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      正交試驗(yàn)法優(yōu)選一種抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝

      2020-08-24 12:56:26劉富菁王思琪陶然王婭玲于慧心王集會(huì)
      當(dāng)代化工 2020年6期
      關(guān)鍵詞:多糖類方藥抗病毒

      劉富菁 王思琪 陶然 王婭玲 于慧心 王集會(huì)

      摘????? 要:為了優(yōu)化抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝條件,提高多糖得率,采用L27(313) 正交試驗(yàn)法,考察超聲溫度(A)、提取時(shí)間(B)和料液比(C)3個(gè)因素對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響,同時(shí)考察其中存在的交互作用(A×B、A×C和B×C),并最終獲得最佳的提取工藝條件組合。結(jié)果顯示:最佳工藝條件組合為A3B2C3,即超聲溫度為70 ℃、提取時(shí)間為30 min、料液比為1∶30。在最佳工藝條件組合下,測(cè)得方藥中多糖的提取率為40.48%,并且該最佳工藝穩(wěn)定可靠。

      關(guān)? 鍵? 詞:抗病毒方藥;多糖提取;正交試驗(yàn);交互作用

      中圖分類號(hào):R284.2? ????????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼: A?????? 文章編號(hào): 1671-0460(2020)06-1099-04

      Optimum of Extraction Processof Polysaccharides From the Antiviral Prescription by Orthogonal Test

      LIU Fu-jing1, WANG Si-qi1, TAO-Ran1, WANG Ya-ling1, YU Hui-xin1, WANG Ji-hui2*

      (1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan Shandong 250355, China;

      2. ExperimentalCenter, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan Shandong 250355, China)

      Abstract: In order to optimize the extraction process of polysaccharide from the antiviral prescription to improve the yield, the effect of three factors including temperature(A), extraction time(B), solid-liquid ratio(C) on the yield of polysaccharides was investigated by L27(313) orthogonal experiment, and the possible interactions of A×B, A×C and B×C were investigated. Finally, the optimal optimum extraction conditionswere determined. The results showed that, the optimum extraction conditionswasA3B2C3, that was, the temperature 70 ℃, the extraction time 30 min, and the solid-liquid ratio 1∶30. Under the optimal extraction conditions, the yield of polysaccharides was 40.48%, and the optimal process was stable and reliable.

      Key words: Antiviral prescription; Extraction of polysaccharides; Orthogonal test; Interaction effect

      人類歷史上曾記載著許多近乎災(zāi)難的大型疫情,如新冠肺炎、非典、艾滋病等,這些“殺人于無(wú)形”的疾病的始作俑者便是病毒,一種肉眼無(wú)法看到的最小生物病原體,而越來(lái)越多變異病原體的產(chǎn)生,使病毒性疾病治愈的難度隨之增加[1]。面對(duì)巨大的生命健康威脅,人們?cè)诳共《痉矫娴耐度胍苍絹?lái)越大,而中藥也因其悠久的應(yīng)用歷史和諸多疫情防治的成功歷史,為廣大研究者提供了豐富的經(jīng)驗(yàn)參考和有力的信念支持[2]。

      盡管中藥[3]在抗病毒方面并沒(méi)有西藥[4]那么強(qiáng)的針對(duì)性,但中醫(yī)強(qiáng)調(diào)的天人合一的整體觀念、辨證論治的理法方藥和中藥多組分多靶點(diǎn)的藥理特點(diǎn),使其在治療各種疑難雜癥中具備了得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì),也因此奠定了其不可替代的防治價(jià)值[5]

      多糖是一種能參與許多生命過(guò)程的生物大分子,其結(jié)構(gòu)的多樣性決定了其生理功能的多樣性和生物活性的差異性。據(jù)研究多糖類物質(zhì)主要通過(guò)增強(qiáng)機(jī)體免疫功能來(lái)達(dá)到抗菌、抗病毒和抗癌的效果。近年來(lái),國(guó)內(nèi)外與多糖相關(guān)的研究進(jìn)度神速,而對(duì)多糖提取分離的工藝研究是研究多糖高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要基礎(chǔ)[6]。

      本次試驗(yàn)旨在對(duì)所選抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的最佳提取工藝條件進(jìn)行研究,確定最佳的提取時(shí)間、超聲溫度、料液比等,為該方藥的進(jìn)一步研究提供一定的參考。

      1? 試驗(yàn)材料

      紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),UV9100B型,北京萊伯泰科儀器有限公司等試驗(yàn)器材。

      苯酚,分析純,國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,批號(hào)20150108;白術(shù)、白頭翁、蠐螬、美洲大蠊、當(dāng)歸、川芎,在河北安國(guó)中藥材市場(chǎng)所購(gòu)買(mǎi),粉碎成粗粉后,儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

      2? 試驗(yàn)方法

      2.1? 標(biāo)準(zhǔn)曲線的獲取

      精密稱取干燥恒重的葡萄糖20.00 mg,加水溶解并定容至100 mL,分別精密移取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00 mL于10 mL規(guī)格的干燥潔凈的容量瓶中,混勻并定容;再分別精密的移取各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液2.00 mL,放置于干凈干燥試管中,進(jìn)而移取1.00 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液[7],略微振搖,將5.00 mL的濃硫酸加入其中,快速混勻后在室溫下安靜放置20 min,而后放在40 ℃水浴鍋中保持溫度10 min,使其充分反應(yīng),并在490 nm處測(cè)量其吸光度[8]。把葡萄糖的質(zhì)量濃度x作為曲線的橫坐標(biāo)軸,吸光度y作為曲線的縱坐標(biāo)軸,進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[9]。

