新疆地區(qū)番茄潛葉蛾遺傳多樣性的ISSR分析

李愛(ài)梅， 付開(kāi)赟， 丁新華， 何 江， 吐?tīng)栠d·阿合買提， 馮宏祖*， 郭文超

1塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300； 2新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部 西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091； 3新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院 微生物應(yīng)用研究所/新疆特殊環(huán)境微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830091

南美番茄潛葉蛾Tutaabsoluta(Meyrick)，別名番茄潛葉蛾、番茄潛麥蛾、番茄麥蛾，屬鱗翅目Lepidoptera麥蛾科Gelechiidae，原產(chǎn)于南美洲的秘魯，是世界性的檢疫入侵害蟲(chóng)(李棟等，2019)。該蟲(chóng)的傳播速度快，截至2021年2月11日，已入侵105個(gè)國(guó)家(南美洲10個(gè)、北美洲3個(gè)、歐洲31個(gè)、非洲35個(gè)、亞洲26個(gè))，成為世界性番茄SolanumlycopersicumL.的重要害蟲(chóng)。在我國(guó)，新疆伊犁、云南臨滄、貴州、四川、廣西、湖南及江西等地，相繼發(fā)現(xiàn)該蟲(chóng)危害(陸永躍，2021)。在云南省彌渡縣，大棚里的番茄植株被害率高達(dá)100%，果實(shí)被害率達(dá)19.33%，最高可達(dá)40%(尹艷瓊等，2021)。番茄潛葉蛾的寄主范圍較廣，可危害包括茄科、豆科、錦葵科、莧科、旋花科、藜科、菊科、十字花科以及禾本科在內(nèi)的近40種植物，但主要危害茄科植物，特別嗜食番茄(包括鮮食番茄、加工番茄和櫻桃番茄/圣女果)(Camposetal.,1976; Cisneros & Mujica,1998; Pereyra & Sánchez,2006)。番茄潛葉蛾幼蟲(chóng)潛入葉片并取食葉肉，還會(huì)鉆入果實(shí)內(nèi)危害，成蟲(chóng)喜在植株幼嫩的葉片上產(chǎn)卵，但隨著該植株的危害程度加劇，產(chǎn)卵偏好有所減弱(阿米熱·牙生江等，2021)。番茄潛葉蛾具有很高的生物潛能，對(duì)不同氣候條件的適應(yīng)性等方面存在差異(Vargas，1970)，可能存在著更深層次的分化。但關(guān)于我國(guó)番茄潛葉蛾的種群分化以及遺傳多樣性的研究還未見(jiàn)報(bào)道。

近些年，隨著分子生物學(xué)技術(shù)、分子標(biāo)記種類及其監(jiān)測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展，ISSR(簡(jiǎn)單重復(fù)序列區(qū)間 inter simple sequence repeat)分子標(biāo)記方法由于操作簡(jiǎn)單、成本較低、耗時(shí)短等,已成為物種遺傳變異監(jiān)測(cè)的重要方法之一(Camposetal.,2017)，被廣泛應(yīng)用于鑒定種資資源、篩選稀有品種以及探索各種群遺傳多樣性等(Essadkietal.,2006; Guptaetal.,2008; Reddyetal.,2002)。

番茄潛葉蛾是農(nóng)業(yè)上的重要害蟲(chóng)，該蟲(chóng)的入侵直接導(dǎo)致在一個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)內(nèi)番茄地塊殺蟲(chóng)劑的使用次數(shù)由12次突增到30次以上(張桂芬等,2018; Gontijoetal.,2013)，殺蟲(chóng)劑的過(guò)度使用，導(dǎo)致該蟲(chóng)對(duì)多種殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性。研究發(fā)現(xiàn)，殺蟲(chóng)劑的使用可引起昆蟲(chóng)遺傳多樣性及遺傳分化(褚棟等，2008)。新疆地區(qū)各地理種群的番茄潛葉蛾對(duì)不同類型的殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生了抗藥性，因此，對(duì)新疆地區(qū)不同地理種群的番茄潛葉蛾進(jìn)行遺傳多樣性的研究有利于了解不同區(qū)域的番茄潛葉蛾基因及遺傳分化情況對(duì)不同地理種群的影響。然而，迄今為止有關(guān)新疆地區(qū)番茄潛葉蛾的基因流及遺傳分化情況的研究較少。本研究擬采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)所采集到的20個(gè)不同地理種群的番茄潛葉蛾進(jìn)行遺傳多樣性分析，旨在明確不同地理環(huán)境下番茄潛葉蛾對(duì)其適應(yīng)性引起的遺傳變化，為番茄潛葉蛾的綜合治理提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

