黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)凋亡因子的影響*

張曉鳳， 李姝玉， 劉雨夢， 劉嘉鵬， 吳 丹， 傅 亮，張 達， 蘇婧雯， 王 謙△

（1北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是糖尿病的微血管并發(fā)癥之一，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因，其主要特征是大量心肌細胞丟失、心肌肥大、心肌纖維化和心室功能障礙等［1］。DCM的發(fā)病機制復(fù)雜，包括糖脂代謝紊亂、炎癥和細胞凋亡等。近年來，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）及其介導(dǎo)的細胞凋亡被認為是DCM的重要發(fā)病機制之一［2］，控制高糖（high glucose，HG）引起的ERS 及其介導(dǎo)的細胞凋亡，可能是一種治療DCM 的潛在策略。黃芪甲苷（astragaloside IV，ASIV）是中藥黃芪的主要活性成分之一，有抗炎和增強免疫力等藥理作用［3］。有研究表明黃芪甲苷具有心臟保護作用，其機制可能與抑制細胞凋亡［4］、改善糖代謝和調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激［5］等有關(guān)。葛根素（puerarin）是中藥葛根的主要活性成分，具有抗炎、抗氧化和減輕細胞凋亡等作用［6］，但黃芪甲苷和葛根素聯(lián)用是否能夠減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞ERS 及其介導(dǎo)的凋亡尚不明確。本研究采用大鼠心肌細胞H9c2 建立高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷模型，進一步觀察黃芪甲苷和葛根素聯(lián)用對心肌細胞損傷的影響并討論其可能的機制，為黃芪甲苷與葛根素聯(lián)用治療糖尿病心肌病提供部分實驗基礎(chǔ)。

材料和方法

1 主要試劑

H9c2 細胞（大鼠心肌細胞）購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院細胞資源中心。DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和胰蛋白酶購自Gibco；D-葡萄糖、甘露醇（mannitol）、4-苯 基 丁 酸（4-phenylbutyric acid，4-PBA）、毒胡蘿卜素（thapsigargin，TG）均購自Sigma。CCK-8 試劑盒購自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；黃芪甲苷標準品和葛根素標準品購自成都曼思特生物科技有限公司；Trizol 試劑購自Invitrogen；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和Power SYBR green 購自Thermo Fisher；B 淋巴細胞瘤2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、肌醇酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）、調(diào)控X 盒結(jié)合蛋白1（X-box binding protein 1，XBP1）、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP 同 源 蛋 白（C/EBP homologous protein，CHOP）、p53上調(diào)凋亡調(diào)節(jié)因子（p53 up-regulate modulator of apoptosis，PUMA）Ⅰ抗和相應(yīng)Ⅱ抗分別購自Abcam和Cell Signaling Technology。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng)和處理 H9c2 細胞在含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)液中培養(yǎng)，取對數(shù)生長期的細胞進行相應(yīng)實驗。第一部分：黃芪甲苷和葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡的影響，將細胞隨機分為對照組（4.5 mmol/L D-葡萄糖 處理細胞）、甘露醇對照組（4.5 mmol/L D-葡萄糖及30.5 mmol/L 甘露醇處理細胞）、高糖組（35 mmol/L D-葡萄糖處理細胞）、高糖+黃芪甲苷低、中、高劑量組（35 mmol/L D-葡萄糖分別與10，20，40 μmol/L 黃芪甲苷共同處理細胞）和高糖+葛根素低、中、高劑量組（35 mmol/L D-葡萄糖分別與125，250，500 μmol/L 葛根素處理細胞）；第二部分：黃芪甲苷與葛根素聯(lián)用對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡相關(guān)的影響，將細胞隨機分為對照組、甘露醇組、高糖組、高糖+4-苯基丁酸組（35 mmol/LD-葡萄糖及5 mmol/L 4-PBA處理細胞）、毒胡蘿卜素組（4.5 mmol/L D-葡萄糖與4 μmol/L TG 處理細胞）及高糖+黃芪甲苷+葛根素組（35 mmol/L D-葡萄糖、20 μmol/L 黃芪甲苷及250 μmol/L 葛根素處理細胞）。所有細胞均置于5%CO2、37 ℃細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

