扇貝裙邊糖胺聚糖體外抗HSV2病毒的實(shí)驗(yàn)研究

于囡,韓建建,劉賽

[摘要]目的? ?探討扇貝裙邊糖胺聚糖（SS-GAG）對單純皰疹病毒2型（HSV-2）的體外抗病毒作用。 方法? ? 觀察病毒對宿主細(xì)胞（Vero細(xì)胞）的形態(tài)影響和毒性反應(yīng)。采用噻唑藍(lán)法檢測SS-GAG對Vero細(xì)胞的毒性作用以及不同濃度SS-GAG對HSV-2的直接滅活、抑制復(fù)制活性及綜合作用等。結(jié)果? ?SS-GAG在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)對Vero細(xì)胞均無毒性。與病毒對照組相比，SS-GAG各濃度組（50、100、200 mg/L）能有效保護(hù)經(jīng)HSV-2感染的Vero細(xì)胞，使細(xì)胞活性增強(qiáng)（F=20.061、39.947，P<0.01），并減弱HSV-2導(dǎo)致的病變效應(yīng)，抑制病毒的復(fù)制，但是SS-GAG對HSV-2沒有直接滅活作用。結(jié)論? ?SS-GAG在體外實(shí)驗(yàn)中顯示出保護(hù)宿主細(xì)胞及抵抗HSV-2感染的活性作用，提示其在抗HSV-2活性方面具有進(jìn)一步研究的潛力。

[關(guān)鍵詞]扇貝科;多糖類;皰疹病毒2型，人;抗病毒藥;Vero細(xì)胞

[中圖分類號]R343;R373.9

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]2096-5532（2022）04-0611-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2022.58.140

[開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）]

[網(wǎng)絡(luò)出版]https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20220822.1545.009.html;[JY]2022-08-2310：26：29

ANTIVIRAL EFFECT OF GLYCOSAMINOGLYCAN FROM SCALLOP SKIRT AGAINST HERPES SIMPLEX VIRUS TYPE 2 IN VITRO： AN EXPERIMENTAL STUDY

YU Nan， HAN Jianjian， LIU Sai

（Scientific Research Department， Qingdao Eighth Peoples Hospital， Qingdao 266121， China）

[ABSTRACT] Objective To investigate the antiviral effect of glycosaminoglycan from scallop skirt （SS-GAG） against herpes simplex virus type 2 （HSV-2） in vitro.

Methods The influence of HSV-2 on the morphology of host cells （Vero cells） and the toxicity of HSV-2 on cells were observed. MTT assay was used to observe the toxicity of SS-GAG on Vero cells and the effect of different concentrations of SS-GAG on HSV-2 in terms of direct inactivation， inhibition of replication activity， and comprehensive effect.

Results SS-GAG had no toxicity to Vero cells within the experimental concentration range. Compared with the virus control group， the SS-GAG treatment groups （50， 100， and 200 mg/L） showed effective protection of Vero cells infected with HSV-2 and significantly improved their viability （F=20.061，39.947;P<0.01）， and meanwhile， SS-GAG treatment reduced the cytopathic effect induced by HSV-2 and inhibited virus replication， while SS-GAG had no direct inactivation effect on HSV-2.

Conclusion SS-GAG has the activity of protecting host cells and defending against HSV-2 infection in vitro， suggesting that further studies are needed to investigate its anti-HSV-2 effect.

[KEY WORDS] pectinidae; polysaccharides;? herpesvirus 2， human; antiviral agents;? vero cells

