HepG2腫瘤小鼠在越桔提取物影響下腸道菌群變化初探

朱良玉 周麗萍 王化 李夢莎 魏殿文 周琳 王振宇

【摘要】目的：從腸道菌群角度分析越桔提取物對HepG2腫瘤小鼠腸道菌群產(chǎn)生的影響。方法：建立HepG2腫瘤小鼠模型，將12只造模成功的小鼠分為模型組和劑量組，另選6只正常小鼠作為對照組。劑量組灌胃越桔提取物，其他組灌胃生理鹽水，21天后收集對照組、模型組和劑量組小鼠糞便，經(jīng)過16 s rRNA檢測，分析各組alpha 多樣性和不同分類水平上各組的微生物結(jié)構(gòu)。研究 HepG2腫瘤小鼠攝入越桔提取物后腸道菌群變化。結(jié)果：劑量組 Observed species、Chao、Ace和Shannon指數(shù)高于模型組和對照組， Simpson指數(shù)低于模型組和對照組; Proteobacteria 菌群、Enterobacteriaceae菌群和Ruminococcus菌群在劑量組顯著低于模型組。結(jié)論：表明灌胃越桔提取物可以改變致病小鼠菌群豐富度，增加有效菌群的多樣性，并降低致病機(jī)體中豐富度高的菌群。越桔提取物為調(diào)節(jié) HepG2腫瘤小鼠腸道微生物的組成起到積極地作用。

【關(guān)鍵詞】越桔;腸道菌群; HepG2腫瘤;16s rRNA檢測

【中圖分類號】Q93-3【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-5249（2022）15-0001-05

Study on changes of intestinal flora of HepG2 tumor mice under the influence of lingonberry extract

Zhu Liang-yu1，2，Zhou Li-ping 1，Wang Hua 1，Li Meng-sha 1，Wei Dian-wen1，Zhou Lin1，Wang Zhen-yu3△

1.Institute of Natural and Ecology，Heilongjiang Academy of Sciences，Harbin 150040，China 2.School of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，China

3.Department of? Biochemical Engineering ，School of Food Science and Engineering ，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，China

【Abstract】Objective：The e?ect of lingonberry extract on intestinal ?ora of HepG2 tumor mice was analyzed from the perspective of intestinal ?ora.Methods：HepG2 tumor mouse model was established，and 12 successfully modeled mice were divided into model group and dose group，and 6 normal mice were selected as control group. The dose group was intragastric with lingonberry extract，and the other groups were intragastric with normal saline. After 21 days，feces of mice in control group，model group and dose group were collected，and the alpha diversity and microbial structure of each group at di?erent classi?cation levels were analyzed by 16s rRNA detection. To study the changes of intestinal ?ora in HepG2 tumor mice after ingesting lingonberry extract. Results：Indexes of observed species，chao，ace and shannon in dose group were higher than those in model group and control group，while Simpson index was lower than those in model group and control group. Proteobacteria，Enterobacteriaceae and Ruminococcus in dose group were signi?cantly lower than those in model group. Conclusion：The results showed that lingonberry extract could change the richness of pathogenic bacteria，increase the diversity of e?ective bacteria，and decrease therichness of pathogenic bacteria. Lingonberry extract plays an active role in regulating intestinal microbe composition of HepG2 tumor mice.

