低酯果膠-咖啡酸交聯(lián)物的構(gòu)成機(jī)理及與抗氧化活性的構(gòu)效關(guān)系

高 凡，艾連中，吳?艷，賴鳳羲,*，張 匯，謝?凡，宋子波

（1.上海理工大學(xué)健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程技術(shù)研究中心，上海 200093；2.上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院，上海 200240；3.云南貓哆哩集團(tuán)食品有限責(zé)任公司，云南 玉溪 653100）

天然果膠是植物細(xì)胞壁的多糖，商業(yè)果膠主要來源于柑橘皮和蘋果皮，可作為膠凝劑，穩(wěn)定劑和乳化劑等在食品中廣泛應(yīng)用[1]。果膠的結(jié)構(gòu)主要由光滑區(qū)的半乳糖醛酸聚糖（homogalacturonan，HG）、毛發(fā)區(qū)的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖第I型（rhamnogalacturonan type I，RG-I）和第II型（RG-II）3 個結(jié)構(gòu)域組成[2-3]，其中HG區(qū)的半乳糖醛酸（galacturonic acid，GalA）的羧基會部分甲氧基酯化（—COOCH3），因此可分為高酯（酯化度（degree of esterification，DE）＞50%）和低酯（DE＜50%）果膠。高酯果膠在pH 2.8～3.6且蔗糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于55%時會凝膠；低酯果膠在pH 3.0～7.0下添加二價陽離子（如Ca2＋）會凝膠[1,4-5]。

果膠為優(yōu)良的親水性膠體與膳食纖維，但抗氧化活性低且疏水性不足，限制了其在多功能食品體系（如乳化、微膠囊化或活性纖維）的應(yīng)用。為了賦予果膠新的功能性（如抗氧化性）以提高其應(yīng)用范疇和使用價值，結(jié)構(gòu)修飾是常用的策略，包括化學(xué)法和生物法，其中生物法成本較高，但綠色安全、可回收永續(xù)、逐漸為主流。以酶促酚酸接枝于果膠分子為改良果膠功能性的新技術(shù)。

漆酶催化阿魏酸交聯(lián)于果膠具有以下幾項優(yōu)點：可強(qiáng)化果膠的凝膠強(qiáng)度并加快凝膠化速率，尤其是對于含有內(nèi)源性阿魏酸的甜菜果膠，容易酶促凝膠[6]；可增強(qiáng)果膠的抗氧化活性[7]；可提高蘋果、柑橘和甜菜果膠的疏水性、乳化性和水包油乳液乳化穩(wěn)定性[8]；果膠不會降解、可保留原有的凝膠和增稠特性。此外，漆酶催化的反應(yīng)環(huán)保且無毒，不需要任何化學(xué)引發(fā)劑（如H2O2）[9-10]。目前僅對果膠-阿魏酸交聯(lián)物的特性得到較為清晰的研究結(jié)果，鮮見果膠-咖啡酸（caffeic acid，CaA）交聯(lián)物相關(guān)的研究。CaA與阿魏酸同屬于羥基肉桂酸類，都是膳食中富含的天然酚酸，具有良好的自由基清除活性、抗癌活性及免疫調(diào)節(jié)等作用[11]，極具商業(yè)應(yīng)用價值。目前酶促果膠-酚酸（尤其是CaA）交聯(lián)物的特性、鍵結(jié)的分子機(jī)理和交聯(lián)物的特性（如抗氧化活性）與結(jié)構(gòu)的關(guān)系等均尚未被厘清，亟待深入研究。

因此，本研究旨在開發(fā)果膠交聯(lián)物并解析其構(gòu)成機(jī)理，采用漆酶催化果膠-CaA交聯(lián)物生成，分析交聯(lián)物的關(guān)鍵組成、光譜圖特征及抗氧化活性，并以核磁共振圖譜鑒定分子間的鍵結(jié)模式，歸納出影響抗氧化活性的結(jié)構(gòu)因素，以期為新型果膠的應(yīng)用提供重要理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘低酯果膠 美國CP Kelco公司；2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基-苯并噻唑啉-6-磺酸)二氨鹽（2,2’-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt，ABTS）、漆酶（酶活力0.99 U/mg）、重水（D2O，99.9%）、L-鼠李糖（L-rhamnose，L-Rha）、D-阿拉伯糖（D-arabinose，D-Ara）、D-半乳糖（D-galactose，D-Gal）、D-葡萄糖（D-glucose，D-Glc）、D-GalA等單糖標(biāo)準(zhǔn)品 美國Sigma-Aldrich公司；無水乙醇和氫氧化鈉上海泰坦科技股份有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、抗壞血酸、CaA、沒食子酸、福林-酚試劑、無水碳酸鈉、牛血清白蛋白、酚酞指示劑、硫酸亞鐵、肌醇等 上海源葉生物科技有限公司；溴化鉀（光譜級）和三氟乙酸 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；硝酸鈉、鹽酸和過氧化氫國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；醋酸鈉 賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260高效分子篩色譜儀-多角度激光光散射 美國Wyatt Technology公司；傅里葉變換紅外光譜儀、DionexTMICS-5000＋離子交換色譜系統(tǒng) 美國Thermo Fisher Scientific公司；L5S型紫外-可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；CR-400色差儀 日本Konica公司；掃描電子顯微鏡 日本Hitachi公司；AVANCE NEO 700MHz核磁共振波譜儀 德國Bruker公司。

