3，4-二羥基苯乙酮調(diào)控JNK/Nrf2信號(hào)通路減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的作用研究*

曹黛虹， 王韻涵， 張代娟， 劉江月

（濰坊醫(yī)學(xué)院病理生理教研室，山東 濰坊 261053）

動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種由多種危險(xiǎn)因素引起的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性血管疾病，是心腦血管疾病死亡的主要原因［1］。目前認(rèn)為，血管內(nèi)皮損傷是AS 主要發(fā)病機(jī)制之一。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS 發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)，氧化型低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL）可刺激內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，是致內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因子［2］。因此，減輕或抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷對(duì)AS的防治具有重大意義。

核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2）/抗氧化反應(yīng)元件（antioxidant responsive element，ARE）信號(hào)通路被認(rèn)為是重要的內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激通路，在機(jī)體抗AS 形成的過程中發(fā)揮重要作用。c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）是絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）家族的一員，可被多種應(yīng)激信號(hào)激活，識(shí)別抗氧化調(diào)控因子Nrf2 并激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路［3］。研究表明，Nrf2 受到上游調(diào)節(jié)激酶，如Akt 或MAPKs 的調(diào)節(jié)，小檗堿可激活A(yù)kt和MAPKs信號(hào)，誘導(dǎo)Nrf2介導(dǎo)的抗氧化酶NAD（P）H醌 脫 氫 酶1［NAD（P）H quinone dehydrogenase 1，NQO1］的表達(dá)［4］；黃連堿激活A(yù)kt 和JNK/Nrf2/NQO1通路減輕AAPH 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激［5］。3，4-二羥基苯乙酮（3，4-dihydroxyacetophnone，3，4-DHAP）是從禿毛冬青葉中提取的有效單體成分，具有抗炎、抗氧化、擴(kuò)張冠脈等多種藥理活性［6-8］。前期研究結(jié)果顯示，3，4-DHAP 能夠抑制NF-κB 核轉(zhuǎn)位減輕脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，抑制ApoE-/-小鼠AS 斑塊的形成。本研究擬進(jìn)一步觀察3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞損傷的影響，并從JNK/Nrf2 信號(hào)通路角度探討其可能的作用機(jī)制。

材料和方法

1 材料與儀器

1.1 細(xì)胞株 源自ATCC 的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株EA.hy926購于上海拜力生物科技有限公司。

1.2 藥物與試劑 3，4-DHAP（純度99.9%；TCI）；一氧化氮（nitric oxide，NO）和內(nèi)皮素1（endothelin-1，ET-1）試劑盒，以及活性氧（reactive oxygen species，ROS）和超氧化物歧化酶（superoxide dismuctase，SOD）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；MTT試劑盒、TUNEL 檢測(cè)試劑盒、Western blot 相關(guān)試劑及RT-qPCR 試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）；Nrf2、JNK、p-JNK 和血紅素加氧酶1（hemo oxygenase-1，HO-1）抗體（武漢博士德生物工程有限公司）。

1.3 主要儀器 DYCN-25D 型電泳儀（北京市六一儀器廠）；激光共聚焦顯微鏡（Olympus）；752 型紫外分光光度計(jì)（上海精密儀器有限公司）；T100 型梯度PCR儀、轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像分析儀（Bio-Rad）