【Key words】Lingonberry;Intestinal ?ora;HepG2 cancer;16 s rRNA sequencing

腸道中含有著大量的微生物，這些微生物稱為腸道菌群。腸道菌群可構(gòu)成一個(gè)巨大而復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，對人類健康有著非常重要的作用[1]。腸道菌群處于健康的平衡狀態(tài)，致病菌或者條件致病菌產(chǎn)生的有毒代謝物不足以對宿主的健康產(chǎn)生危害。當(dāng)健康微生物菌群比例、多樣性和結(jié)構(gòu)發(fā)生改變時(shí)，這種平衡就會被打破，出現(xiàn)腸道菌群失調(diào)現(xiàn)象。這種生態(tài)失衡已被證實(shí)與包括腫瘤、消化系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病在內(nèi)的多種疾病直接或間接相關(guān)[2]，健康個(gè)體和患病個(gè)體的微生物群落組成存在顯著差異[3]，雖然關(guān)聯(lián)研究不能區(qū)分微生物群的變化是癌癥的原因還是結(jié)果，但是微生物群可以通過多種機(jī)制影響癌癥的進(jìn)展[4]。不同的微生物菌群對腸道環(huán)境和結(jié)構(gòu)有著不同程度的改變，這些變化影響著癌癥患者腸道中的生態(tài)平衡，利用微生物對生物機(jī)體的影響來觀測和治療癌癥已經(jīng)被證實(shí)其可行性，逐漸成為未來研究的熱點(diǎn)[5-6]。

肝癌是一種最普遍、最致命的癌癥疾病，一些早期的研究表明來自化療藥物的腸道微生物也可以在癌癥治療中發(fā)揮作用[7]，許多試驗(yàn)正在探索調(diào)節(jié)腸道微生物的策略來增強(qiáng)對癌癥治療的反應(yīng)，包括使用糞便微生物群移植與功能食物的輔助干預(yù)[8-9]。腸道菌群在肝癌的治療中起著媒介與催化的作用，調(diào)整腸道菌群的結(jié)構(gòu)可以輔助藥物在體內(nèi)的代謝和吸收，同時(shí)激活宿主免疫應(yīng)答[10]。目前有關(guān)腸道菌群在肝癌中的研究已成為新的研究熱點(diǎn)，更多相關(guān)機(jī)制作用的研究還待展開。

越桔屬于杜鵑花科越橘屬植物，為多年生落葉或常綠灌木或小灌木樹種，是我國北方特色漿果資源，主要分布在東北的長白山及大、小興安嶺一帶的原始森林中，具有高發(fā)價(jià)值、野生資源分布集中、資源儲量大的優(yōu)勢和特點(diǎn)。越桔果實(shí)含有豐富的營養(yǎng)成分，具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗癌防癌等作用，是開發(fā)食品極好的天然原料[11]。有研究表明[12]，作為功能性食品成分的漿果或漿果提取物通常能夠改變腸道微生物群的組成和多樣性，抑制致病菌，促進(jìn)宿主體內(nèi)有益細(xì)菌的生長，恢復(fù)腸道失調(diào)，這些功能性食物具有類似益生元的活性，對健康起到積極作用[13]。

本研究以越桔提取物為原料，將0.1mg/g 越桔提取物灌胃到接種 HepG2細(xì)胞的 BALB/c Nude 小鼠中，通過16 s rRNA 檢測小鼠的糞便來分析腫瘤小鼠的腸道菌群變化，為進(jìn)一步研究漿果對 HepG2腫瘤小鼠的腸道菌群變化打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 越桔提取物制備

以采自大興安嶺地區(qū)的越桔成熟果實(shí)為原料。越桔鮮果搗碎，70%乙醇粗提，三層紗布過濾，旋轉(zhuǎn)濃縮后凍干成粉備用。越桔提取物灌胃時(shí)用生理鹽水稀釋至0.1 mg/g ，4℃冰箱避光保存。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

雄性 BALB/c Nude 小鼠30只，SPF 級，3周齡，平均體重18 g，健康狀況良好，購自北京維達(dá)利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證編號：SYXK（京）2016-0006，在無病原體環(huán)境下飼養(yǎng)，潔凈等級SPF 級，適應(yīng)一周后，未接種 HepG2細(xì)胞的6只小鼠為對照組，其他組小鼠右側(cè)皮下接種5×105 HepG2細(xì)胞。接種腫瘤10d 后，將造模成功的小鼠按腫瘤大小隨機(jī)分為兩組，每組6只，命名為模型組和劑量組。劑量組每天灌胃0.1 mg/g 越桔提取物，模型組與對照組灌胃等計(jì)量生理鹽水，共計(jì)21天。21天后小鼠 IVC 籠盒中實(shí)施 CO2安樂死。