單純皰疹病毒2型（HSV-2）屬于α皰疹病毒類型，為線性雙鏈DNA病毒，該病毒引起的生殖器皰疹越來越受到關(guān)注，嚴(yán)重影響了人類公共衛(wèi)生健康[1-3]。同時(shí)研究表明，HSV-2感染者感染人類免疫缺陷病毒的概率也會大大增加[4]。目前臨床上常用的抗 HSV 藥物有阿昔洛韋、噴昔洛韋等[5-6]，但隨著耐藥株的出現(xiàn)，尋找具有對抗 HSV 活性的新藥物極其重要[7]。近年來，關(guān)于海洋多糖的研究及開發(fā)利用成為研究熱點(diǎn)[8-11]。扇貝裙邊糖胺聚糖 （SS-GAG）是從青島渤海灣櫛孔扇貝裙邊中提取、純化得到的酸性黏多糖 （即硫酸多糖），又稱為氨基多糖，其紅外線光譜圖與透明質(zhì)酸較為接近[12]。海洋多糖具有多種藥理活性，包括抗凝血[13-14]、抗粥樣硬化[15-18]、抗病毒[19-21]、增強(qiáng)免疫[22]、抗腫瘤[23]等作用。目前尚未有關(guān)于SS-GAG的抗HSV-2作用的文獻(xiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將首次在細(xì)胞水平上探討SS-GAG對HSV-2的抗病毒作用，以期為臨床治療皰疹提供依據(jù)以及為海洋多糖藥物的研發(fā)提供新的思路。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1試劑與儀器SS-GAG為青島大學(xué)藥學(xué)院扇貝多糖課題組采用酶解、醇沉、精制的方法提取分離并干燥的粉末制劑，實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)用無血清DMEM培養(yǎng)液配制成不同濃度的溶液。細(xì)胞生長液為含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清（FBS）的高糖DMEM培養(yǎng)液，細(xì)胞生長維持液為含體積分?jǐn)?shù)0.02 FBS的高糖DMEM培養(yǎng)液。試劑二甲基噻唑二苯基四唑溴鹽（MTT）為Sigma公司產(chǎn)品。DMEM干粉培養(yǎng)基以及FBS為上海生工生物工程股份有限公司產(chǎn)品。ELx 800型酶聯(lián)免疫檢測儀購自美國BioTek公司;TC2323型CO2培養(yǎng)箱購自美國Forma Scientific公司;超凈工作臺購自蘇凈集團(tuán)安泰公司;XDP-1型倒置顯微鏡購自日本Olympus公司。

1.1.2細(xì)胞株及病毒株非洲綠猴腎細(xì)胞（Vero細(xì)胞）和標(biāo)準(zhǔn)HSV-2病毒，均由青島大學(xué)微生物與病原生物學(xué)教研室友情惠贈。病毒在Vero細(xì)胞中傳代培養(yǎng)，-80 ℃保存。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1病毒毒力測定[24-25]將Vero細(xì)胞以每孔2×104個(gè)的密度接種于96孔板，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，棄去原培養(yǎng)液，加入梯度稀釋的HSV-2病毒液（10-9～10-1），吸附2 h后更換細(xì)胞生長維持液繼續(xù)培養(yǎng)。每天通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞病變情況（CPE）。當(dāng)CPE達(dá)50%以上計(jì)為病變孔，記錄病變程度和孔數(shù)，待細(xì)胞病變穩(wěn)定后判定結(jié)果。根據(jù)Reed-Muench方法計(jì)算病毒的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量（TCID50），以其表示病毒毒力。

1.2.2藥物對細(xì)胞毒性測定將Vero細(xì)胞懸液稀釋成108/L接種于無菌96孔板，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，棄去原培養(yǎng)液，換為含有不同濃度SS-GAG（50、100、200、400、800、1 600 mg/L）的維持液，每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔，另設(shè)正常細(xì)胞對照組（正常對照組）。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。通過倒置顯微鏡觀察細(xì)胞CPE。細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μL的MTT，當(dāng)孔內(nèi)出現(xiàn)甲瓚結(jié)晶時(shí)，棄去MTT染液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（DMSO），充分混勻后在酶聯(lián)儀570 nm波長處測定每孔吸光度（A值），并計(jì)算Vero細(xì)胞存活率。公式如下：Vero細(xì)胞存活率（%）=SS-GAG組平均A值/正常對照組平均A值×100%，以其反映SS-GAG對Vero細(xì)胞增殖活性的影響。

