超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法同時(shí)測定豆制品中12種堿性染料 ?

林顯活 吳正雙 梁熾瓊 羅瑞漣

摘 要：建立了豆制品中非法添加的12種堿性染料的超高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。豆制品用乙腈提取后，經(jīng)HLB固相萃取柱凈化，以乙腈和0.1%甲酸水溶液為流動(dòng)相，在UPLC BEH C18色譜柱上分離，電噴霧正離子（ESI+）掃描，多反應(yīng)監(jiān)測模式測定，外標(biāo)法定量。結(jié)果表明，12種堿性染料在各自濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R>0.998 6，檢出限為0.1～0.5 μg/kg，加標(biāo)回收率為74.6%～93.5%，精密度為4.9%～9.5%。該方法方便快捷、定性定量準(zhǔn)確、檢出限低，適合大批量豆制品樣品中12種堿性染料的同時(shí)測定。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;堿性染料;豆制品

Determination of 12 Basic Dyes in Bean Products by Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

LIN Xianhuo， WU Zhengshuang， LIANG Chiqiong， LUO Ruilian

（Foshan Centre for Food and Drug Control， Foshan 528000， China）

Abstract： A detection method with external method for the simultaneous determination of 12 basic dyes in bean products by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry （UPLC-MS/MS） was established. Bean products are extracted with acetonitrile， purified by HLB solid-phase extraction column， separated on UPLC BEH C18 chromatographic column with acetonitrile and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phase， scanned by electrospray spray positive ion （ESI+）， determined by multi reaction monitoring mode， and quantified by external standard method. The results showed that 12 basic dyes exhibit good linearity in their respective concentration ranges， and the correlation coefficient was greater than 0.998 6， and the detection limit was 0.1～0.5 μg/kg. The recoveries were 74.6%～93.5% and the precision was 4.9%～9.5%. This method is convenient， rapid， accurate in qualitative and quantitative analysis， and low in detection limit. It is suitable for the simultaneous determination of 12 basic dyes in large quantities of soybean products.

Keywords： ultra high performance liquid chromatography tandem mass spectrometry; basic dyes; bean products

近年來堿性染料被非法添加到食品中的事件已屢見不鮮，這些染料比食品添加劑中著色劑更容易染色，染色后顏色艷麗，不易褪色，且價(jià)格便宜，因此一些不法廠商將其違法使用在肉制品、豆制品、辣椒制品和火鍋底料等食品中。這些堿性染料含有大量苯環(huán)及其衍生物，具有強(qiáng)致癌及潛在致癌性，我國已嚴(yán)禁將這些染料用于食品加工生產(chǎn)。

目前檢測堿性染料的常用方法主要有高效液相色譜法[1-2]、高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法[3-5]和高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法[6-7]。由于食品種類繁多、基質(zhì)復(fù)雜，高效液相色譜法容易出現(xiàn)干擾峰，化合物定性時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)假陽性;高效液相色譜-飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜法具有高通量快速篩的優(yōu)勢，但定量方面準(zhǔn)確性不高。目前相關(guān)的研究主要集中在調(diào)味品和肉制品，豆制品作為工業(yè)化程度低、保質(zhì)期相對較短的食品，尤其紅豆腐乳及膨化豆制品更容易被非法添加這類物質(zhì)。因此，建立一種能夠同時(shí)測定豆制品中多種堿性染料的高通量方法十分必要。本研究對豆制品樣品前處理方法、液相色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行了優(yōu)化，開發(fā)了一種同時(shí)測定12種堿性染料的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（Ultra High Performance Liquid Chromatography Tandem

Mass Spectrometry，UPLC-MS/MS）分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豆腐、豆干、腐竹、紅豆腐乳以及膨化豆制品，購自農(nóng)貿(mào)市場和大型超市。

分散橙11、分散橙1、分散橙3、分散橙37、分散黃3、二甲基黃、二乙基黃、堿性橙22、堿性橙21、堿性嫩黃O、羅丹明B以及蘇丹橙G標(biāo)準(zhǔn)品（純度均≥90%），上海道垚測試技術(shù)有限公司;乙腈、甲醇、甲酸（均為色譜純），上海安譜實(shí)驗(yàn)科技服務(wù)有限公司;HLB固相萃取柱（3 mL，60 mg）;陽離子交換固相萃取小柱（MCX，3 mL，60 mg）;C18固相萃取小柱（3 mL，200 mg），美國Waters公司;QuEChERS凈化小管（填料為無水硫酸鎂、PSA和C18混合物），美國安捷倫。

1.2 儀器與設(shè)備

SCIEX 5500超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國SCIEX公司;LabTech MV5氮吹儀，北京萊伯泰科公司;高速冷凍離心機(jī)，德國SIGMA。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取12種標(biāo)準(zhǔn)品各1.0 mg，用甲醇溶解并定容至10 mL棕色容量瓶中，均配制成100 μg/mL的單標(biāo)儲備液，置于-18 ℃冰箱中避光保存?zhèn)溆?，根?jù)需要用流動(dòng)相逐級稀釋成合適濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液備用。