1.3 方法

1.3.1 柑橘果膠的純化

果膠的純化參考醇沉法[12]。取果膠粉末以料液比1∶50加入去離子水，攪拌溶解，55 ℃旋蒸濃縮至原體積1/3～1/2后，加入3 倍體積的無水乙醇，于4 ℃冰箱過夜醇沉10 h，離心（7 000 r/min、15 min）后得到下層膠狀沉淀，攪拌細(xì)碎化，用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇溶液和無水乙醇脫水，冷凍干燥即得純化果膠CLP。

1.3.2 柑橘果膠的改性

果膠改性參考Karaki等[13]的方法并略有改動，取5 g CLP溶于425 mL的磷酸鹽緩沖溶液（50 mmol/L、pH 6.5）中，在80 ℃下水浴磁力攪拌1 h，將2 g CaA溶解于75 mL無水乙醇中，將上述兩種溶液在30 ℃下混合后（果膠終質(zhì)量濃度1 g/100 mL，CaA終濃度30 mmol/L），添加漆酶50 U反應(yīng)4 h，包裹錫箔紙在4 ℃冰箱中暗反應(yīng)24 h，去離子水透析（8～14 kDa）24 h，每隔6～8 h換一次水，以除去未交聯(lián)的CaA，旋蒸濃縮后冷凍干燥得到果膠CaA交聯(lián)物（CLP-CaA），將其放入干燥器中備用。

1.3.3 化學(xué)成分組成的測定

果膠DE采用化學(xué)滴定法[4]測定。蛋白質(zhì)量濃度采用考馬斯亮藍(lán)法[14]測定，標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝5.720 4X＋0.052 8（R2＝0.999，線性方程的質(zhì)量濃度范圍10～70 mg/mL）?？偡雍坎捎酶Ａ?酚法[15]測定，標(biāo)準(zhǔn)品為沒食子酸，結(jié)果表示為每克干質(zhì)量樣品所含的沒食子酸質(zhì)量（單位為mg/g），標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y＝0.035 4X－0.011 8（R2＝0.998，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0～20 μg/mL）。溶解度的測定是將果膠溶解在超純水中配制成0.01 g/mL的溶液，常溫下以400 r/min過夜攪拌，靜置穩(wěn)定30 min后，在25 ℃下以4 200 r/min離心20 min后，將上清液和沉淀物分別凍干48 h后，稱質(zhì)量并按式（1）計算。

式中：m1是上清液凍干后的質(zhì)量/g；m2是上清液和沉淀物的總質(zhì)量。

1.3.4 單糖組成的測定

將10 mg樣品在110 ℃下用2 mL 4 mol/L三氟乙酸溶液水解2 h，取出冷卻至室溫后，用氮吹儀吹干，反復(fù)3 次加入甲醇并吹干，最后加入2 mL的超純水溶解水解物，稀釋15 倍，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾后，進(jìn)行高效陰離子交換色譜分析。