1.2.3SS-GAG對HSV-2的直接滅活作用[26]將不同濃度的SS-GAG（50、100、200 mg/L）與100 TCID50的HSV-2病毒液等量混合后，37 ℃作用4 h。將孵育后的混合液加入單層Vero細(xì)胞孔中（每孔200 μL），37 ℃吸附2 h，棄上清換為體積分?jǐn)?shù)0.02的DMEM維持液培養(yǎng)72 h。每日在倒置顯微鏡下觀察由病毒引起的CPE，并記錄結(jié)果。同時(shí)設(shè)病毒對照組、正常細(xì)胞對照組，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。當(dāng)病毒對照組細(xì)胞病變達(dá)到75%以上時(shí)，采用MTT方法測定各組細(xì)胞A值。判斷標(biāo)準(zhǔn)：0細(xì)胞病變率以“-”標(biāo)示;1%～25%細(xì)胞病變率以“+”標(biāo)示;26%～50%細(xì)胞病變率以“”標(biāo)示;51%～75%細(xì)胞病變率以“”標(biāo)示;76%～100%細(xì)胞病變率以“”標(biāo)示。

1.2.4SS-GAG 對HSV-2感染Vero細(xì)胞后效應(yīng)的抑制作用[26]將100 TCID50的HSV-2病毒液接種到單層Vero細(xì)胞孔中（每孔100 μL），37 ℃吸附2 h，棄病毒液換含不同濃度SS-GAG（50、100、200 mg/L）的維持液（每孔200 μL），繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每日在倒置顯微鏡下觀察CPE并記錄結(jié)果。分組同1.2.3。當(dāng)病毒對照組細(xì)胞病變達(dá)75%以上時(shí)，采用MTT法測定各組細(xì)胞A值，并分別計(jì)算各組SS-GAG抗病毒有效率（ER）。ER=（SS-GAG組平均A值-病毒對照組平均A值）/病毒對照組的平均A值×100%。

1.2.5SS-GAG對HSV-2的綜合作用將100 TCID50的HSV-2病毒液與含不同濃度的SS-GAG（50、100、200 mg/L）維持液等量混合后直接接種到單層Vero細(xì)胞孔中（每孔200 μL），37 ℃吸附2 h，棄上清液，加入含有原濃度的SS-GAG的維持液繼續(xù)培養(yǎng)72 h，每日在倒置顯微鏡下觀察CPE并記錄結(jié)果。分組同1.2.3。測定方法以及ER計(jì)算方法同1.2.4。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料數(shù)據(jù)以[AKx-D]±s表示，多組均數(shù)間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用q檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1病毒毒力測定

按照Reed-Muench方法測得病毒的TCID50為10-4.2/100 μL。實(shí)驗(yàn)用病毒濃度為100 TCID50。

2.2藥物對細(xì)胞毒性測定

結(jié)果顯示，正常Vero細(xì)胞呈梭形，細(xì)胞膜完整且邊界清晰;經(jīng)SS-GAG處理過的細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，排列緊密有序，無脫落、融合等現(xiàn)象發(fā)生，與正常細(xì)胞的形態(tài)無明顯差別。同時(shí)MTT檢測結(jié)果也顯示，SS-GAG各濃度組細(xì)胞增殖活性與正常對照組差異無顯著性 （P>0.05），表明SS-GAG在100～1 600 mg/L濃度范圍內(nèi)對Vero細(xì)胞無毒性作用。見表1。

2.3SS-GAG對HSV-2的直接影響

經(jīng)不同濃度的SS-GAG預(yù)先與HSV-2混合后再感染Vero細(xì)胞，各組細(xì)胞均出現(xiàn)了典型的CPE特征，表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間融合、碎裂等。MTT檢測結(jié)果顯示，不同濃度SS-GAG組細(xì)胞增殖活性與病毒對照組差異無顯著性（P>0.05）。以上結(jié)果提示SS-GAG沒有直接滅活HSV-2病毒的活性。見表2。

2.4SS-GAG對HSV-2感染Vero細(xì)胞后效應(yīng)的抑制作用

結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞比較，病毒對照組細(xì)胞出現(xiàn)了典型的CPE特征，細(xì)胞增殖活性明顯減弱（q=7.42，P<0.01）。與病毒對照組相比，SS-GAG各組CPE特征明顯減弱，細(xì)胞活性隨著藥物濃度增加而增強(qiáng)（F=20.061，P<0.01），藥物對病毒的抑制作用有效率達(dá)46.8%以上。以上結(jié)果提示SS-GAG能明顯抑制HSV-2的復(fù)制，抗病毒活性呈現(xiàn)劑量依賴性。見表3。

