固相萃取-離子色譜法測定鮮筍中的草甘膦含量

丁敏，方燕，陸軍，王衍彬，倪榮新，胡靜波，楊柳

（1.麗水市森林資源保護(hù)管理總站，浙江 麗水，323000；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州，310023；3.淳安縣千島湖林場，浙江 淳安 311700）

竹筍是我國長江以南地區(qū)的一類常見蔬菜，其獨特的品質(zhì)和口感深受大眾喜愛，也是竹農(nóng)增收、推動山區(qū)經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要支柱產(chǎn)品。近年來，人工除草已成為竹筍撫育的主要方式，在高效益的驅(qū)使下，農(nóng)藥、化肥和除草劑的使用量逐年攀升，特別是草甘膦（Glyphosate）的使用[1-3]。草甘膦是1971 年由Monsanto 公司開發(fā)出在世界農(nóng)業(yè)中具有劃時代意義的廣譜除草劑，占全球農(nóng)藥總用量的15%，已成為世界上使用最廣、銷量最大的化學(xué)除草劑[4]。雖然有研究證實草甘膦及其主要代謝產(chǎn)物氨甲基膦酸（AMPA）在短期內(nèi)不會對植物生長、人類和其他哺乳動物產(chǎn)生明顯的負(fù)面影響，但長期單一地大量使用仍會給土壤環(huán)境[5-6]與人類帶來了巨大的潛在風(fēng)險[7-9]。鑒于此，《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》（GB2763—2021）對草甘膦在部分農(nóng)產(chǎn)品中的殘留作了明確規(guī)定，水果、油脂、茶葉中草甘膦的殘留限量分別為0.1 mg·kg-1、0.05 mg·kg-1和1 mg·kg-1。目前，草甘膦殘留量的檢測方法已有報道[10-11]，主要有分光光度法[12]、氣相色譜法[13-14]、氣-質(zhì)聯(lián)用法[15-17]、液相色譜法[18-19]、液-質(zhì)聯(lián)用法等[20-21]和離子色譜法[22-23]，這些方法中氣相色譜、氣質(zhì)聯(lián)用和反相液相色譜分析都需經(jīng)柱前衍生，如GB/T 2 3750—2009、SN/T1923—2007，測試操作難度較大。液-質(zhì)聯(lián)用法雖不用衍生，但儀器價格昂貴，檢測費用較高，這都為草甘膦的檢測帶來一定困難。離子色譜法不需要衍生，但主要以水質(zhì)樣品為主，用于測定植物樣品中的草甘膦研究較少，這應(yīng)與植物樣品成分相對較復(fù)雜，目標(biāo)物在色譜柱內(nèi)較難分離，以致在離子色譜檢測器端雜峰較多，檢出限難以保證有關(guān)。而采用固相萃取小柱對提取液做進(jìn)一步凈化處理或可解決這一問題。

草甘膦的使用雖然降低了成本、提高了產(chǎn)量，帶來了短期效益，但由此帶來的安全問題又成了關(guān)注焦點。為此，本文針對草甘膦是可電離物質(zhì)、在水溶液中帶負(fù)電荷的特點，以水為提取劑，對毛竹Phyllostachys edulis冬筍中的草甘膦進(jìn)行提取，用固相萃取小柱對提取液進(jìn)行凈化處理，并采用離子色譜對冬筍中的草甘膦進(jìn)行定量分析，建立一種可對竹筍中草甘膦含量進(jìn)行精準(zhǔn)定量測定的方法，以期及時掌握竹筍中的草甘膦含量，為制定這類農(nóng)產(chǎn)品中相應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 實驗設(shè)備與工作條件

DIONEX ICS-2000 離子色譜系統(tǒng)（美國DIONEX 公司，包括KOH 淋洗液發(fā)生器，ASRS-ULTRA 陰離子抑制器，DS 電導(dǎo)檢測器，Chromeleon6.8 色譜工作站），Milli-Q 超純水系統(tǒng)（電阻率18.2MΩ.cm），IKA MS3 basic旋渦混合器，IKA T18 basic 高速分散器，Autoscience AS3 120A 超聲波清洗器、離心機(jī)（盧湘儀TGL-20M），多功能柱（MycoSep 226 AflaZon+），弗羅里硅土柱（SFS10006），氨基柱（1 g，6mL），微孔濾膜（0.45 μm，水相）。

色譜條件：IonPac AS19 分析柱（4 mm×250 mm，美國Thermo 公司）、IonPac AG19 保護(hù)柱（4 mm×50 mm，美國Thermo 公司）；檢測器：ASRS ULTRA 4 mm 抑制電導(dǎo)檢測器（美國Thermo 公司），100 mA 電流自動抑制循環(huán)模式。淋洗液：30 mM KOH；柱流速：1.0 mL·min-1；溫度：30℃；進(jìn)樣體積：25 μL。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液