2.2 CCK-8 檢測細胞活力 細胞傳代后進行計數(shù)，在96 孔板中每孔接種200 μL 的細胞懸液，培養(yǎng)24 h后分別加入相應(yīng)濃度的藥物，處理結(jié)束后在每個孔內(nèi)加入10 μL的CCK-8試劑，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1.5 h。用酶標儀在450 nm處測定每孔吸光度（A）值。

2.3 RT-qPCR 檢測相關(guān)因子mRNA 表達 用Trizol分離提取細胞總RNA。取2 μg RNA 為初始模板，PCR 反應(yīng)體系為20 μL：Power SYBR green PCR Mix 10 μL，上游和下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，cDNA（2 μg RNA）2 μL，dd H2O 7.2 μL。PCR 的反應(yīng)條件如下：95 ℃10 min；95 ℃5 s，60 ℃30 s（循環(huán)40次）。 mRNA 相對表達水平用2-△△Ct法計算，所用的引物序列詳見表1。

表1 引物序列Table 1. Sequences of the primers for RT-qPCR

2.4 Western blot 檢測相關(guān)因子蛋白的表達 提取細胞總蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度。蛋白經(jīng)變性、電泳后，在室溫下轉(zhuǎn)膜和封閉，隨后加入相應(yīng)因子Ⅰ抗，4 ℃孵育過夜；再經(jīng)洗膜和相應(yīng)因子的Ⅱ抗室溫孵育后，加入ECL 化學(xué)發(fā)光液，在暗室中顯影。β-actin 為內(nèi)參照，用Quantity-one 軟件分析目的蛋白的相對表達量。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 21.0軟件進行數(shù)據(jù)處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示，采用單因素方差分析方法（首先檢驗方差齊性，組間采用LSD 法比較），以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

1 不同藥物濃度對H9c2細胞增殖活性的影響

與control 組相比，不同濃度的TG、4-PBA、AS-IV及puerarin 對細胞增殖活性的影響無統(tǒng)計學(xué)差異；不同濃度的AS-IV 和puerarin 聯(lián)用組的A值均增加，除AS-IV 10 μmol/L+puerarin 125 μmol/L 組和AS-IV 10 μmol/L+puerarin 500 μmol/L組外，其余各組與control組比較均有統(tǒng)計學(xué)差異（P＜0.05），這說明上述各濃度藥物對細胞均沒有毒性，見表2～4。

表2 不同濃度TG和4-PBA對H9c2細胞活力的影響Table 2. Effects of different concentrations of thapsigargin（TG）and 4-phenylbutyric acid（4-PBA）on the viability of H9c2 cells（Mean±SD. n=3）

2 不同濃度AS-IV 及puerarin 對GRP78、IRE1α和CHOP mRNA表達的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，mannitol control 組GRP78、IRE1α 和CHOP mRNA 的表達沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），HG組GRP78、IRE1α和CHOP的mRNA表達增加（P＜0.05）；與HG組相比，HG+ASIV（10，20，40 μmol/L）組和HG+puerarin（125，250，500 μmol/L）組GRP78、IRE1α 和CHOP 的mRNA 表達均顯著下降（P＜0.05），見表5。本研究中后續(xù)實驗中AS-IV 和puerarin 的實驗濃度分別選取20 μmol/L和250 μmol/L進行。

表3 不同濃度黃芪甲苷和葛根素對H9c2細胞活力的影響Table 3. Effects of different concentrations of astragaloside IV（AS-IV）and puerarin on the viability of H9c2 cells（Mean±SD. n=3）

表4 不同濃度黃芪甲苷和葛根素聯(lián)用對H9c2 細胞活力的影響Table 4. Effects of different concentrations of astragaloside IV（AS-IV）combined with puerarin on the viability of H9c2 cells（Mean±SD. n=3）

表5 不同濃度黃芪甲苷及葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞中GRP78、IRE1α和CHOP mRNA表達的影響Table 5. Effects of different concentrations of astragaloside IV（AS-IV）and puerarin on GRP78，IRE1α，and CHOP mRNA expression in high glucose（HG）-induced H9c2 cells（Mean±SD. n=3）

3 AS-IV 與puerarin 聯(lián)用對H9c2細胞Bax 和Bcl-2蛋白表達的影響

Figure 1. Effect of astragaloside IV（AS-IV）combined with puerarin on the apoptosis of H9c2 cells exposed to high glucose（HG）.Western blot was used to detect Bax and Bcl-2 expression in H9c2 cardiomyocytes. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs control group；#P＜0.05 vs HG group.圖1 黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞凋亡的影響