2.5SS-GAG對HSV-2的綜合作用

結(jié)果顯示，與正常對照組細(xì)胞比較，病毒對照組細(xì)胞出現(xiàn)典型的CPE特征，細(xì)胞增殖活性明顯低于正常對照組細(xì)胞（q=7.38，P<0.01）。與病毒對照組相比較，SS-GAG各組均能有效地保護(hù)感染的細(xì)胞，使細(xì)胞活性增強(qiáng)（F=39.947，P<0.01），而且隨著藥物濃度的增加，SS-GAG抗病毒有效率逐漸增加。其中濃度為200 mg/L的SS-GAG抗病毒有效率達(dá)到51.2%。見表3。

3討論

HSV病毒為嗜神經(jīng)性的有包膜雙鏈DNA病毒，分為2個(gè)血清型，即HSV-1和HSV-2。HSV-2主要通過性行為傳播，多數(shù)生殖器皰疹由HSV-2病毒引起。SS-GAG是扇貝多糖課題組人員從青島渤海灣櫛孔扇貝裙邊中提取純化的硫酸多糖成分，其與肝素的理化性質(zhì)相似[27-28]。課題組前期已經(jīng)初步對SS-GAG抗HSV-1活性進(jìn)行了體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明SS-GAG具有抗HSV-1的活性[22]。本研究是通過建立HSV-2在Vero細(xì)胞上的病毒感染模型，采用CPE觀察法結(jié)合MTT法來評價(jià)SS-GAG對HSV-2的抗病毒活性，通過SS-GAG對病毒的直接影響、抑制作用和綜合作用等3種方式來初步探討其作用機(jī)制。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SS-GAG對HSV-2沒有直接殺傷作用，但對HSV-2感染有抑制作用，而且隨著藥物濃度的增加其抑制作用也增強(qiáng)，因此可推測其抗病毒作用可能與干擾HSV-2病毒復(fù)制有關(guān)。

病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制是復(fù)雜但又程序化的過程，影響復(fù)制循環(huán)中任一環(huán)節(jié)均可能起到抗病毒作用。SS-GAG在多種作用方式下均可發(fā)揮不同程度的抗病毒活性[25]，可作為多途徑、多靶點(diǎn)藥物進(jìn)行開發(fā)研究。至于本實(shí)驗(yàn)中的SS-GAG通過何種機(jī)制阻斷病毒感染細(xì)胞并抑制病毒的復(fù)制，尚有待進(jìn)一步研究和觀察。

[參考文獻(xiàn)]

[1]蘭晶，楊陽，齊瑞群，等. 單純皰疹病毒的致病特點(diǎn)及人體抗單純皰疹病毒免疫[J].? 國際皮膚性病學(xué)雜志， 2016，42（6）：468-471.

[2]張昊，劉濤，邱源旺，等. HSV-2感染的發(fā)病機(jī)制及診療進(jìn)展[J].? 中國艾滋病性病， 2021，27（11）：1322-1325.

[3]YU X L， HE S D. The interplay between human Herpes simplex virus infection and the apoptosis and necroptosis cell death pathways[J].? Virology Journal， 2016，13：77.

[4]綦魯博，張保平. 2型單純皰疹病毒研究進(jìn)展[J].? 世界最新醫(yī)學(xué)信息文摘， 2018，18（92）：28-29，34.

[5]中國醫(yī)師協(xié)會皮膚科醫(yī)師分會臨床診療指南委員會. 生殖器皰疹臨床診療指南（2009）[J]. 中華皮膚科雜志， 2009，42（12）：877-878.

[6]樊建勇，趙陽，楊慧蘭. 單純皰疹病毒的潛伏、復(fù)發(fā)感染與防治[J].? 中國醫(yī)學(xué)文摘（皮膚科學(xué)）， 2017，34（1）：9-17，4.

[7]李嬌，彭芳. 抗單純皰疹病毒中藥的研究進(jìn)展[J].? 醫(yī)學(xué)綜述， 2012，18（5）：753-755.

[8]張善文，黃洪波，桂春，等. 海洋藥物及其研發(fā)進(jìn)展[J].? 中國海洋藥物， 2018，37（3）：77-92.