采用ICS-5000＋高效陰離子交換色譜串聯(lián)脈沖安培檢測器分析樣品的單糖組成，色譜柱為串聯(lián)保護(hù)管柱（3 mmh30 mm）的CarboPacTMPA20（3 mmh150 mm）。進(jìn)樣量為25 μL；洗脫液：流動相A為超純水，B為25 mmol/L NaOH溶液，C為1 mol/L CH3COONa溶液，D為200 mmol/L NaOH溶液。洗脫條件：0 min時80% A＋20% B；20 min時80% A＋20% B；20.1 min時75% A＋20% B＋5% C；30 min時60% A＋20% B＋20% C；30.1 min時100% D；40 min時100% D；45 min時80% A＋20% B；60 min時80% A＋20% B，在40 ℃下采用線性梯度混合模式以流速0.5 mL/min洗脫。采用Chromeleon 7軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。以11種單糖標(biāo)準(zhǔn)品為對照，即巖藻糖（fucose，F(xiàn)uc）、Rha、Ara、Gal、Glc、木糖（xylose，Xyl）、甘露糖（mannos，Man）、果糖（fructose，F(xiàn)ru）、核糖（ribose，Rib），GalA和葡萄糖醛酸（glucuronic acid，GlcA），通過洗脫尖峰和標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行樣品單糖組成的定性和定量分析，用肌醇作內(nèi)標(biāo)，平行測定3?次。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出單糖質(zhì)量濃度和摩爾百分比，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為D-Ara：Y＝1.865 3X＋0.728 0（R2＝0.993，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0.25～12.50 μg/mL）；D-GalA：Y＝1.026 7X＋0.041 0（R2＝0.998，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0.25～12.50 μg/mL）；D-Gal：Y＝1.993 8X＋0.731 5（R2＝0.994，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0.25～10.00 μg/mL）；D-Glc：Y＝2.035 8X＋0.673 9（R2＝0.991，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0.25～10.00 μg/mL）；L-Rha：Y＝0.791 0X＋0.231 7（R2＝0.995，線性方程的質(zhì)量濃度范圍0.25～12.50 μg/mL）。其中Y為尖峰面積/（10－9Cgmin）、X為單糖質(zhì)量濃度/（μg/mL）。

1.3.5 分子質(zhì)量相關(guān)參數(shù)的測定

用流動相（0.1 mol/L NaNO3、質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.02% NaN3）制備1 mg/mL的CLP和CLP-CaA樣品溶液，過濾后（0.22 μm）取100 μL注入高效分子篩色譜系統(tǒng)分析，該系統(tǒng)配備多角度激光光散射檢測器、黏度檢測器、示差折射檢測器和紫外檢測器，串聯(lián)一支保護(hù)管柱和兩支分析管柱（OHpak SB-805 HQ（8.0 mmh300 mm，13 μm）和SB-803 HQ（8 mmh300 mm，10 μm）），在40 ℃下以流速0.6 mL/min洗脫80 min；折射率增量設(shè)置為0.145 mL/g，并采用ASTRA 7.1.3軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集、處理和分析。

果膠大分子的構(gòu)象通過Mark-Houwink-Sakurada方程[16]（式（2））和非均向性構(gòu)性參數(shù)ρ=Rg/Rh[17]來表征，ρ與分子鏈構(gòu)象的剛性和硬度成正比，指數(shù)ρ＜0.775、1.5＜ρ＜1.8和ρ＞2分別表示構(gòu)象為緊密的球狀、柔軟的無規(guī)則線狀和伸展性分子，其中環(huán)動半徑（gyration of radius，Rg）和水合動態(tài)半徑（hydrodynamic radius，Rh）分別通過Flory-Fox（式（3））和Einstein-Simha公式[18]（式（4））計算得出。

式中：[η]為特性黏度/（mL/g）；M為果膠的摩爾質(zhì)量/（g/mol）；K和a為與聚合物構(gòu)象有關(guān)的參數(shù)（K/（mL/g）），指數(shù)a＞1.4、0.8＜a＜1.4、0.5＜a＜0.8、0.2＜a＜0.5和a＝0.0時，分子構(gòu)象分別為超剛性棒狀、剛性棒狀、半柔性線圈、無規(guī)則線圈和球狀球體或高度支鏈；Φ為Flory-Fox黏度常數(shù)，與鏈的剛性有關(guān)；NA為阿伏伽德羅常數(shù)（6.02h1023mol－1）。

1.3.6 紫外全波長掃描

分別配制質(zhì)量濃度0.000 25 g/mL交聯(lián)前后的果膠溶液，以CaA標(biāo)準(zhǔn)品0.000 01 g/mL作為參比對照，使用L5S型紫外-可見分光光度計在190～600 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長掃描，定性分析交聯(lián)前后果膠最大吸收波長的變化。

1.3.7 色差的測定

采用CR-400色差儀對果膠色差值進(jìn)行測定。將CLP和CLP-CaA配制為0.005 g/mL的溶液，測定其色差參數(shù)L*、a*、b*值和ΔE（CLP與CLP-CaA間的色差），其中ΔE的計算如公式（5）所示。校正白板的L*＝95.2，a*＝－0.44，b*＝3.47。