番茄潛葉蛾樣品采自新疆喀什地區(qū)喀什市、伽師縣、疏附縣、巴楚縣、疏勒縣、葉城縣、莎車縣，伊犁特克斯縣、霍城縣、霍爾果斯市、伊寧市、新源縣、察布查爾縣，阿克蘇溫宿縣，阿拉爾市，阿克蘇市等地區(qū)及貴州省清鎮(zhèn)市，云南省昆明市、玉溪市，哈薩克斯坦阿拉木圖州等地，樣品采集后立即放入75%酒精中,-20 ℃保存。記錄20個(gè)地理種群的編號(hào)、采樣時(shí)間、地理位置、經(jīng)緯度、海拔高度及樣本數(shù)量大小。

1.2 DNA的提取

對(duì)采集的番茄潛葉蛾進(jìn)行基因組DNA提取，提取方法按TaKaRa裂解液說(shuō)明書進(jìn)行操作。用濃度為2%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，使用B-500 BIOPHOTO METER(METASH)測(cè)定其濃度及純度，選取D260 nm/D280 nm值在1.7～1.9、濃度大于30 ng·mL-1的DNA樣品進(jìn)行ISSR遺傳多樣性分析。

1.3 ISSR預(yù)實(shí)驗(yàn)分析

1.3.1 引物篩選 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)，從哥倫比亞大學(xué)公布的第9套100條ISSR引物序列中共篩選出15條條帶清晰、多態(tài)性好的引物進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 ISSR-PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系(25 μL):2×Easy Taq PCR Super Mix 12.5μL、引物2 μL、模板DNA 1 μL、ddH2O 9.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，33～55 ℃(不同引物的退火溫度不一致)退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃下保存。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

電泳圖譜中的每一條帶均視為一個(gè)分子標(biāo)記，代表一個(gè)等位基因位點(diǎn)。按凝膠同一位置上DNA條帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有條帶記為“1”，無(wú)條帶記為“0”，將所有個(gè)體在全部位點(diǎn)上構(gòu)成1個(gè)(0或1)矩陣模型。在得到ISSR 原始數(shù)據(jù)矩陣后，將矩陣導(dǎo)入軟件中，利用POPGENE 32軟件計(jì)算各種群的遺傳參數(shù)，計(jì)算各群體的有效等位基因數(shù)Ne、Nei′s基因多樣性指數(shù)H、Shannon信息多樣性指數(shù)I、多態(tài)位點(diǎn)比率、群體內(nèi)基因多樣度Hs、總基因多樣度Ht、2種群或亞種群間的遺傳分化系數(shù)Gst(Gst=Ht-Hs/Ht)，以及基因流Nm=(1-Gst)/Gst等參數(shù)(張桂芬等，2020)。根據(jù)Nei′s遺傳距離的分析結(jié)果，利用NTSYS 2.1軟件對(duì)其進(jìn)行UPGMA聚類分析，根據(jù)所讀取的數(shù)據(jù)分析相應(yīng)的結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄潛葉蛾種群DNA的ISSR擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出各引物的最佳退火溫度(表1)，再用各引物對(duì)不同地理種群進(jìn)行ISSR擴(kuò)增(圖1)。利用15條ISSR引物對(duì)20個(gè)種群297頭番茄潛葉蛾的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，共得到137條可統(tǒng)計(jì)的條帶，平均每條引物擴(kuò)增了9.133條條帶，其中引物857、885擴(kuò)增的條帶數(shù)最高，為13條，引物818擴(kuò)增出的條帶數(shù)最少，為6條；各引物擴(kuò)增出的多態(tài)性條帶及其占比存在差異，多態(tài)性條帶占比最大的是引物807、808、811、812、826、827、856、857、868、872、886，為100%。最小的為引物885，為84.62%。不同種群的每個(gè)個(gè)體都呈現(xiàn)出唯一的ISSR基因型，說(shuō)明ISSR分子標(biāo)記對(duì)番茄潛葉蛾有較高的鑒別效率，也說(shuō)明番茄潛葉蛾的個(gè)體間存在較大的遺傳變異。這些位點(diǎn)在各個(gè)地理種群中分布不平衡，從番茄潛葉蛾20個(gè)種群的多態(tài)位點(diǎn)占比中可看出，番茄潛葉蛾的遺傳多樣性較豐富。

表1 ISSR擴(kuò)增中引物退火溫度及多態(tài)性條帶Table 1 Primer annealing temperature and polymorphic bands in ISSR amplification

圖1 引物827對(duì)察布查爾縣種群DNA的ISSR擴(kuò)增圖Fig.1 ISSR amplification map of primer 827 on the DNA of Qapqal County population M： DL2000 plus DNA marker；1～24：均為察布查爾縣樣品。 M： DL2000 plus DNA marker; 1-24: Samples from Qapqal County.