1.3.2 樣品提取

稱取試樣1～2 g（精確至0.01 g）至50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋1 min，超聲提取20 min（超聲過程中可不時(shí)振搖），渦旋混勻，10 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)入另一干凈的50 mL離心管中，重復(fù)提取一次，合并上清液，待凈化，必要時(shí)用乙腈飽和的正己烷除油。

1.3.3 凈化

依次用3 mL甲醇、3 mL水活化HLB固相萃取小柱，將上清液過柱，待其自然流盡后，依次用2 mL水、2 mL甲醇+水（1+1）淋洗小柱并壓干，最后用6 mL甲醇溶液洗脫，收集洗脫液，流速控制在1 mL/min。洗脫液在50 ℃水浴下氮?dú)獯蹈?，?zhǔn)確加入1 mL甲醇+水（1+1）溶解殘?jiān)瑴u旋1 min，經(jīng)

0.2 μm有機(jī)相濾膜過濾，供UPLC-MS/MS上機(jī)分析。

1.3.4 液相色譜條件

色譜柱：WatersAcquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）;柱溫：35 ℃;進(jìn)樣體積：2 μL;流動(dòng)相：0.1%的甲酸-水溶液（A）和乙腈（B）;流速：0.3 mL/min;梯度洗脫，洗脫程序：0～1.0 min，70%A;1.0～5.5 min，70%A～5%A;5.5～6.0 min，5%A;6.0～6.1 min，5%A～70%A;6.1～7.0 min，70%A。

1.3.5 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧正離子（ESI+）模式;掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）;離子化電壓：5 500 V;離子源溫度：500 ℃;氣簾氣（Curtain Gas）：35 psi;霧化氣（Gas1）：50 psi，輔助氣（Gas2）：55 psi。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

按照優(yōu)化后的儀器條件，用凈化后的空白基質(zhì)溶液配制12種堿性染料混合系列標(biāo)準(zhǔn)溶液經(jīng)自動(dòng)進(jìn)樣上機(jī)測定，以濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

配制濃度均為100 ng/mL的12種堿性染料的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用注射泵直接進(jìn)樣的方式，在正離子模式下先后找到各母離子和特征子離子，并對去簇電壓和碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

2.2 液相條件的優(yōu)化

質(zhì)譜電離方式為電噴霧正離子掃描（ESI+），流動(dòng)相中添加帶正電荷的離子如H+或NH4+等能夠促進(jìn)化合物的電離，進(jìn)而增強(qiáng)靈敏度，故本文分別比較了甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L乙酸銨水溶液（含0.1%甲酸）、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L甲酸銨水溶液（含0.1%甲酸）流動(dòng)相體系對12種堿性染料的分離效果和響應(yīng)值的影響。結(jié)果表明，流動(dòng)相體系中含有甲酸銨時(shí)，雖然部分化合物的響應(yīng)值有明顯增強(qiáng)，但大部分化合物的響應(yīng)值下降明顯，分離效果較差，且部分化合物的峰形也較差，見圖1（a）。甲醇-0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水分別為流動(dòng)相時(shí)，乙腈的洗脫效果和峰形優(yōu)于甲醇，目標(biāo)物的響應(yīng)值也較高，見圖1（b）。

2.3 提取溶劑的選擇

12種堿性染料的極性差別較大，但都能溶于水、甲醇、乙腈和乙醇等常用溶劑，選擇一種合適的提取溶劑尤為重要。有標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)顯示，羅丹明B用乙酸乙酯-環(huán)己烷或正己烷提取，經(jīng)凝膠滲透色譜系統(tǒng)凈化，實(shí)驗(yàn)浪費(fèi)大量有機(jī)試劑，且檢出限高，不能滿足快速省時(shí)和高靈敏度的要求[8];正己烷和丙酮對堿性染料的提取效率較差，回收率在40%以下。因此本實(shí)驗(yàn)采用水、甲醇、乙醇和乙腈作為提取溶劑，并比較了其提取效果，發(fā)現(xiàn)水的提取效果最差，尤其是對含油多的樣品;甲醇和乙醇在提取出目標(biāo)物質(zhì)的同時(shí)也提取出更多的極性雜質(zhì)和色素，不利于下一步的凈化，也容易導(dǎo)致回收率下降;采用乙腈提取，凈化后的樣液較為干凈，12種堿性染料的回收率也高。故本實(shí)驗(yàn)采用乙腈為提取溶劑。

2.4 凈化條件的選擇

豆制品如豆腐、油豆腐、腐竹、豆皮、豆干和腐乳等一般含有大量的脂肪、色素、蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)及其他雜質(zhì)，經(jīng)提取后，這些物質(zhì)會(huì)隨著目標(biāo)物一并提取出來，對色譜柱、質(zhì)譜儀離子源及四極桿質(zhì)譜污染較大，因此很有必要對樣品提取液進(jìn)行凈化。