草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg·L-1），購于上海安譜實驗科技股份有限公司，使用時用超純水稀釋至相應(yīng)濃度。

1.3 供試樣品與提取方法

供試冬筍為2020 年新鮮冬筍，購買自杭州市西湖區(qū)留下鎮(zhèn)世紀(jì)聯(lián)華超市。冬筍樣品經(jīng)自來水沖洗去除泥土等外物后剝離外部筍衣，僅以可食用部分為供試樣品，將供試樣品進(jìn)行粉碎、收集供后續(xù)實驗使用。稱取粉碎后的冬筍試樣5.0 g 于50 mL 離心管中，加入20 mL 超純水，高速渦旋1 min，然后置于離心機(jī)中，以8 000 r·min-1離心10 min，取上清液過弗羅里硅土小柱凈化，棄去前5 mL，吸取2 mL 濾液過0.45 μm 微孔濾膜于進(jìn)樣瓶中，待上機(jī)測定。

1.4 提取方法的選擇

分別采用均質(zhì)、渦旋震蕩和超聲3 種提取方式對冬筍中的草甘膦進(jìn)行提取，并以回收率試驗對提取方法進(jìn)行驗證。試驗稱取粉碎后的冬筍試樣5.0 g 于50 mL 離心管中，加入草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中的草甘膦濃度均為1 mg·kg-1，混勻后加入20 mL 超純水，分別采用均質(zhì)（10 000 r·min-1，1 min）、渦旋震蕩（3 000 r·min-1，1 min）和超聲（4 kH z，30 m in）3 種方法對試樣中的草甘膦進(jìn)行提取，待提取完成后置于離心機(jī)中，以8 0 00 r·min-1離心10 mi n，取上清液過弗羅里硅土小柱凈化，棄去前5 mL 后接于進(jìn)樣瓶中，待上離子色譜儀分析測定。以回收率對提取方式進(jìn)行選擇，各處理重復(fù)6 次。由于冬筍的含水率均在80%以上，故在計算回收率時，提取液體積按24 mL 計算（以下同）。

1.5 凈化柱的選擇

稱取粉碎后的冬筍試樣5.0 g于50 mL離心管中，加入草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中的草甘膦濃度均為1 mg·kg-1，加入20 mL 超純水，高速渦旋1 min，然后置于離心機(jī)中，以8 000 r·min-1離心10 min，取上清液分別過弗羅里硅土小柱、免疫親和柱、氨基柱凈化，棄去前5 mL 后接于進(jìn)樣瓶中，待上離子色譜儀分析測定。以回收率對凈化柱進(jìn)行選擇，各處理重復(fù)6 次。

1.6 回收率和精密度

稱取粉碎后的冬筍試樣5.0 g 多份于50 mL 離心管中，加入草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，使樣品中的草甘膦濃度分別為0.1 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1，按1.4 所述方法進(jìn)行前處理并上離子色譜儀分析測定。各濃度處理重復(fù)6 次。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式的確定

基于草甘膦不溶于有機(jī)溶劑且極性極強(qiáng)的特性，在選擇提取劑時，以乙腈-水[20]、純水[21]較為常見，其中乙腈-水適合脂肪含量較高的樣品，純水更適合以纖維和淀粉、多糖含量為主的植物樣品，故本研究選擇以純水為提取試劑。鑒于本研究供試樣品的物理性狀，如含水量高，干物質(zhì)以纖維為主等，選擇均質(zhì)、超聲和渦旋振蕩等農(nóng)藥殘留檢測的常規(guī)提取方法對試驗樣品進(jìn)行提取[24]，各處理的6 次重復(fù)的回收率結(jié)果如表1 所示。由表1可知，3 種提取方式均能有效地將冬筍中的草甘膦提取出來，回收率均大于85%，且采用均質(zhì)和渦旋振蕩方法提取的平均回收率都在90%以上，超聲法提取的回收率略低。3 種提取方式的回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD，relative standard deviation）也均低于3%，其中以渦旋振蕩的最低，僅為1.3%，超聲的略高，但也僅為1.8%。試驗中超聲提取時間設(shè)置為30 min，如適當(dāng)延長超聲時間可提高萃取率。雖然渦旋振蕩與均質(zhì)均能達(dá)到相近的提取效果，但考慮到渦旋振蕩提取方式更為便捷，故本試驗選擇渦旋振蕩為提取方式。

表1 不同提取、凈化方式對樣品中的草甘膦回收率的影響Table 1 Effect of different extraction and purification method on recovery rate