與control組相比，mannitol control組Bax/Bcl-2比值沒有顯著變化（P＞0.05），HG 組Bax 蛋白表達水平上調(diào)，Bcl-2 蛋白表達水平下降，Bax/Bcl-2 比值顯著增加（P＜0.01）；與HG組相比，HG+AS-IV+puerarin組Bax/Bcl-2比值下降（P＜0.05），見圖1。

4 AS-IV 與puerarin 聯(lián)用對H9c2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，mannitol control 組GRP78、IRE1α、XBP1u 和XBP1s mRNA 表達均沒有顯著改變（P＞0.05），TG 組GRP78、IRE1α和XBP1s mRNA 表 達 均 增 加（P＜0.05），XBP1u mRNA 表達增加，但差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義，HG 組GRP78、IRE1α 和XBP1s mRNA 表達均增加，XBP1u mRNA表達下降（P＜0.05）；與HG組相比，HG+4-PBA組GRP78、IRE1α、XBP1u 和XBP1s mRNA 表達均下降（P＜0.05），HG+AS-IV+puerarin 組GRP78、IRE1α、XBP1u 和XBP1s mRNA 表 達 均 下 降（P＜0.05），見表6。

表6 黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子mRNA表達的影響Table 6. Effect of astragaloside IV（AS-IV）combined with puerarin on mRNA expression levels of endoplasmic reticulum stressrelated indicators in high glucose（HG）-induced H9c2 cells（Mean±SD. n=8）

5 AS-IV 與puerarin 聯(lián)用對H9c2 細胞ERS 相關(guān)凋亡信號分子mRNA表達的影響

RT-qPCR 結(jié)果顯示，與control 組相比，mannitol control組CHOP和PUMA mRNA表達無顯著改變（P＞0.05），TG 組和HG 組CHOP 和PUMA mRNA 表達增加（P＜0.05）；與HG 組相比，HG+4-PBA 組和HG+ASIV+puerarin 組CHOP 和PUMA mRNA 表達下降（P＜0.05），見表7。

表7 黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞凋亡相關(guān)信號分子mRNA表達的影響Table 7. Effect of astragaloside IV（AS-IV）combined with puerarin on mRNA expression levels of apoptosis-related signal molecules in high glucose（HG）-induced H9c2 cells（Mean±SD. n=8）

6 AS-IV 與puerarin 聯(lián)用對H9c2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平的影響

Western blot 結(jié)果顯示，與control 組相比，mannitol control組細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白GRP78及下游因子IRE1α、XBP1、CHOP 和PUMA 表達沒有顯著變化（P＞0.05），HG 組 和TG 組細胞GRP78、IRE1α、XBP1、CHOP 和PUMA 表達均上調(diào)（P＜0.05）；與HG組相比，HG+AS-IV+puerarin 組和HG+4-PBA 組細胞內(nèi)GRP78、IRE1α、XBP1、CHOP和PUMA 表達均下調(diào)（P＜0.05），見圖2。

討論

DCM是一種與糖尿病患者體內(nèi)代謝紊亂有關(guān)的特異心肌病變，心肌細胞凋亡是DCM 主要的病理特征［7］。黃芪甲苷可通過調(diào)控絲裂原活化蛋白激酶信號通路，進而抑制高糖和缺氧誘導(dǎo)的H9c2 細胞凋亡［8］，此外，其減輕高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡的機制可能與激活PPARγ-Klotho-FoxO 信號通路有關(guān)［9］。在暴露于高糖條件下的人臍靜脈內(nèi)皮細胞實驗中，證實葛根素能通過上調(diào)血紅素氧合酶1 的表達和抑制鈣蛋白酶活性來抑制細胞凋亡［10］，這說明黃芪甲苷和葛根素具有良好的抗細胞凋亡潛力。本課題組前期研究表明，黃芪注射液與葛根素注射液聯(lián)合使用能顯著降低2 型糖尿病小鼠的血糖和血脂，抑制心肌細胞凋亡并減輕心臟纖維化［11］，但黃芪甲苷和葛根素聯(lián)用對心肌細胞凋亡影響的具體機制還需要進一步探討。