2.2 番茄潛葉蛾種群的遺傳多樣性分析

從表2可知，20個(gè)番茄潛葉蛾種群的多態(tài)性位點(diǎn)比率在31.30%～93.13%，平均多態(tài)性位點(diǎn)比率為58.28%。察布查爾縣(CBCE)地理種群多態(tài)性位點(diǎn)占比最高(93.13%)，多態(tài)性條帶多達(dá)13條，特克斯縣(TKS)地理種群多態(tài)位點(diǎn)占比最低(31.30%)。從地理空間分布上看，中國(guó)南方地區(qū)部分番茄潛葉蛾種群(GZ、YNYX、YNKM)的多態(tài)性位點(diǎn)占比低于北方地區(qū)種群(KS、JS、SF、CBCE)。特克斯縣(TKS)的Nei′s基因多樣性指數(shù)(0.1153)最小，察布查爾縣(CBCE)的Nei′s基因多樣性指數(shù)(0.2531)最大，說(shuō)明中國(guó)南北方的各個(gè)地理種群Nei′s基因多樣性指數(shù)并無(wú)規(guī)律。特克斯縣(TKS)的番茄潛葉蛾種群的I(0.1719)最小，察布查爾縣(CBCE)種群的I(0.3976)最大，說(shuō)明南北地區(qū)的番茄潛葉蛾種群遺傳多樣性較高。

表2 番茄潛葉蛾種群間的遺傳多樣性指數(shù)Table 2 Genetic diversity index among T. absoluta populations

2.3 番茄潛葉蛾種群遺傳分化及基因流

對(duì)番茄潛葉蛾種群內(nèi)遺傳分化進(jìn)行分析，物種水平上的總基因多樣性(Ht)為0.2351，種群內(nèi)的遺傳分化系數(shù)(Hs)為0.1755。根據(jù)Nei′s基因多樣度算法，20個(gè)番茄潛葉蛾地理種群之間的的遺傳分化系數(shù)(Gst)為0.2536，說(shuō)明變異來(lái)自不同的種群之間及種群內(nèi)部的個(gè)體間，占總變異的25.36%，有74.64%的變異來(lái)自于種群內(nèi)的個(gè)體之間。本研究檢測(cè)出番茄潛葉蛾物種水平上的基因流(Nm)為1.4716，表明番茄潛葉蛾各種群間的基因流存在一定的流動(dòng)性。

2.4 遺傳一致度、遺傳距離及聚類分析

由表3可知，番茄潛葉蛾20個(gè)地理種群的遺傳一致性系數(shù)在0.8502～0.9935，其平均遺傳一致性系數(shù)為0.9329，察布查爾縣(CBCE)種群與特克斯縣(TKS)種群的遺傳一致性系數(shù)(0.8502)最小，疏附縣(SF)種群與伽師縣(JS)種群的遺傳一致性系數(shù)(0.9935)最大。通過(guò)對(duì)遺傳一致性的分析，說(shuō)明所采集的各個(gè)地理種群間的遺傳一致性較高。

遺傳距離的大小反映了每個(gè)地理種群間彼此親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為確定番茄潛葉蛾20個(gè)地理種群間的遺傳關(guān)系，利用Nei′s無(wú)偏估計(jì)遺傳距離進(jìn)行了計(jì)算(表 3)。20個(gè)番茄潛葉蛾種群的遺傳距離大小在0.0065～0.1623，其平均遺傳距離為0.0726，疏附縣(SF)種群與伽師縣(JS)種群間的遺傳距離最小，為0.0065，察布查爾縣(CBCE)種群與特克斯縣(TKS)種群的遺傳距離最大，為0.1623。表明番茄潛葉蛾不同地理種群之間，遺傳分化存在著一定程度上的差異，但這種差異比較小。