如圖2所示，強(qiáng)陽離子交換柱和C18固相萃取柱都有一定的凈化效果，MCX固相萃取柱對少油型的火鍋底料凈化效果優(yōu)于C18固相萃取柱;但對多油型的豆制品，C18固相萃取柱的凈化效果優(yōu)于MCX柱。HLB固相萃取柱的填料為N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯共聚物，是反相和陽離子交換的復(fù)合模式，對絕大部分樣品的凈化效果均比較好。商品化的QuEChERS凈化小管使用方便，但是回收率比較低，凈化效果不太理想。故本實(shí)驗(yàn)選用HLB固相萃取柱凈化樣品。

2.5 基質(zhì)效應(yīng)的影響

本實(shí)驗(yàn)采用腐竹、豆干、油豆腐實(shí)際空白樣品，用凈化后的樣品溶液配制一定濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，上機(jī)測試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到斜率k1;然后用溶劑配制相同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液上機(jī)測試，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線得到斜率k2，計(jì)算k1/k2的比值f，以反映凈化前后基體對目標(biāo)物的影響，比值f大于1為基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，小于1則為基質(zhì)抑制效應(yīng)。結(jié)果表明，經(jīng)過萃取柱凈化后，可顯著降低多數(shù)染料的基體抑制效應(yīng)。

2.6 方法學(xué)驗(yàn)證

2.6.1 線性范圍和檢出限

12種堿性染料的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。本實(shí)驗(yàn)以空白樣品添加低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，使各化合物濃度水平均為0.2～0.5 μg/kg，按照1.3中的方法均平行測定10次，分別計(jì)算出10次測定結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差，以標(biāo)準(zhǔn)偏差的3倍作檢出限（置信水平P=95%），得到各化合物的檢出限。然后，按照1.3中的方法驗(yàn)證，結(jié)果顯示，添加對應(yīng)檢出限濃度的樣品，在UPLC-MS/MS上仍然有明顯響應(yīng)，且信噪比（S/N）均大于3。

2.6.2 回收率和精密度

按照實(shí)驗(yàn)測定步驟，采用腐竹、紅豆腐乳兩種具有代表性的豆制品作為研究對象，在空白樣品中分別添加高（10 μg/kg）、中（5 μg/kg）、低（1 μg/kg）3個(gè)濃度進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)濃度平行測定6次，考察方法精密度。結(jié)果表明，在不同加標(biāo)濃度條件下，不同的樣品中，兩種化合物的加標(biāo)回收率為74.6%～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%，能夠滿足日常檢測工作的需要。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以豆制品類食品為研究對象，優(yōu)化了前處理方法和液相色譜及質(zhì)譜條件，考察了基質(zhì)效應(yīng)。采用乙腈提取樣品，HLB固相萃取柱凈化，UPLC-MS/MS法定性和定量。結(jié)果表明，該方法前處理過程簡便、穩(wěn)定可靠，回收率為74.6% ～93.5%，精密度（RSD）為4.9%～9.5%;檢出限低，為0.1～0.5 μg/kg。

該方法適用于不同類別的豆制品的檢測，可同時(shí)定性和定量測定其中的12種堿性染料，能夠滿足檢驗(yàn)檢測機(jī)構(gòu)的日常檢測工作要求，為豆制品的安全監(jiān)測提供了有效的技術(shù)手段。

參考文獻(xiàn)

[1]楊琳，陳肯俊，梁晶晶，等.高效液相色譜法測定辣椒制品中的堿性橙和堿性玫瑰精含量[J].食品科學(xué)，2012，33（24）：303-306.

[2]鐘麗琪，曹進(jìn)，錢和，等.高效液相色譜法測定食品中可能摻雜的16種工業(yè)染料[J].食品科學(xué)，2021，42（22）：305-310.

[3]吳正雙，林顯活，梁熾瓊，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定火鍋食品中的羅丹明B和6G[J].中國調(diào)味品，2018，43（4）：182-186.

[4]劉軍，李道霞，唐昌云，等.食品中17種工業(yè)染料的液質(zhì)聯(lián)用檢測方法研究[J].食品科技，2021，46（10）：298-305.

[5]范賽，張楠，劉平，等.超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測熟肉制品中10種工業(yè)染料殘留[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報(bào)，2020，11（13）：4177-4184.

[6]錢疆，陳健，黃杰，等.超高壓液相色譜-軌道阱質(zhì)譜法測定加工食品中30種禁用堿性染料[J].理化檢驗(yàn)（化學(xué)分冊），2016，52（9）：1011-1016.

[7]ALDEY L，STEINBORN A，BERGELT S.Suitability of an orbitrap mass spectrometer for the screening of pestidicde residues in extracts of fruits and vegetables[J].Journal of AOAC International，2011，94（6）： 1661-1673.

[8]國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.進(jìn)出口食品中羅丹明B的檢測方法：SN/T 2430—2010[S].北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2009.

基金項(xiàng)目：佛山市自籌經(jīng)費(fèi)類科技計(jì)劃項(xiàng)目（2020001005443）。

作者簡介：林顯活（1988—），男，廣東陽江人，本科，工程師。研究方向：食品檢測。