植物源天然產(chǎn)物協(xié)同抗生素抗MRSA的研究進(jìn)展

王宗朝 張潔 丁超月 郭銀輝 潘源虎

摘要：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）在世界各地感染率和分離率不斷升高，常用抗菌藥物的治療作用逐漸減弱甚至無效，因此迫切需要一種新的治療MRSA感染的手段。植物源天然產(chǎn)物因其新穎復(fù)雜的化學(xué)結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出廣泛的生物活性，作為增效劑協(xié)同抗生素對抗MRSA的作用已有大量報道。本文主要綜述了自2016年來的植物源天然產(chǎn)物協(xié)同抗生素對抗MRSA的作用及機(jī)制，以期為進(jìn)一步的研究提供參考。

關(guān)鍵詞：天然產(chǎn)物；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；抗生素；協(xié)同作用；機(jī)制

中圖分類號：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Research progress of synergistic anti-MRSA effects of plant-derived natural products combined with antibiotics

Wang Zong-chao， Zhang Jie， Ding Chao-yue， Guo Yin-hui， and Pan Yuan-hu

（National Reference Laboratory of Veterinary Drug Residues （HZAU） and MOA Key Laboratory for the Detection of Veterinary Drug Residues in Foods， College of Animal Science and Technology， Huazhong Agricultural University， Wuhan 430070）

Abstract The infection and isolation rates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus （MRSA） are increasing all over the world， and the therapeutic effects of commonly used antibiotic have gradually weakened or even become ineffective. Therefore， new approaches for the treatment of MRSA infection are urgently needed. Plant-derived natural products exhibit a wide range of biological activities due to their novel and complex chemical structures， and their effects as antibiotic adjuvants against MRSA have been reported in large numbers. This article mainly reviews the effects and mechanisms of plant-derived products combined with antibiotics against MRSA since 2016， hoping to provide a reference for further research.

Key words Natural products; MRSA; Antibiotics; Synergistic effects; Mechanisms

MRSA是一種重要的人畜共患病原菌，可導(dǎo)致多種臨床感染性疾病，如淺表皮膚感染、菌血癥、心內(nèi)膜炎、肺炎、膿腫和軟組織或骨組織感染等[1]。據(jù)統(tǒng)計，在2014—2019年我國全國門診患者分離的總菌株數(shù)中，MRSA的檢出率為25.1%～27.8%[2]。臨床MRSA的多重耐藥問題給臨床治療的選擇用藥帶來了困難，特別是耐萬古霉素的金黃色葡萄球菌（VRSA）在2002年被首次報道[3-4]。因此，尋找新的藥物或者方法控制MRSA感染引起了眾多學(xué)者的關(guān)注。

植物源天然產(chǎn)物協(xié)同抗生素抗耐藥菌的研究在國內(nèi)外均有報道。Hemaiswarya等[5]根據(jù)其不同抗菌增效方式進(jìn)行了詳細(xì)的綜述；曹珍等[6]綜述了分別針對臨床多種耐藥菌具有抗菌增效作用的植物源天然產(chǎn)物。具有協(xié)同抗生素抗MRSA活性的植物源天然產(chǎn)物也有大量文獻(xiàn)報道，韓宗其等[7]在2012年對其進(jìn)行了綜述。本文總結(jié)了自2016年來國內(nèi)外報道的具有協(xié)同抗生素對抗MRSA的植物源天然產(chǎn)物的作用及其機(jī)制，為進(jìn)一步研究提供參考。

1 植物源天然產(chǎn)物協(xié)同抗生素抗MRSA的主要作用機(jī)制

1.1 影響PBP2a蛋白的表達(dá)與活性

研究表明，MRSA主要耐藥性機(jī)制是由于其獲得的葡萄球菌盒式染色體SCCmec上的一個基因 mecA編碼合成一種新的青霉素結(jié)合蛋白PBP2a，它與β-內(nèi)酰胺類抗生素親和力較低，在較高濃度的β-內(nèi)酰胺抗生素的存在下，PBP2a可代替PBPs繼續(xù)進(jìn)行細(xì)胞壁的生物合成[8]。植物源天然產(chǎn)物可通過影響細(xì)菌PBP2a的表達(dá)與活性（圖1-①）而提高β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗菌作用。Catteau等[9]發(fā)現(xiàn)了熊果酸（23）/齊墩果酸（24）與氨芐西林/苯唑西林的協(xié)同抗MRSA作用，熒光顯微鏡下觀察到經(jīng)藥物孵育MRSA的PBP2a蛋白從間隔分裂位點(diǎn)離域，從而干擾肽聚糖的合成。Mun等[10]通過免疫印跡法發(fā)現(xiàn)桑色素與苯唑西林的聯(lián)合顯著降低了PBP2a蛋白的表達(dá)量，而兩種藥物的單獨(dú)使用結(jié)果均與陰性對照組無明顯差異。孫豐慧[11]等通過轉(zhuǎn)錄組測序研究發(fā)現(xiàn)香葉醇（22）能夠降低mecA基因的表達(dá)，推測香葉醇增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素的抗MRSA活性可能是通過下調(diào)了mecA基因的表達(dá)。