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)分組及干預(yù)方法 根據(jù)文獻(xiàn)［4-6］確定ox-LDL 及3，4-DHAP 的劑量并建立ox-LDL 誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞氧化應(yīng)激模型。將生長(zhǎng)良好的EA.hy926細(xì)胞隨機(jī)分為空白對(duì)照（control，CON）組、3，4-DHAP（0.1 mmol/L）對(duì)照（3，4-DHAP control，3，4-DHAP-C）組、ox-LDL（100 mg/L）組、ox-LDL+低劑量（0.01 mmol/L）3，4-DHAP（low-dose 3，4-DHAP，3，4-DHAP-L）組和ox-LDL+高劑量（0.1 mmol/L）3，4-DHAP（high-dose 3，4-DHAP，3，4-DHAP-H）組。3，4-DHAP-C 組、ox-LDL+3，4-DHAP-L 組和ox-LDL+3，4-DHAP-H 組分別加入不同濃度3，4-DHAP 孵育24 h后，棄培養(yǎng)液；ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-L 組和ox-LDL+3，4-DHAP-H 組再加入終濃度100 mg/L 的ox-LDL培養(yǎng)24 h，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 ROS 生成檢測(cè) 處理后的細(xì)胞加入無血清培養(yǎng)基稀釋的DCFH-DA（1∶1 000），37 ℃孵育30 min。488 nm激光激發(fā)，激光共聚焦顯微鏡觀察。

2.3 SOD、NO 和ET-1 水平的檢測(cè) 收集培養(yǎng)液上清，采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD 活力，硝酸還原酶法測(cè)定NO 濃度，ELISA 法測(cè)定ET-1水平。操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2.4 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 加入CCK-8 反應(yīng)液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h 后，用酶標(biāo)儀450 nm 測(cè)定吸光度（A）。細(xì)胞活力（%）=（A實(shí)驗(yàn)孔-A空白孔）/（A對(duì)照孔-A空白孔）×100%。

2.5 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況 4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，按照TUNEL檢測(cè)試劑盒說明書操作，染色結(jié)束后將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下觀察拍照計(jì)數(shù)。細(xì)胞凋亡率（%）=（凋亡的細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)）×100%。

2.6 RT-qPCR 檢測(cè)Nrf2 和HO-1 mRNA 表達(dá) 收集細(xì)胞提取總RNA，按試劑盒操作說明合成cDNA，以GAPDH 為內(nèi)參照，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，設(shè)計(jì)的引物序列見表1。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.7 Western blot 檢測(cè)JNK、p-JNK、Nrf2 和HO-1 蛋白水平 收集細(xì)胞分別提取總蛋白及核蛋白，SDSPAGE 分離蛋白后轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h后加Ⅰ抗（1∶500），4 ℃孵育過夜，TBST 振蕩洗滌3 次后，Ⅱ抗37 ℃孵育1 h，TBST 振蕩洗滌4 次后，ECL 發(fā)光顯色，凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

1 3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘 導(dǎo) 的EA. hy926 細(xì) 胞ROS生成及SOD活性的影響

與CON 組比較，3，4-DHAP-C 組ROS 無顯著變化（P＞0.05），SOD 活性略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-H 組和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組ROS 生成均顯著增加，而SOD 活性均顯著下降（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組ROS 生成均顯著降低，而SOD 活性顯著升高；與ox-LDL+3，4-DHAP-L 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組ROS生成顯著降低，而SOD活性顯著升高（P＜0.05），見圖1。

2 3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘 導(dǎo) 的EA. hy926 細(xì) 胞NO和ET-1的影響

與CON 組比較，3，4-DHAP-C 組NO 和ET-1 水平均無顯著變化（P＞0.05），ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-H 組和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組NO 生成均顯著減少，而ET-1 生成顯著增加（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAPL 組NO 生成均顯著增加，而ET-1 生成顯著減少（P＜0.05）；與ox-LDL+3，4-DHAP-L 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組NO 生成顯著增加，而ET-1生成顯著減少（P＜0.05），見圖2。

3 3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘導(dǎo)的EA. hy926 細(xì)胞活力和凋亡的影響

與CON組比較，3，4-DHAP-C組細(xì)胞活力和凋亡情況均無顯著變化（P＞0.05），ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-H 組和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組細(xì)胞活力均顯著降低（P＜0.05），凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組和ox-LDL+3，4-DHAP-L組細(xì)胞活力均顯著增強(qiáng)（P＜0.05），凋亡率顯著降低（P＜0.05）；與ox-LDL+3，4-DHAP-L 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組細(xì)胞活力顯著增強(qiáng)（P＜0.05），凋亡率顯著降低（P＜0.05），見圖3。