[9]曾洋洋，韓章潤，楊玫婷，等. 海洋糖類藥物研究進(jìn)展[J].? 中國海洋藥物， 2013，32（2）：67-75.

[10]向維，姜玉新，李朝品. 海洋貝類多糖的抗病毒作用[J].? 國際流行病學(xué)傳染病學(xué)雜志， 2010，37（1）：57-60.

[11]蔡超，于廣利. 海洋糖類創(chuàng)新藥物研究進(jìn)展[J].? 生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)， 2018（6）：55-61.

[12]李珊，劉賽. 扇貝裙邊中糖胺聚糖的氣相色譜定性定量分析及紅外光譜分析[J].? 中國海洋藥物， 2004，23（6）：8-11.

[13]LIU X X， HAO J J， SHAN X D， et al. Antithrombotic activities of fucosylated chondroitin sulfates and their depolymerized fragments from two sea cucumbers[J].? Carbohydrate Polymers， 2016，152：343-350.

[14]LI Q Y， CAI C， CHANG Y G， et al. A novel structural fucosylated chondroitin sulfate from Holothuria Mexicana and its effects on growth factors binding and anticoagulation[J].? Carbohydrate Polymers， 2018，181：1160-1168.

[15]黃翠麗，劉賽，于樹君，等. 扇貝裙邊提取物抗動脈粥樣硬化作用及其機(jī)理研究[J].? 中國海洋藥物， 2002，21（4）：11-19.

[16]孫福生，鞠傳霞，劉賽. 扇貝裙邊糖胺聚糖對U937泡沫細(xì)胞形成過程中TNF-α、IL-6和IL-8表達(dá)的影響[J].? 中國藥科大學(xué)學(xué)報(bào)， 2008，39（6）：563-565.

[17]沙麗穎，楊英，殷毅，等. 櫛孔扇貝裙邊糖胺聚糖對增殖的血管平滑肌細(xì)胞c-myc和TNF-α mRNA水平的影響[J].? 中國海洋藥物， 2008，27（5）：41-45.

[18]鞠傳霞，侯琳，叢培陽，等. 扇貝糖胺聚糖對OX-LDL誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的抑制作用機(jī)制研究[J].? 中國藥房， 2015，26（28）：3938-3941.

[19]王長云，管華詩. 多糖抗病毒作用研究進(jìn)展Ⅱ.硫酸多糖抗病毒作用[J].? 生物工程進(jìn)展， 2000，20（2）：3-8.

[20]王長云，管華詩. 多糖抗病毒作用研究進(jìn)展Ⅰ.多糖抗病毒作用[J].? 生物工程進(jìn)展， 2000，20（1）：17-20.

[21]王姝垚，劉志純，秦玲，等. 海洋硫酸多糖PAE的結(jié)構(gòu)和抗病毒活性研究[J].? 中國海洋藥物， 2019，38（1）：17-22.

[22]于囡，韓建建，王海桃，等. 扇貝裙邊糖胺聚糖對HSV-Ⅰ感染小鼠保護(hù)作用的研究[J].? 海峽藥學(xué)， 2014，26（11）：38-41.

[23]高翔，王悅怡，袁長吉，等. 海參糖胺聚糖的提取及抗腫瘤活性的研究[J].? 食品工業(yè)科技， 2008，29（6）：117-119，123.

[24]傅繼華. 病毒學(xué)實(shí)用實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].? 濟(jì)南：山東科學(xué)技術(shù)出版社， 2001.

[25]于囡，劉賽，王海桃，等. 扇貝裙邊糖胺聚糖體外抗Ⅰ型單純皰疹病毒實(shí)驗(yàn)研究[J].? 中國藥理學(xué)通報(bào)， 2008，24（2）：210-213.

[26]候亞林，杜立行，歐柏生，等. 參芪止皰顆?？笻SV-2的體外實(shí)驗(yàn)研究[J].? 陜西中醫(yī)， 2018，39（1）：10-13.

[27]王長云，管華詩，林洪. 海灣扇貝肝素樣多糖分離方法的研究[J].? 海洋與湖沼， 1995，26（S1）：66-69.

[28]范丹丹. 扇貝裙邊糖胺聚糖提取分離與生物活性研究[D].? 大連：大連海洋大學(xué)， 2019.

（本文編輯于國藝）