使用UPGMA方法對(duì)各個(gè)番茄潛葉蛾地理種群進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖2所示，當(dāng)遺傳一致性系數(shù)為0.94時(shí)，20個(gè)地理種群的聚類分為5組，最先分出的是特克斯縣(TKS)、察布查爾縣(CBCE)、喀什市(KS)、新源縣(XY)，其余各地理為一組。其中:云南玉溪(YNYX)種群夾雜在新疆阿克蘇地區(qū)的地理種群中；哈薩克斯坦阿拉木圖州、云南、貴州、伊犁地區(qū)與喀什地區(qū)的部分地理種群交叉在一個(gè)分支里。在本研究中，番茄潛葉蛾的遺傳一致性較高，并未形成明顯的遺傳結(jié)構(gòu)，同時(shí)各個(gè)地理種群間與地理空間并未體現(xiàn)出一致的關(guān)系。

圖2 20個(gè)番茄潛葉蛾地理種群間的聚類分析圖Fig.2 Cluster analysis of 20 geographical populations of T. absoluta KS：阿克蘇市;YNYX：云南省玉溪市;ALE：阿拉爾市;HEGS：霍爾果斯市;SL：疏勒縣;BC：巴楚縣;SF：疏附縣;JS：伽師縣;HSKST： 哈薩克斯坦阿拉木圖州;YNKM：云南省昆明市;WS：溫宿縣;YN：伊寧市;GZ：貴州省清鎮(zhèn)市;HC：霍城縣;SC：莎車縣; YC：葉城縣;XY：新源縣;KS：喀什市;CBCE：察布查爾縣;TKS：特克斯縣。 AKS: Aksu City; YNYX: Yuxi City, Yunnan Province; ALE: Alar City; HEGS: Horgos City; SL: Shule County; BC: Bachu County; SF: Shufu County; JS: Jiashi County; HSKST: Almaty Prefecture, Kazakhstan; YNKM: Kunming City, Yunnan Province; WS: Wensu County; YN: Yining City; GZ: Qingzhen City, Guizhou Province; HC: Huocheng County; SC: Shache County; YC: Yecheng County; XY: Xinyuan County; KS: Kashgar City; CBCE: Qapqal County; TKS: Tekes County.

3 討論與結(jié)論

一個(gè)物種目前現(xiàn)有的遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)是根據(jù)自身原因與所在的環(huán)境因素共同作用的結(jié)果,如地理分布、基因漂變、基因流、物種進(jìn)化的歷史及交配系統(tǒng)等。就番茄潛葉蛾而言，該蟲(chóng)于2006年入侵歐洲，目前已入侵世界上105個(gè)國(guó)家。該蟲(chóng)繁殖力強(qiáng)、世代重疊嚴(yán)重、適應(yīng)性強(qiáng)，可借助人類活動(dòng)進(jìn)行遠(yuǎn)擴(kuò)散，這些特征有助于番茄潛葉蛾各種群間的基因交流，減小了遺傳漂變的影響。

本研究所選取的番茄潛葉蛾種群來(lái)自于哈薩克斯坦阿拉木圖州、云南、貴州以及新疆喀什、阿克蘇、伊犁地區(qū)，其各個(gè)不同地理種群間的遺傳多樣性豐富及遺傳結(jié)構(gòu)變異不大，造成這種差異的主要原因可能是番茄潛葉蛾入侵我國(guó)時(shí)間尚短，可能是由同一種群入侵，通過(guò)苗木運(yùn)輸、番茄產(chǎn)品的輸送等在多個(gè)地點(diǎn)擴(kuò)散。

本文初步分析了番茄潛葉蛾的遺傳多樣性，為番茄潛葉蛾部分種群遺傳結(jié)構(gòu)的研究提供了分子水平的基礎(chǔ)資料及試驗(yàn)證據(jù)。但是，ISSR分子標(biāo)記在估算種群遺傳的變異上還存在一些缺點(diǎn)，如對(duì)于標(biāo)記的顯性基因，不能區(qū)分純合體及雜合體等，為各種群遺傳變異的分析所呈現(xiàn)的統(tǒng)計(jì)信息有局限(張民照和康樂(lè)，2002)。此外，本試驗(yàn)所采集的地理種群及個(gè)體數(shù)量有限，難以全面反映番茄潛葉蛾在我國(guó)各入侵地的具體情況，還需更深入研究。

ISSR研究結(jié)果表明，番茄潛葉蛾尚處在入侵早期階段，且具備頻繁入侵和多點(diǎn)的特征。防控上要注意加強(qiáng)檢疫，阻絕多點(diǎn)入侵來(lái)源。