1.3 糞便樣本16 s rRNA檢測

灌胃越桔提取物后第21天收集小鼠糞便，每組隨機(jī)收集3只小鼠的糞便儲存于凍存管液氮中保存，取質(zhì)量合格的基因組 DNA 樣品30 mg 及對應(yīng)的融合引物配置 PCR 反應(yīng)體系，設(shè)置 PCR 反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，使用AgencourtAMPure XP 磁珠對 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化并溶于 Elution Bu?er，貼上標(biāo)簽，完成建庫。使用 Agilent 2100 Bioanalyzer 對文庫的片段范圍及濃度進(jìn)行檢測。檢測合格的文庫根據(jù)插入片段大小，選擇HiSeq平臺進(jìn)行測序。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 腸道微生物Alpha多樣性分析

腸道微生物 Alpha 多樣性分析是微生物多樣性分析的重要組成部分，主要關(guān)注局域均勻生境下物種多樣性程度。其分析指標(biāo)主要包括 Observed species 指數(shù)-樣品中群落豐富度、Chao 指數(shù)-用 Chao1算法評估樣品中所含 OUT 數(shù)目、Ace 指數(shù)-評估群落中 OTU 數(shù)目、Shannon 指數(shù)-估算樣品中微生物多樣性、 Simpson 指數(shù)-估算樣品中微生物多樣性。其中 Observed species 指數(shù)、Chao 指數(shù)和 Ace 指數(shù)的數(shù)值越大，群落豐富度越大。Shannon 指數(shù)的數(shù)值越大說明群落多樣性越高。 Simpson 指數(shù)的數(shù)值反映的是優(yōu)勢種在群落中的地位和作用，一個(gè)群落中優(yōu)勢種多則其他非優(yōu)勢種比例減少，所以 Simpson 指數(shù)的數(shù)值越大群落多樣性越低。

1.4.2 不同分類水平的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)分析

在16s rRNA 分子水平上，腸道微生物被按照 DNA 相似性，做出了不同級別的分類。分類等級為：界、門、綱、目、科、屬、種、株。本研究選擇具有代表性的門、科和屬水平進(jìn)行腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用 IBM SPSS Statistics 26.0進(jìn)行 ANOVA 檢驗(yàn)分析。組間均數(shù)兩兩比較，采用最小顯著性差異法（LSD）;所有數(shù)據(jù)均以（ `x± s ）表示，數(shù)據(jù)保留小數(shù)點(diǎn)后2位，超過兩位不顯示，當(dāng) P<0.05為有顯著差異，標(biāo)記為*。制圖軟件采用 GraphPad Prism 8.0.2。

2 結(jié)果

2.1 腸道菌群alpha多樣性分析

對劑量組、模型組和對照組進(jìn)行腸道微生物 alpha 多樣性分析發(fā)現(xiàn)，劑量組 Observed species（424.33±9.07）、Chao （463.117±17.14）、Ace （458.89±12.17）和 Shannon（4.26±0.14）指數(shù)相對于模型組 Observed species（373.33±46.23）、Chao（399.46±33.31）、Ace（405.11±34.84）和 Shannon（3.79±0.42）和對照組 Observed species（387±39.15）、Chao（442.74±42.81）、Ace（433.26±49.06）和 Shannon（3.82±0.09）數(shù)值增加。劑量組 Simpson（0.04±0.01）指數(shù)相對于模型組 Simpson（0.07±0.04）和對照組 Simpson（0.07±0.02）數(shù)值減少，這說明劑量組的腸道菌群豐度高于模型組和對照組，微生物多樣性豐富，優(yōu)勢種少，群落多樣性高。見圖1-1至圖1-5。