1.2 抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性

細(xì)菌產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶是其對多數(shù)β-內(nèi)酰胺類抗生素產(chǎn)生耐藥的重要原因之一，這種酶通過催化β-內(nèi)酰胺環(huán)的水解使抗生素失活[12]。通過抑制β-內(nèi)酰胺酶活性（圖1-②）恢復(fù)抗生素對MRSA的殺菌作用是植物源天然單體產(chǎn)物的作用機(jī)制之一。Zhou等[13]發(fā)現(xiàn)五環(huán)三萜的熊果酸（23）和齊墩果酸（24）抑制活細(xì)菌對硝基頭孢（一種β-內(nèi)酰胺酶底物）的水解，但在細(xì)菌裂解物中不起作用，表明兩種化合物可間接抑制β-內(nèi)酰胺酶的活性。Teng等[14]發(fā)現(xiàn)茶黃素-3，3-二氨基甲酸酯（theaflavin-3，3'-digallate）沒有抗菌活性，但是可以通過抑制金屬β-內(nèi)酰胺酶（MBLs）對抗生素的水解而增強(qiáng)β-內(nèi)酰胺類抗生素對MRSA的活性；通過分子動力學(xué)模擬方法發(fā)現(xiàn)其可與Gln242和Ser369結(jié)合從而限制MBLs的活性。

1.3 影響生物被膜或細(xì)胞膜

細(xì)菌生物被膜（biofilm，BF）通常指細(xì)菌吸附于生物材料或機(jī)體腔道表面，分泌多糖基質(zhì)、纖維蛋白和脂蛋白等，將其自身包繞其中形成多層細(xì)胞簇的膜狀物，可保護(hù)細(xì)菌逃逸宿主免疫和抗菌藥物的殺傷作用，使細(xì)菌對藥物產(chǎn)生高度耐藥性導(dǎo)致治療的困難[15]。天然產(chǎn)物可通過抑制BF的形成和清除成熟的BF（圖1-③）產(chǎn)生抗生素協(xié)同作用。嚴(yán)一舟等[16]采用結(jié)晶紫染色法和菌落計數(shù)法評估百里香酚（17）和苯唑西林單用和聯(lián)用對MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株USA300的BF形成抑制和清除作用，結(jié)果表明在亞抑菌濃度下，百里香酚與苯唑西林對USA300的BF的形成具有一定的抑制作用；在較高濃度下百里香酚對BF有良好的清除作用，與抗生素聯(lián)用對BF的抑制和清除作用進(jìn)一步增強(qiáng)。

細(xì)胞膜作為保護(hù)細(xì)菌的一道天然屏障，能夠阻擋部分包括抗生素在內(nèi)的有害物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。天然產(chǎn)物通過增大細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性，引起細(xì)菌內(nèi)容物的泄露和加快抗生素進(jìn)入菌體（圖1-③）。Aelenei等[17]通過熒光和微分干涉相差顯微鏡和掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，在MRSA暴露于桑辛素（1）、桑黃酮G（2）后，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性增加導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物大量滲漏，桑辛素恢復(fù)了MRSA對苯唑西林的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)木犀草素[18]（10）、芹菜素[19]（14）均可增加MRSA細(xì)胞膜通透性，與抗生素協(xié)同抑制MRSA的生長。

1.4 抑制外排泵的活性

通過細(xì)菌細(xì)胞膜上的外排泵將抗生素排出細(xì)胞外，是臨床上固有耐藥和獲得性多藥耐藥性的主要機(jī)制。外排泵的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將進(jìn)入胞內(nèi)的藥物直接泵出細(xì)胞外，使細(xì)胞內(nèi)抗菌藥物濃度降低而產(chǎn)生耐藥[20]。天然產(chǎn)物能通過減少細(xì)菌外排泵的表達(dá)和抑制外排泵活性（圖1-④），從而增加菌體內(nèi)抗生素濃度，達(dá)到更好的殺菌效果。鄒丹等[21]發(fā)現(xiàn)鷹嘴豆芽素A可顯著提高M(jìn)RSA41577對環(huán)丙沙星的敏感性，經(jīng)鷹嘴豆芽素A處理的MRSA菌株的體內(nèi)環(huán)丙沙星的蓄積量隨著藥物處理時間的增加而增加。RT-PCR結(jié)果鷹嘴豆芽素A和環(huán)丙沙星作用MRSA16h后，norA 的表達(dá)量相對于陰性對照組降低了65%，其抑制效果優(yōu)于陽性對照利血平的48%。進(jìn)一步SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示其中與外排系統(tǒng)相關(guān)的蛋白除NorA蛋白明顯減少外，ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)體 ATP 結(jié)合蛋白也明顯減少。

