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    生物制品中氨基酸成分的研究

    2018-08-06 19:35:08徐濤秦博王曉麗
    智富時(shí)代 2018年6期
    關(guān)鍵詞:生物制品質(zhì)量控制

    徐濤 秦博 王曉麗

    【摘 要】氨基酸分析在重組蛋白質(zhì)類生物制品的質(zhì)量控制中發(fā)揮著重要作用,為重組蛋白的結(jié)構(gòu)確證和功能研究提供重要的一局?;诖?,文章對(duì)一種多肽藥進(jìn)行了氨基酸成分實(shí)驗(yàn)研究,希望為相關(guān)行業(yè)人員提供一些借鑒。

    【關(guān)鍵詞】氨基酸分析;重組蛋白;生物制品;質(zhì)量控制

    生命科學(xué)的不斷發(fā)展使人們發(fā)現(xiàn)了更多具有重要功能蛋白質(zhì)分子,在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的重組蛋白藥物具有副作用小、用量少、藥效強(qiáng)的特點(diǎn),在疾病治療和預(yù)防方面發(fā)揮著重要的作用。

    一、實(shí)驗(yàn)材料和方法

    本文檢測(cè)了一種含有20個(gè)氨基酸的多肽藥,具體檢測(cè)方法如下。

    (一)條件參數(shù):

    儀器:高壓液相色譜儀(HPLC)

    色譜柱:十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(如:沃特世Xbridge(多肽)BEHC185微米粒徑4.6毫米的內(nèi)徑×250毫米的長(zhǎng)度);

    洗脫速度:每分鐘1.0毫升;

    分析波長(zhǎng):設(shè)置在248納米;

    色譜柱溫度:設(shè)置在37℃;

    進(jìn)樣體積:10μl。

    洗脫液A:稱取11.5g無(wú)水醋酸鈉固體,加入去離子水溶解,再加入乙二胺四乙酸二鈉溶液1ml和(C2H5)3N溶液2.4ml,再利用H3PO4調(diào)溶液pH值至4.95,最后加去離子水至1000ml。

    洗脫液B:乙腈(HPLC級(jí))、超純水(60∶40)

    梯度淋洗方式如下:

    (二)樣品溶液配制

    對(duì)照品溶液:精密稱定門冬氨酸(Asp)的對(duì)照品83.17毫克,谷氨酸(Glu)的對(duì)照品92.17毫克,精氨酸(Arg)的對(duì)照品108.68毫克,脯氨酸(Pro)的對(duì)照品72.69毫克,酪氨酸(Tyr)的對(duì)照品112.98毫克,亮氨酸(Leu)的對(duì)照品81.95毫克,異亮氨酸(Ile)的對(duì)照品81.99毫克,苯丙氨酸(Phe)的對(duì)照品103.53毫克,甘氨酸(Gly)的對(duì)照品47.13毫克,加0.1mol/L鹽酸溶解并定溶于250ml量瓶中。然后將100μl該溶液置進(jìn)樣瓶中,加入700μl硼砂緩沖溶液和200μl衍生化試劑溶液,混勻后,放入55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,待充分反應(yīng)10分鐘后,取出并放置至室溫,作為對(duì)照品溶液。

    供試品溶液:精密稱取10.0mg本品,將其放置在裂解瓶中,然后加入5ml濃度為6mol/L的鹽酸,并充入一定質(zhì)量氮?dú)饷荛]保護(hù),將裂解瓶放置于120℃溫度條件下反應(yīng)24小時(shí),然后將其取出放置至室溫,用NaOH中和HCl,調(diào)pH為8~10之后,再將溶液轉(zhuǎn)移到容量為50ml量瓶中,并用去離子水定容。精密移取100μl置進(jìn)樣瓶中,加入700μl硼砂緩沖溶液和200μl已配制好的衍生化試劑溶液,混勻后,放入55℃的電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中,反應(yīng)10分鐘后,取出放置至室溫,作為供試品溶液

    (三)氨基酸測(cè)定

    將已經(jīng)配制好的對(duì)照品溶液精密量取10l注入HPLC,按此操作連續(xù)進(jìn)樣3針,記錄氨基酸色譜圖并測(cè)量峰面積,3針?lè)迕娣e的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)控制在≤2.0%以內(nèi)。然后精密量取供試品溶液10l并注入高壓液相色譜儀中,按此操作連續(xù)進(jìn)樣2針,記錄色譜圖,并計(jì)算樣品中各氨基酸的摩爾數(shù),并以酪氨酸、精氨酸、苯丙氨酸的相對(duì)摩爾比為1,分別計(jì)算其他氨基酸的相對(duì)摩爾比,取其平均值。其中氨基酸的摩爾數(shù)計(jì)算公式:

    (式中:Ai-----供試品溶液中氨基酸的峰面積;A-----對(duì)照品溶液中氨基酸峰面積的平均值;C-----氨基酸對(duì)照品的濃度。(單位:mmol/ml))。

    (四)建立快速氨基酸測(cè)序

    1.Edman降解第1輪反應(yīng)