2.2 凈化柱的確定

冬筍提取液中含有大量的可溶性固形物、蛋白質(zhì)、色素等物質(zhì)，可能會對檢測結(jié)果產(chǎn)生較大的不良影響，應(yīng)采用相應(yīng)方法去除這類物質(zhì)，而固相萃取法則是常見的農(nóng)藥殘留凈化方法。本研究即選用了可有效吸附這類大分子物質(zhì)的固相小柱—多功能柱、弗羅里硅土柱和氨基柱對冬筍提取液進(jìn)行凈化處理，經(jīng)測定得到這3 種凈化方法的回收率，結(jié)果如表1。由表1 可知，3 種處理方式均能使提取液中的草甘膦得以凈化，回收率均在85%以上，其中又以弗羅里硅土柱凈化后的回收率最高，其平均回收率可達(dá)91.4%，多功能柱凈化后的回收率略低。3 種凈化方法的回收率相對標(biāo)準(zhǔn)偏差也均低于3%，其中以弗羅里硅土柱的最低，僅為1.3%，氨基柱的相對較高，為2.3%。凈化處理可有效去除提取液中的大部分糖類、蛋白質(zhì)、單寧、黃酮等物質(zhì)，使得草甘膦色譜峰形獨立、完整，從而降低檢出限、提升精密度。本次試驗中，雖然3 種凈化方法均有良好的回收率，但結(jié)合相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，本試驗選擇弗羅里硅土柱為凈化柱，所得樣品譜圖如圖1、圖2 所示。分別為0.2 μg·mL-1草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液譜圖（1 號譜線）和與標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度相等的測定液譜圖（2 號譜線）。

圖1 濃度為0.2 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品測定液譜圖Figure 1 Spectrogram of standard solution with concentration of 0.2μg/mL and sample

圖2 草甘膦出峰位置局部放大圖Figure 2 Partial enlarged detail of peak position of glyphosate

2.3 工作曲線與檢出限

將冬筍空白樣品按1.3 節(jié)所述方法進(jìn)行處理，收集過弗羅里硅土小柱凈化后的凈化處理液并過0.45 μm 微孔濾膜，得冬筍基質(zhì)提取液。用冬筍基質(zhì)提取液將草甘膦分別配制成0.1、0.2、0.6、1.2、2.0 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.2 節(jié)所述色譜條件進(jìn)樣分析，以濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別將濃度為0.1、0.2、0.6、1.2、2.0 μg·mL-1的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液上離子色譜儀分析測定，以標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為：y=0.995 9x+0.005 8，以3 倍噪聲為檢出限，計算得到檢出限為0.02 mg·kg-1。

2.4 回收率與精密度

在冬筍樣品中分別添加濃度為0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1的草甘膦標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述最優(yōu)方法進(jìn)提取、檢測，重復(fù)6 次，測定其回收率與精密度。

對添加草甘膦濃度為0.2 mg·kg-1、1.0 mg·kg-1、2.0 mg·kg-1的冬筍樣品，按照1.3 節(jié)所述方法進(jìn)提取、檢測，各處理重復(fù)6 次，測定其回收率與精密度，結(jié)果如表2 所示。由表2 可知，高、中、低濃度的草甘膦平均回收率在86%～93%，變異系數(shù)≤2.5%，說明該方法回收率好，精密度高，可滿足冬筍中草甘膦殘留的測定。

表2 草甘膦回收率和精密度Table 2 Recovery rate of glyphosate and accuracy

3 小結(jié)與討論

以超純水為提取劑，采用高速渦旋振蕩法對冬筍中的草甘膦進(jìn)行提取，經(jīng)離心、弗羅里硅土小柱凈化后上離子色譜儀分析測定，基質(zhì)外標(biāo)法定量，建立了固相萃取-離子色譜法測定竹筍中的草甘膦。3 種提取方法中，渦旋振蕩提取法通常適用于附著在樣品表面的農(nóng)藥以及葉類樣品中的非內(nèi)吸性農(nóng)藥，草甘膦雖為內(nèi)吸性農(nóng)藥，但其水溶性極強(qiáng)，且鮮筍樣品中含水量高，干物質(zhì)以纖維等親水物質(zhì)為主，同時，本方法提取劑為超純水，這是渦旋振蕩法成為本方法選用的客觀因素。超聲提取和均質(zhì)提取均可作為本研究的提取方法，超聲更適用于批量處理。本研究方法前處理簡單，選擇性好，靈敏度高，有機(jī)溶劑消耗量小，樣品無需使用酸堿試劑調(diào)節(jié)pH，無需衍生，快速準(zhǔn)確，用于鮮筍中草甘膦的快速測定，具有一定的推廣價值。