胞空泡，并出現(xiàn)較多炎癥浸潤細胞和脂質積聚；給藥后情況得到改善。

以上結果說明，RR 水提液可通過降低血清INS和LDL-C 水平、減少肝臟脂質積聚來改善OVX 大鼠的全身脂代謝。

4 RR 水提液抑制OVX 大鼠腹部脂肪的形成和炎癥反應

我們對脂肪細胞分化和脂肪生成的關鍵基因PPARγ表達水平進行檢測發(fā)現(xiàn)，OVX 大鼠腹部脂肪中的PPARγ 表達量顯著提高，而給藥后則降低，提示給藥組腹部脂肪細胞體積減小與PPARγ 的表達水平被抑制有關。脂肪組織的擴張和功能障礙還可能伴隨慢性炎癥，進而促進炎癥因子的形成和分泌［34］；實驗發(fā)現(xiàn)GPNMB 可激活脂肪組織巨噬細胞中的溶酶體，進而導致巨噬細胞浸潤和炎癥水平升高［35］。因此對腹部脂肪中的TNF-α、IL-1β和GPNMB表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)RR 水提液可顯著降低以上因子在OVX大鼠中的表達，抑制炎癥水平。

綜上，RR水提液可通過抑制PPARγ的表達從而減少腹部脂肪組織的擴張，并通過降低GPNMB 的表達，改善腹部脂肪的慢性炎癥狀態(tài)，最終改善腹部脂肪的代謝狀態(tài)。

5 RR 水提液降低OVX 大鼠血清外泌體和腹部脂肪中的miR-29a-3p

外泌體作為直徑為50～150 nm 的具有脂質雙層膜結構的盤狀囊泡，其中含有蛋白質和核酸，在細胞間的通訊起著重要作用。MicroRNA 是一類17～24個堿基的小非編碼RNA，它們可通過與靶標mRNA 的3'-UTR或開放閱讀框區(qū)域結合來介導轉錄后基因調控，由于序列很小，因此可穩(wěn)定地存在于體液中，也可富集于外泌體中。研究發(fā)現(xiàn)，減肥手術可改變患者血清外泌體中的miRNA 譜，這可能與術后胰島素信號傳導的改善有關［36］；另一項研究發(fā)現(xiàn)，肥胖會改變小鼠血漿外泌體的miRNA 譜，且肥胖相關的外泌體miRNA 在葡萄糖不耐受和血脂異常的發(fā)病機制中起著核心作用［37］。因此，本實驗從外泌體miRNA的角度入手，進一步研究RR 水提液調節(jié)OVX 大鼠脂代謝的機制，結果提示RR 水提液可提高OVX 大鼠血清外泌體中miR-29a-3p含量。

有學者發(fā)現(xiàn)在動脈粥樣硬化的小鼠模型中，過表達miR-29a-3p可顯著降低血清TC、TG 和LDL-C水平并提高HDL-C 水平，從而抑制動脈粥樣硬化斑塊的形成［38］。細胞實驗發(fā)現(xiàn)，楊梅黃酮通過提高miR-29a-3p，靶向降低GAS5，進而減弱氧化LDL 誘導的人臍靜脈血管內皮細胞炎癥反應［39］?；趍iR-29a-3p 在脂代謝和炎癥中的調節(jié)作用，本實驗對其在大鼠腹部脂肪組織中的表達水平進行相對定量，發(fā)現(xiàn)在OVX 組中miR-29a-3p水平顯著低于sham 組；給藥后顯著提高，與上述研究結果一致。此外，各組miR-29a-3p 水平在血清外泌體和腹部脂肪中變化趨勢一致，提示RR 水提液可能通過提高OVX 大鼠血清外泌體中miR-29a-3p含量進而提高腹部脂肪中的miR-29a-3p含量，從而改善腹部脂肪中的脂代謝。

6 RR水提液抑制OVX大鼠腹部脂肪NFIA表達進而激活Wnt信號通路

對miR-29a-3p 的靶基因進行預測，發(fā)現(xiàn)其與NFIA 的3’-UTR 區(qū)域存在可能的結合區(qū)域。此前有實驗證明，在ST2細胞中，NFIA通過與SFRP1啟動子結合的方式促進SFRP1 的表達來促進脂肪細胞分化［18］。在本實驗中得到一致結果，OVX 組大鼠腹部脂肪的NFIA 的mRNA 水平顯著高于正常大鼠，同時SFRP1 的mRNA 和蛋白水平均顯著提高；給藥后NFIA 和SFRP1 的表達水平同時下降。SFRP1 作為Wnt 信號通路的抑制劑，通過與Wnt 配體結合，抑制Wnt 信號通路的激活。Wnt 信號通路的激活可阻斷PPARγ 對脂肪細胞的誘導，抑制脂肪形成。當Wnt配體與受體LRP5/6 結合后，GSK-3β 的Ser 9 殘基的磷酸化程度升高，Tyr 216 殘基的磷酸化程度降低，GSK-3β 活性被抑制，其所在的β-catenin 降解復合物活性被抑制，因此β-catenin 的降解被抑制，胞漿中穩(wěn)定積累的β-catenin 進入細胞核后啟動下游靶基因的轉錄［40］。因此對經(jīng)典Wnt 信號通路中的LRP5、GSK-3β 和p-GSK-3β（Ser 9）表達水平進行檢測，發(fā)現(xiàn)在OVX 大鼠中，LRP5 和p-GSK-3β（Ser 9）的活性均被抑制，而給藥后被激活，說明給藥后Wnt 信號通路被激活。以上事實說明，RR 水提液可通過提高腹部脂肪中miR-29a-3p 從而抑制其靶基因NFIA 的表達，進而激活Wnt信號通路。

綜上所述，RR 水提液可改善OVX 大鼠的血清E2、INS、LDL-C 和肝臟脂質積累，抑制腹部脂肪細胞擴張和慢性炎癥反應，其作用機制可能是與血清外泌體中miR-29a-3p 和腹部脂肪中miR-29a-3p 的含量增加后NFIA 表達量下降，從而激活腹部脂肪中的Wnt 信號通路有關。但本實驗僅從RR 水提液對腹部脂肪細胞的形成和炎癥反應方面進行探討，而對于脂肪細胞在合成和儲存脂質方面的影響則有待更多的研究。