2.2 不同分類水平的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)比較

在門水平上，F(xiàn)irmicutes 和 Bacteroidetes 菌群在劑量組、模型組和對照組中占主導(dǎo)地位，見圖2-1;Proteobacteria 菌群在模型組顯著高于對照組和劑量組，見圖2-2。

在科水平上，優(yōu)勢菌群為 S24-7。Enterobacte- riaceae菌群在模型組顯著高于對照組和劑量組，見圖3-1;Bacteroidaceae菌群在模型組（0.04±0.01）顯著高于劑量組（0.02±0.01），見圖3-2。

在屬群水平上，未見明顯優(yōu)勢菌群，見圖4-1;Ruminococcus菌群在模型組顯著高于劑量組，見圖4-2。綜合來看在門、科和屬3種不同的分類水平上的腸道微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)中，相對于模型組，劑量組有顯著差異的菌群均為減少該菌群的含量。

3 討論

在腸道中任何一種菌群的豐度或者數(shù)量減少，可能都會導(dǎo)致疾病的發(fā)生，腸道微生物的比例失調(diào)往往有著內(nèi)在和外在的雙重因素。了解微生物在的腸道中的分布特性與實(shí)時(shí)結(jié)構(gòu)變化趨勢，可協(xié)助疾病更好的診斷和治療。在研究中發(fā)現(xiàn)，越桔提取物的攝入可以使致病小鼠的腸道菌群發(fā)生變化，在菌群 Alpha 多樣性比較中發(fā)現(xiàn)劑量組的菌群豐度和多樣性高于模型組和對照組，通過門、科和屬水平分析三組的菌群構(gòu)成發(fā)現(xiàn)，相對于模型組，劑量組顯著降低了菌群 Proteobacteria 和 Enterobacteriaceae 的含量，這兩種菌群有研究報(bào)道表明在癌癥人群中有顯著高豐度[14]。相對于模型組，劑量組還顯著降低 Bacteroidetes 菌群的含量，這種菌群在未發(fā)生結(jié)腸炎的患者中觀察到較高比例[15]。但是需要注意的是，相對于模型組，劑量組顯著降低的Ruminococcus菌群在以往的研究中是一種有益菌，這種菌群可以產(chǎn)生短鏈脂肪酸，使細(xì)菌酸化保護(hù)腸道環(huán)境免受多種病原的侵害，對宿主在生理和免疫方面起到正向作用[16]。

綜合以上分析，數(shù)據(jù)表明：越桔提取物雖然降低了致病機(jī)體中豐度高的菌群，但同時(shí)也抑制了具有積極作用的菌群。究竟是越桔提取物中的哪種成分抑制了有益菌，哪種成分抑制了致病菌，目前還不清楚，需要進(jìn)一步的研究。

在實(shí)驗(yàn)中把越桔提取物作為整體來研究，其優(yōu)勢是解決了提取物成分復(fù)雜很難單獨(dú)分離的問題，同時(shí)很好的挖掘了越桔漿果潛在的協(xié)同作用，但缺點(diǎn)是無法確定起到作用的真正物質(zhì)和結(jié)構(gòu)，這也是接下來的研究方向。

4結(jié)論

研究證實(shí)了越桔提取物對 HepG2腫瘤小鼠的腸道菌群產(chǎn)生一定程度的影響，這種影響對其腸道菌群結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，增加了腸道菌群的多樣性，降低致病機(jī)體中豐富度高的菌群含量，這些發(fā)現(xiàn)表明了越桔提取物在輔助治療癌癥中的巨大潛力。但是越桔提取物也降低了有益菌群的含量，具體機(jī)制和原因還待更深入的研究。本研究是越桔提取物對 HepG2腫瘤小鼠腸道菌群變化的影響初探，為進(jìn)一步挖掘越桔提取物對腫瘤小鼠的腸道微生物作用打下基礎(chǔ)，同時(shí)也為更好的設(shè)計(jì)越桔類漿果輔助高效干預(yù)治療腫瘤策略提供參考。

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（收稿日期：2021-12-24）