4 3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘 導(dǎo) 的EA. hy926 細(xì) 胞Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

與CON 組比較，3，4-DHAP-C 組Nrf2 和HO-1 的mRNA 表達(dá)略有升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-H 組 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組Nrf2 和HO-1 的mRNA 表達(dá)均顯著減少（P＜0.05）；與ox-LDL 組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組Nrf2 和HO-1 的mRNA 表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；與ox-LDL+3，4-DHAP-L組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組Nrf2和HO-1的mRNA表達(dá)均顯著增高（P＜0.05），見圖4。

5 3，4-DHAP 對(duì)ox-LDL 誘 導(dǎo) 的EA. hy926 細(xì) 胞JNK、p-JNK、HO-1和Nrf2蛋白水平的影響

與CON 組比較，3，4-DHAP-C 組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)及p-JNK/JNK 比值略有升高，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且Nrf2 核蛋白無顯著變化（P＞0.05），ox-LDL 組、ox-LDL+3，4-DHAP-H 組 和ox-LDL+3，4-DHAP-L 組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)、p-JNK/JNK 比值及Nrf2 核蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）；與ox-LDL組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 和ox-LDL+3，4-DHAPL 組Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)、p-JNK/JNK 比值及Nrf2核蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05）；與ox-LDL+3，4-DHAP-L組比較，ox-LDL+3，4-DHAP-H 組Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)、p-JNK/JNK 比值及Nrf2 核蛋白表達(dá)均顯著增高（P＜0.05），見圖5。

討論

Figure 1. The effect of 3，4-DHAP on ROS generation（A）and SOD activity（B）in ox-LDL-treated EA. hy926 cells（scale bar=100 μm）. The results showed that the generation of ROS was significantly decreased and the activity of SOD was significantly increased in ox-LDL+3，4-DHAP-H group. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.圖1 3，4-DHAP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)的EA.hy926細(xì)胞ROS生成及SOD活性的影響

Figure 2. The effect of 3，4-DHAP on NO（A）and ET-1（B）production in ox-LDL-treated EA. hy926 cells. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.圖2 3，4-DHAP對(duì)ox-LDL處理的EA.hy926細(xì)胞NO和ET-1生成的影響

氧化應(yīng)激致內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS 的主要發(fā)病機(jī)制之一［9］。ox-LDL 與血凝素樣ox-LDL 受體1 結(jié)合，促進(jìn)ROS 大量生成，啟動(dòng)內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙的過程［10］，參與AS 的發(fā)生。ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷是AS 發(fā)生的始動(dòng)因素之一。因此，減輕或阻斷ox-LDL 誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷將是預(yù)防和治療AS 的有效途徑之一。本研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了ox-LDL可通過誘導(dǎo)氧化應(yīng)激引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷。近年來學(xué)者們對(duì)3，4-DHAP 在心血管疾病中的應(yīng)用進(jìn)行了大量的研究，3，4-DHAP 可能通過AMP 活化蛋白激酶途徑改善AS 時(shí)的病理性脂質(zhì)代謝，預(yù)防和延緩AS的發(fā)生［11-12］。3，4-DHAP 還通過上調(diào)內(nèi)皮型NO 合成酶-NO 信號(hào)通路，減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，糾正血管內(nèi)皮功能失調(diào)［7，13］。這些研究提示，3，4-DHAP 是一種耐受性良好的天然化合物，具有良好的藥理作用，可通過多靶點(diǎn)預(yù)防AS 的發(fā)生發(fā)展，為開發(fā)抗AS候選藥物提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。筆者一直致力于3，4-DHAP 抗AS 的研究［14-15］，本次以ox-LDL 誘導(dǎo)的EA.hy926 細(xì)胞為對(duì)象，觀察到3，4-DHAP 可通過抑制ROS 的生成，使細(xì)胞活力增強(qiáng)，凋亡明顯減少，增加了NO 的合成，降低了ET-1 的產(chǎn)生，從而減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，證實(shí)了3，4-DHAP的抗氧化應(yīng)激作用，并對(duì)抗氧化應(yīng)激機(jī)制進(jìn)行初步探索。