Bcl-2 家族包含數(shù)量巨大的促凋亡蛋白如Bax 和PUMA，及抗凋亡蛋白如Bcl-2，其通過改變線粒體外膜的通透性來調(diào)控內(nèi)源性的凋亡通路［12］，此外，Bcl-2家族可通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑介導(dǎo)細胞的凋亡［13］。研究表明下調(diào)Bax/Bcl-2 比值可抑制高糖誘導(dǎo)的H9c2 心肌細胞凋亡［14］。本研究顯示黃芪甲苷聯(lián)合葛根素能降低Bax/Bcl-2 比值，表明黃芪甲苷與葛根素聯(lián)用能夠減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡。

ERS 作為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)的重要機制，與糖尿病心肌病的發(fā)展密切相關(guān)［15］。心臟炎癥和錯誤折疊蛋白的積累等多種因素會激活ERS，為維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)負荷，機體啟動未折疊蛋白反應(yīng)（unfolded protein reaction，UPR）機制［16-17］，但當(dāng)UPR反應(yīng)不能緩解細胞壓力時，則會激活細胞凋亡途徑。4-PBA 是一種具有分子伴侶樣活性的脂肪酸，具有抗ERS 的能力，被認為是特異性的ERS 抑制劑［18］；TG 通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+濃度，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能紊亂，從而誘導(dǎo)細胞發(fā)生ERS，被認為是ERS誘導(dǎo)劑［19］。

GRP78 是ERS 的經(jīng)典標志蛋白，當(dāng)細胞發(fā)生ERS 時，GRP78 與IRE1α 解離，IRE1α 發(fā)生二聚化和反式自磷酸化而被激活，激活的IRE1α 剪切XBP1 mRNA 并產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子XBP1s，XBP1s 易位到細胞 核 激 活CHOP，從 而 導(dǎo) 致 細 胞 凋 亡［20-21］，可 見GRP78、IRE1α和XBP1s的表達情況在一定程度上反映細胞ERS 狀態(tài)。本課題組前期實驗證明，黃芪注射液同葛根素注射液聯(lián)用能降低GRP78 的表達，緩解2 型糖尿病KKAy 小鼠腎臟過強的ERS［22］。研究證明CHOP 可通過上調(diào)PUMA 蛋白表達誘導(dǎo)細胞凋亡［23］。在DCM 大鼠模型中觀察到心肌細胞凋亡增多，GRP78 和XBP1 等ERS 相關(guān)因子表達增強，ERS相關(guān)凋亡信號分子CHOP 和PUMA 表達上調(diào)［24-25］。本研究顯示，高糖組H9c2 細胞中GRP78、IRE1α 和XBP1 表達明顯增加，CHOP 表達和下游PUMA 表達增加，這種效應(yīng)與TG 組一致，這表明高糖能夠誘導(dǎo)ERS，引起細胞凋亡。黃芪甲苷和葛根素聯(lián)用能夠改善高糖刺激下H9c2 細胞ERS 狀態(tài)，降低CHOP 和下游PUMA 的表達，這種效應(yīng)與4-PBA 組一致，這證明黃芪甲苷與葛根素聯(lián)用能夠抑制高糖條件下的H9c2 細胞中ERS 及其介導(dǎo)的凋亡。同時本研究顯示HG 組XBP1u mRNA 表達下降，但TG 組與control組XBP1u mRNA 沒有顯著差別，這可能是因為即便IRE1α的表達量升高，但同時轉(zhuǎn)錄激活因子6途徑的激活會抑制XBP1u mRNA 的表達［26］。由于ERS 涉及的通路較多，故暫不明確ERS 其他通路是否也參與了黃芪甲苷與葛根素聯(lián)用對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞凋亡的影響。

Figure 2. Effect of astragaloside IV（AS-IV）combined with puerarin on the expression of ERS-related proteins in high glucose（HG）-induced H9c2 cells. The protein levels of glucose-regulated protein 78（GRP78），inositol-requiring enzyme 1α（IRE1α），X-box binding protein 1（XBP1），C/EBP homologous protein（CHOP）and p53 up-regulated modulator of apoptosis（PUMA）were detected by Western blot. Mean±SD. n=8.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs HG group.圖2 黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達水平的影響

綜上所述，黃芪甲苷聯(lián)合葛根素對高糖誘導(dǎo)的H9c2 細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及相關(guān)的凋亡因子有抑制作用，從而可能減輕高糖誘導(dǎo)的心肌細胞損傷。