2 協(xié)同抗生素對抗MRSA的植物源天然產(chǎn)物

2.1 黃酮類

黃酮類化合物多在自然界高等和蕨類植物中發(fā)現(xiàn)，2個具有酚羥基的苯環(huán)通過中央三碳原子相互連接而成的C6-C3-C6結(jié)構(gòu)單元為黃酮類化合物的重要特征，因其活性好、易獲得、副作用小的優(yōu)點(diǎn)得到研究者們的廣泛關(guān)注。黃酮類化合物同時具有親水與疏水結(jié)構(gòu)的分子特點(diǎn)是其具有抗菌活性的重要條件[22]，異戊烯基、烷基鏈和含氮或含氧雜環(huán)等疏水性基團(tuán)可增強(qiáng)其抗菌活性，改善生物利用度與藥物代謝和藥物動力學(xué)特性[23]；酚羥基的存在可增強(qiáng)查爾酮類化合物結(jié)合蛋白質(zhì)和穿透細(xì)胞質(zhì)膜的能力，增強(qiáng)殺菌活性的同時也產(chǎn)生了安全性問題[24]。文獻(xiàn)報道具有協(xié)同抗MRSA活性的植物源黃酮類化合物結(jié)構(gòu)式及其作用機(jī)制分別見圖2和表1。

2.2 萜類

萜類化合物在自然界中分布廣泛，具有龐雜的骨架結(jié)構(gòu)與多樣的生物活性，是天然產(chǎn)物中數(shù)量最多的一類化合物。從化學(xué)結(jié)構(gòu)來看，根據(jù)分子骨架中基本結(jié)構(gòu)異戊二烯單元的數(shù)目可分為單萜、倍半萜、二萜、二倍半萜、三萜等；其中五環(huán)三萜類化合物因具有包括抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)血糖、降血壓和抗腫瘤活性等藥理作用，成為目前天然藥物化學(xué)研究的一個熱點(diǎn)。在五環(huán)三萜類α-香樹脂醇、白樺脂酸和白樺醛酸對MRSA的抗菌作用的研究中，全基因組轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析闡明了其通過多個途徑對細(xì)菌起抑制作用，包括細(xì)胞分裂、雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)、ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體、脂肪酸生物合成、肽聚糖生物合成、氨酰-tRNA合成酶等[32-34]。圖3和表2分別列舉了具有協(xié)同抗生素對抗MRSA作用的萜類化合物結(jié)構(gòu)式與作用機(jī)制。

2.3 苯丙素類

苯丙素類指苯環(huán)與3個直鏈碳連在一起具有結(jié)構(gòu)單元（C6-C3）的化合物，包括苯丙烯及其氧化程度不同的衍生物、香豆素和木脂素等，香豆素類化合物因其抗病毒、抗腫瘤、抗菌、抗凝血等多種生物活性成為近年來的研究熱點(diǎn)，大量的全新的香豆素衍生物被合成研究。Kayser等[48]通過對一系列簡單香豆素類進(jìn)行抗菌活性測試，發(fā)現(xiàn)C6、C7、C8位被不同極性的基團(tuán)取代影響了其抗菌譜與抗菌活性。Qin等[49]對大量香豆素類衍生物進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系分析，結(jié)果表明含有雜環(huán)且與香豆素母體相連的給電子/吸電子取代基的存在對其抗菌活性有重要影響。圖4列舉了具有協(xié)同抗生素對抗MRSA作用的植物源苯丙素類化合物的結(jié)構(gòu)式。Zhang等[50]從丹參中提取出了一種未被報道的丹酚酸Ⅴ（29）和已知的丹酚酸B（30），通過體外聯(lián)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)兩者均可增強(qiáng)左氧氟沙星與硫酸黏菌素的抗MRSA活性。Ekambar等[51]發(fā)現(xiàn)迷迭香酸（31）與萬古霉素聯(lián)用在體外顯示出顯著的殺菌活性，通過SDS-PAGE對菌體表面蛋白進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)MSCRAMMs（一種細(xì)菌表面的毒力蛋白）在迷迭香酸的作用下被明顯抑制。Zuo等[52]發(fā)現(xiàn)4種香豆素類化合物——5-香葉氧基-7-甲氧基香豆素（32）、artanin（33）、異茴芹內(nèi)酯（34）、珊瑚菜素（35）可增強(qiáng)多種抗生素對抗MRSA的活性，使抗生素的MIC降低至原來的1/4～1/2。