Figure 3. The effect of 3，4-DHAP on the apoptosis（A）and viability（B）of EA. hy926 cells induced by ox-LDL（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.圖3 3，4-DHAP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞凋亡和活力的影響

Figure 4. The effect of 3，4-DHAP on Nrf2（A）and HO-1（B）mRNA expression in EA.hy926 cells induced by ox-LDL. Mean±SD.n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.圖4 3，4-DHAP對(duì)ox-LDL處理的EA.hy926細(xì)胞中Nrf2和HO-1 mRNA表達(dá)的影響

Figure 5. The effect of 3，4-DHAP on the protein levels of JNK，p-JNK，Nrf2，HO-1 and nuclear Nrf2 in EA.hy926 cells induced by ox-LDL. Mean±SD. n=6.*P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs ox-LDL group；&P＜0.05 vs ox-LDL+3，4-DHAP-L group.圖5 3，4-DHAP對(duì)ox-LDL誘導(dǎo)EA.hy926細(xì)胞JNK、p-JNK、Nrf2、HO-1及核內(nèi)Nrf2蛋白水平的影響

在AS 發(fā)生發(fā)展的過程中，ROS 過量生成，抗氧化酶SOD、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-glutamylcysteine synthetase，γ-GCS）等表達(dá)不足，氧化/抗氧化系統(tǒng)失調(diào)，從而引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，造成內(nèi)皮細(xì)胞損傷［16］。ROS 導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）大血管并發(fā)癥發(fā)生的始動(dòng)環(huán)節(jié)［17］。Nrf2 信號(hào)通路，是目前認(rèn)為最重要的內(nèi)源性抗氧化途徑，是自我保護(hù)的重要轉(zhuǎn)錄因子。研究表明，激活Nrf2 可減輕T2DM 時(shí)Nrf2 失調(diào)致氧化應(yīng)激介導(dǎo)的血管內(nèi)皮損傷［17］。JNK是MAPKs家族的一員，Runchel 等［18］認(rèn)為JNK 在保護(hù)細(xì)胞方面有兩面性：短暫的低水平的ROS 不能持續(xù)激活JNK，此時(shí)激活的JNK 可促進(jìn)Nrf2 磷酸化和核轉(zhuǎn)移［19］，激活Nrf2/ARE 信號(hào)通路［20］，發(fā)揮抗炎、抗氧化及抗細(xì)胞凋亡等作用，表現(xiàn)出保護(hù)細(xì)胞的作用；而持續(xù)的高水平的活性氧持續(xù)激活JNK，此時(shí)激活的JNK 促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Rosaria 等［21］研究顯示，原兒茶酸通過激活JNK/Nrf2 信號(hào)通路抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡。Feng 等［22］研究顯示，柚皮苷通過激活JNK/Nrf2信號(hào)通路促進(jìn)HO-1 表達(dá)，從而減輕高糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷。本研究也觀察到，3，4-DHAP 可上調(diào)EA.hy926 細(xì)胞p-JNK/JNK 比值，促進(jìn)Nrf2 核內(nèi)移，上調(diào)HO-1 mRNA 及蛋白的表達(dá)，增強(qiáng)SOD 活性，抑制ROS生成，表明3，4-DHAP可能通過激活JNK/Nrf2信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。

綜上所述，3，4-DHAP 能夠有效減輕ox-LDL 誘導(dǎo)的EA. hy926 細(xì)胞損傷，其機(jī)制可能與激活JNK/Nrf2 信號(hào)通路，抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。該研究結(jié)果為3，4-DHAP抗AS的開發(fā)應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但ox-LDL 誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激與內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)系，以及其他通路在3，4-DHAP保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞中的作用尚不明確，有待于今后的進(jìn)一步研究。