      2.2? 抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的提取

      2.2.1? 超聲提取方法

      精密稱取抗病毒方藥粉末1.000 g,放置于干燥潔凈的三角燒瓶中,加入固定量的蒸餾水,在固定的時(shí)間、料液比和溫度下進(jìn)行超聲提取,取出并抽濾,濾液定容待用[10]。

      2.2.2? 多糖類物質(zhì)的含量測(cè)定

      用移液槍精密移取上述濾液0.05 mL,加入到干燥潔凈的10 mL容量瓶中,加水混合均勻,定容至刻度,待用。精密移取上述溶液1.00 mL于具刻試管中,采用2.1.2相同方法測(cè)量其吸光值A,并計(jì)算出質(zhì)量濃度ρ,進(jìn)行下式計(jì)算。

      多糖類物質(zhì)的提取率=[p×7×10×(v÷0.05)]/1000×m= ×100%[11]

      2.3? 單因素分析試驗(yàn)

      保持其他條件不改變, 分別考察超聲時(shí)溫度(40、50、60、70、80 ℃)、物料液體比值(1∶15、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50)、提取持續(xù)時(shí)間(10、20、30、40、50 min)[12-13]3個(gè)因素對(duì)多糖類物質(zhì)得率的影響。方法同2.2.1和2.2.2。3次平行試驗(yàn),取平均值進(jìn)行分析,最終確定正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中各因素的水平數(shù)值。

      2.4? 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

      基于2.3中試驗(yàn)的結(jié)果, 進(jìn)行下一步的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),選定上述3個(gè)因素的3個(gè)水平進(jìn)行L27(313)正交試驗(yàn),試驗(yàn)中的各個(gè)因素以及各個(gè)水平見(jiàn)表1,同時(shí)關(guān)注各因素之間可能存在的交互作用(A×B、A×C、B×C),觀察多糖提取率的數(shù)值變化,得出最優(yōu)工藝條件的組合,并采用SPASS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析[11]。

      3? 結(jié)果及分析

      3.1? 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

      經(jīng)實(shí)驗(yàn)所得曲線見(jiàn)圖1。

      回歸方程y=54.836x+0.000 2,相關(guān)系數(shù)R2=0.999 4。

      3.2 ?? ?超聲溫度對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

      試驗(yàn)方法采用2.2.1、2.2.2方法,物料液體比值定為1∶40、超聲持續(xù)20 min下,考察不同超聲溫度的影響作用。分析圖2可知,超聲溫度對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)的得率影響很明顯,超聲溫度不斷變高,多糖提取率迅速增加,50 ℃以后多糖提取率增幅略變大,當(dāng)超聲溫度升至60 ℃,多糖提取率到達(dá)最高值附近,之后呈現(xiàn)下降趨勢(shì),所以試驗(yàn)暫定60 ℃為最佳超聲溫度。

      3.3? 料液比對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

      按2.2.1、2.2.2方法,在50 ℃的溫度下進(jìn)行超聲10 min的處理,考察不同料液比的影響作用,結(jié)果見(jiàn)圖3。

      通過(guò)圖3可以看出,料液比對(duì)抗病毒方藥中多糖提取率的影響是比較明顯的,隨著加入的提取溶劑的增大,多糖得率有逐漸上升趨勢(shì),當(dāng)料液比升至1∶20時(shí),多糖提取率到達(dá)最高值附近,之后呈現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì),所以試驗(yàn)暫定1∶20為最佳料液比。

      3.4? 提取時(shí)間對(duì)方藥中多糖類物質(zhì)提取率的影響

      按2.2.1、2.2.2方法,在50 ℃的溫度下進(jìn)行超聲處理、且物料液體比值為1∶40,考察不同超聲時(shí)間的影響作用。分析圖4得,提取時(shí)間對(duì)多糖類物質(zhì)的得率影響較明顯,超聲時(shí)間加長(zhǎng),多糖提取率有所提高,時(shí)間達(dá)到30 min對(duì)應(yīng)多糖提取率到達(dá)最高值附近,隨后緩慢變小,最終試驗(yàn)暫定30 min為最佳提取時(shí)間。

      3.5? 正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

      3.5.1? 正交試驗(yàn)結(jié)果

      試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

      3.5.2? 試驗(yàn)結(jié)果的方差分析

      試驗(yàn)結(jié)果的方差分析見(jiàn)表3。

      由方差分析表3可知,A、B、A×B和A×C對(duì)多糖類物質(zhì)提取率的影響極顯著,而C和B×C對(duì)指標(biāo)的影響具有顯著性差異。極差由大到小依次為A、B、A×C、A×B、C、B×C[14]。A、B、C及它們之間的一級(jí)交互作用均對(duì)該抗病毒方藥中多糖類物質(zhì)的提取率有極顯著或顯著性影響,最佳提取工藝組合為A3B2C3。為進(jìn)一步證明上述最佳水提工藝是持續(xù)穩(wěn)定和可靠的,在上述條件下進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn)3次,得多糖類物質(zhì)的提取率達(dá)40.48%(RSD= 1.34%),表明此最佳提取工藝穩(wěn)定性及可靠性良好[14]。

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