2.4 醌類

醌類化合物在高等植物中分布比較廣泛，是指具有不飽和環(huán)二酮結(jié)構(gòu)或容易轉(zhuǎn)變?yōu)檫@種結(jié)構(gòu)的天然有機(jī)化合物，主要分為苯醌、萘醌、菲醌和蒽醌4種類型。圖5列舉了具有協(xié)同抗生素對抗MRSA作用的植物源醌類化合物的結(jié)構(gòu)式。Periasamy等[53]將提取自白花丹的白花丹素（36）分別進(jìn)行單獨(dú)與聯(lián)合的抗菌實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)其對多株臨床MRSA的MIC均在4～8 μg/mL，并且與環(huán)丙沙星、哌拉西林聯(lián)合顯示出協(xié)同作用；通過透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)經(jīng)過白花丹素的處理的細(xì)菌的細(xì)胞壁與細(xì)胞質(zhì)與空白組相比有明顯變化。大黃素（37）屬于蒽醌化合物，以游離和苷形式存在于蓼科植物掌葉大黃中，在體外可以有效抑制金黃色葡萄球菌生物膜的形成并破壞成熟的生物膜[54]，與苯唑西林、慶大霉素聯(lián)合產(chǎn)生了顯著的抗MRSA協(xié)同作用[55]。

2.5 生物堿

生物堿是一類重要的天然有機(jī)化合物，其多具有生物活性，常為許多藥用植物的有效成分；生物堿的雜原子可作為氫鍵供體或者受體，這促進(jìn)了其與靶點(diǎn)（蛋白質(zhì)、受體、酶等）的相互作用[56]。生物堿的性質(zhì)在現(xiàn)代抗菌藥物的發(fā)展中有著廣泛的應(yīng)用，對生物堿的研究促進(jìn)了喹諾酮類和硝基咪唑類藥物的發(fā)現(xiàn)，利奈唑胺、甲氧芐啶等藥物也具有生物堿結(jié)構(gòu)的骨架。圖6列舉了具有協(xié)同抗生素對抗MRSA作用的植物源生物堿類化合物的結(jié)構(gòu)式。Ahirrao等[57]發(fā)現(xiàn)蓽澄茄果實(shí)的甲醇提取物具有抑制金黃色葡萄球菌MrsA外排泵的作用，4種化合物被分離出來并與紅霉素進(jìn)行體外聯(lián)合實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)墻草堿（38）使紅霉素的MIC降低至原來的1/8，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明其可抑制外排泵和ATP的產(chǎn)生。Guay等[58]發(fā)現(xiàn)番茄堿（39）與慶大霉素具有協(xié)同對抗MRSA的作用，其類似物FC04-100同樣能協(xié)同多種抗生素對抗MRSA，并且顯示出抗生物被膜的作用。Zhou等[59]從止瀉木子中分離出的N-formylconessimine（40）和錐絲亞胺（41）具有協(xié)同青霉素和萬古霉素對抗MRSA與MSSA的活性。陳廣燦等[60]采用棋盤稀釋法對小檗堿（42）與幾種 β-內(nèi)酰胺類抗生素的聯(lián)合抗菌作用進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，亞抑菌濃度的小檗堿能使苯唑西林、頭孢唑林及氨芐西林的MIC值顯著降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)[61]小檗堿可以通過影響PSMs'聚集成淀粉樣纖維來抑制MRSA生物膜的形成，從而增強(qiáng)抗生素的殺菌活性。