    第一,將50ul1%的PITC-50%吡啶溶液加入到1號(hào)樣品中,在旋轉(zhuǎn)儀上混合均勻后充入氮?dú)狻?/p>

    第二偶合:將1號(hào)樣品管充氮10s,將管塞塞進(jìn),混合均勻后,將樣品管放置在溫度為50℃的恒溫水浴鍋中反應(yīng)20min。需要注意的在反應(yīng)過(guò)程要不時(shí)搖動(dòng)樣品管,在反應(yīng)結(jié)束后取出,立即置于冰水浴中冷卻。

    第三,初洗:向偶合后的樣品管加入500ml庚烷:乙酸乙酯(10∶1,V/V),然后充入一定質(zhì)量的氮?dú)饷荛]保護(hù),將管塞蓋緊并將管內(nèi)溶液搖勻,洗滌一次。洗滌后離心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘,然后用滴管將上層的有機(jī)相移走,將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

    第四,復(fù)洗:用500ml庚烷:乙酸乙酯(2∶1,V/V)洗滌一次,在每次洗滌過(guò)后,采用離心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘,用滴管將上層的有機(jī)相移走,將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

    第五,抽提PTC-aa:將裂解后的樣品置于冰浴中,向樣品管中加入50ul5%的吡啶溶液(蒸餾水),混勻。使混合物完全溶解。用250ml冷水飽和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提過(guò)程均需充氮?dú)?,采用離心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘。合并3次的上層有機(jī)相,真空干燥,保存并標(biāo)記為“PTC-aa1”。下層水相真空干燥后可以開始下一輪Edman降解。

    2.Edman降解第2輪反應(yīng)

    第一,將②號(hào)樣品加入1中,再加入100ul1%的PITC-50%吡啶溶液,充氮?dú)?,在旋轉(zhuǎn)混合儀上混勻。

    第二,偶合:在1號(hào)樣品管充入10s氮?dú)猓w緊管塞并搖勻,然后將樣品管置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫反應(yīng)20min。反應(yīng)途中要不時(shí)搖動(dòng),待反應(yīng)結(jié)束后將樣品管去除放置在冰水浴中冷卻。

    第三,初洗:向偶合后的樣品管加入500ml庚烷:乙酸乙酯(10∶1,V/V),充入一定質(zhì)量的氮?dú)?,蓋緊管塞并搖勻,洗滌一次。洗滌后采用離心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘,用滴管將上層的有機(jī)相移走,將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

    第四,復(fù)洗:用500ml庚烷:乙酸乙酯(2∶1,V/V)洗滌一次,每次洗滌后采用離心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘,利用滴管將上層的有機(jī)相移走,將剩下的水相層進(jìn)行真空干燥或者用氮?dú)鈱⑵浯蹈伞?/p>

    第五,抽提PTC-aa:將裂解后的樣品置于冰浴中,向樣品管中加入50μl5%的吡啶溶液(蒸餾水),混勻。使混合物溶解。用250ml水飽和的醋酸丁酯抽提3次。每次抽提均需充氮?dú)猓捎秒x心機(jī)(3500rpm)離心3分鐘。合并3次上層有機(jī)相,真空干燥,保存并標(biāo)記為“PTC-aa2”。下層水相層蒸干后可以開始下一輪Edman降解。

    3.Edman降解第3、4......N輪反應(yīng)即重復(fù)Edman降解第1、2輪反應(yīng)

    二、實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

    本次實(shí)驗(yàn)利用高效液相色譜儀測(cè)定了多肽藥物中的氨基酸成分,并通過(guò)相對(duì)摩爾比計(jì)算得出本樣品中含有精氨酸、酪氨酸、異亮氨酸、亮氨酸分別在0.80~1.20之間,含天冬氨酸、苯丙氨酸(D-苯丙氨酸)分別在1.60~2.40之間,含脯氨酸在2.40~3.60之間,含谷氨酸在3.40~4.60之間,含甘氨酸在4.20~5.80之間,考慮到試驗(yàn)的誤差,實(shí)驗(yàn)值與理論值的偏差范圍約在±20%之內(nèi)。

    三、結(jié)束語(yǔ)

    總而言之,隨著基因工程技術(shù)的應(yīng)用,氨基酸分析技術(shù)也取得了很大的進(jìn)步,人們可以利用此技術(shù)對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行改造、設(shè)計(jì)和表達(dá),從而得到各種各樣的重組蛋白,為新型生物制品的研究提供了很大的幫助,也為重組蛋白的結(jié)構(gòu)、功能等方面的研究帶來(lái)了方便。

    【參考文獻(xiàn)】

    [1]李宇,趙兵,蔣慧,等.驢奶和牛奶游離氨基酸成分分析研究[J].中國(guó)乳業(yè),2017(10):68-71.

    [2]許旻,喬琨,路海霞,等.海洋多肽功能活性與氨基酸組成的研究進(jìn)展[J].漁業(yè)研究,2017,39(6):502-508.

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