2.6 其他

圖7列舉了未能歸于以上幾類的具有協(xié)同抗生素抗MRSA作用的植物源天然產(chǎn)物的化合物結(jié)構(gòu)式。Cleistochlamys kirkii （Benth） Oliv.屬于番荔枝科的一種常見于非洲的藥用植物，Pereira等[62]發(fā)現(xiàn)提取自其中的甾體化合物——polycarpol（43）可顯著增強(qiáng)阿莫西林和苯唑西林對MRSA的活性。大蒜素（44）是從蔥科蔥屬植物中提取的一種有機(jī)硫化合物，有研究顯示大蒜素與苯唑西林、頭孢唑啉、萬古霉素具有協(xié)同對抗MRSA作用[63]。Ahmad等[64]發(fā)現(xiàn)（+）松醇（45）與青霉素顯示出最強(qiáng)的協(xié)同作用，使青霉素對所有受試臨床分離菌的 MIC 降低至原來的 1/8～1/4，（+）松醇與其他β-內(nèi)酰胺如氨芐西林、苯唑西林和頭孢西丁的聯(lián)合應(yīng)用對所有受試臨床分離MRSA的MIC 減少至原來的 1/4～1/2。Chang等[65]發(fā)現(xiàn)多酚化合物 tellimagrandin II（46）在體外實(shí)驗(yàn)中增強(qiáng)了苯唑西林對抗MRSA的能力，實(shí)驗(yàn)證明兩者聯(lián)合可以抑制mecA基因的表達(dá)影響PBP2a蛋白的合成和親和力，同期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌細(xì)胞壁的損傷。

3 結(jié)語與展望

抗生素的濫用導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性進(jìn)程的加快，許多廣譜耐藥菌和“超級細(xì)菌”出現(xiàn)；另一方面新型抗生素的開發(fā)狀況也不容樂觀，將來是否會出現(xiàn)無藥可用的問題已成為世界密切關(guān)注的焦點(diǎn)之一。目前已發(fā)現(xiàn)許多天然產(chǎn)物具有抗菌活性，據(jù)統(tǒng)計[66]，2016—2019年間共有256個包括植物、微生物、海洋生物來源的具有良好活性的天然化合物被報道，其MIC均低于10 μg/mL或10 μmol/mL。同時天然產(chǎn)物與抗生素聯(lián)合使用可產(chǎn)生顯著的協(xié)同作用，甚至能夠逆轉(zhuǎn)細(xì)菌對某些抗生素的耐藥性，為耐藥菌感染的治療提供了新的思路。

盡管已有大量研究報道了天然產(chǎn)物協(xié)同抗生素抗耐藥菌，但是大多數(shù)都只是通過體外聯(lián)合抑菌試驗(yàn)來表征協(xié)同作用，對抗菌機(jī)制的研究也不深入。為了進(jìn)一步闡明協(xié)同作用及機(jī)制，筆者認(rèn)為，可以從以下3個方面開展研究：①藥物相互作用實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇。動物模型最能綜合反映藥物在生物體中的作用模式，高通量的動物模型方法的建立允許多個化合物分子通過單個動物模型確定協(xié)同作用[67]，但不同種屬和個體之間的結(jié)果可能并不適用?；诩?xì)胞的篩選方法可以相對高效地表征化合物分子之間的相互作用，而正確選擇合適的細(xì)胞系統(tǒng)來模擬不同的生理情況則極為重要[68-69]。②藥物相互作用數(shù)學(xué)模型的選擇。Bliss independence模型和Loewe additivity模型是模擬劑量-效應(yīng)曲線，并量化兩種或兩種以上化合物之間協(xié)同作用水平的常用模型[68]；ZIP模型（zero interaction potency model）結(jié)合了以上兩個模型的優(yōu)點(diǎn)，具有識別不同濃度范圍內(nèi)可能發(fā)生的多種聯(lián)合效應(yīng)的潛力，在高通量藥物聯(lián)合篩選方面表現(xiàn)出巨大的前景[70]。FICI（fractional inhibitory concentration index）在模型解讀方面被廣泛應(yīng)用并被不斷的進(jìn)行完善，最近的一篇報道對其進(jìn)行了更為合適的解讀，將FICI小于0.5定義為協(xié)同作用，0.5～1為相加作用，1～4為無關(guān)作用，大于4為拮抗作用[71]。③藥物相互作用的機(jī)制研究。化學(xué)基因組學(xué)通過發(fā)現(xiàn)基因與功能、藥物與基因表達(dá)之間的聯(lián)系，在確定活性化合物靶點(diǎn)的方面取得了巨大的進(jìn)步[72]；通過構(gòu)建基因組過表達(dá)和缺失株進(jìn)行抗菌劑篩選，利用這種方法可以將藥物敏感表型的變化快速定位到特定的基因上[73-74]。特征性靶標(biāo)鑒定方法“細(xì)菌細(xì)胞特征性分析”（BCP），使用最新的顯微鏡技術(shù)來快速有效鑒定受抑菌化合物影響的分子途徑，Nonejuie等[75]利用熒光顯微鏡技術(shù)成功發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物spirohexenolide A通過擾亂MRSA的質(zhì)子動力系統(tǒng)（PMF）起殺菌作用。

參 考 文 獻(xiàn)

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