式中：ΔL*、Δa*和Δb*分別為CLP-CaA與CLP間a*、b*和L*的差值。

1.3.8 傅里葉變換紅外光譜掃描

采用KBr壓片法，分別將2 mg凍干果膠粉和CaA粉末與100 mg KBr置于瑪瑙研缽中研磨壓片制成直徑7 mm的薄片，使用傅里葉變換紅外光譜儀對其進(jìn)行測試，以空氣作為背景，掃描范圍為4 000～400 cm－1；掃描次數(shù)為64 次；分辨率為16 s－1，使用OMNIC軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)采集和分析。

1.3.9 核磁共振分析

將果膠放置真空干燥箱80 ℃干燥6 h后，稱取40 mg的CLP和CLP-CaA溶解于1 mL D2O，反復(fù)凍干溶解3 次，將H完全替換為D，轉(zhuǎn)移到核磁管中。以配備BBO超低溫探頭的AVANCE NEO 700 MHz核磁共振波譜儀在298.0 K下掃描700 MHz1H核磁共振和176 MHz13C核磁共振圖譜，譜寬分別為14 706 Hz和41 667 Hz，掃描次數(shù)分別為16 384?次和32 768 次，以四甲基硅烷外標(biāo)物的信號標(biāo)定化學(xué)位移（δ）。氫譜采用去偶合程序去除水（HOD：重水信號峰）在δH4.7～4.8的信號，以提高圖譜分辨率。

1.3.10 掃描電子顯微鏡觀察

配制100 μg/mL的樣品溶液，在4 ℃下穩(wěn)定12 h后，所有溶液立即浸入液氮中以快速冷凍。然后，將冷凍的果膠凍干48 h，直到完全干燥。取干燥后的果膠粉末放置于云母盤上，噴金使樣品導(dǎo)電，在高真空下以1 kV的電壓加速，使用掃描電子顯微鏡在300 倍和10 000 倍下觀察樣品表面結(jié)構(gòu)特性。

1.3.11 DPPH自由基清除率測定

參照Kirigaya等[19]的方法稍作修改。將2.0 mL新鮮配制的DPPH溶液分別與2.0 mL不同質(zhì)量濃度的果膠及其交聯(lián)物溶液（0.5～3.0 mg/mL）充分混勻，室溫避光反應(yīng)30 min后，以體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液調(diào)零，在517 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照（0.005～3.000 mg/mL），按照公式（6）計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照（體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液代替樣品或VC）的吸光度；A1為DPPH溶液與樣品或陽性對照VC的吸光度；A2為體積分?jǐn)?shù)80%乙醇溶液代替DPPH溶液的吸光度。

1.3.12 超氧陰離子自由基清除率測定

參照Fridovich等[20]的實驗方法稍作修改。將1.0 mL樣品溶液（0.5～3.0 mg/mL）、1.0 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)（108 μmol/L）和1.0 mL煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（468 μmol/L）溶液均勻混合后加入1.0 mL吩嗪硫酸甲酯（60 μmol/L）溶液，將上述混合好的溶液室溫下靜置5 min，在560 nm波長處測定吸光度，以上溶液均用Tris-HCl緩沖液（16 mmol/L、pH 8.0）配制，以VC為陽性對照（0.08～3.00 mg/mL），按照公式（7）計算O2－·清除率。

式中：A0為空白對照（Tris-HCl緩沖液代替樣品或VC）的吸光度；A1為顯色體系（除樣品之外的反應(yīng)體系）與樣品或陽性對照VC的吸光度；A2為緩沖液與樣品或VC的吸光度。

1.3.13 ABTS陽離子自由基清除率測定

參照Re等[21]的方法稍作修改。用去離子水配制ABTS終濃度為7 mmol/L和過硫酸鉀終濃度為2.45 mmol/L的混合溶液，避光置于室溫下16 h，即得到ABTS母液。ABTS母液在使用之前用去離子水稀釋60～80 倍至其在734 nm波長處的吸光度（A0）為0.90±0.02，即得到ABTS工作液。取0.2 mL樣品溶液（0.5～3.0 mg/mL）加入到4 mL ABTS工作液中，在室溫避光條件下反應(yīng)20 min后，于734 nm波長處測定吸光度，以無水乙醇為空白對照，VC為陽性對照（0.01～3.00 mg/mL），按照公式（8）計算ABTS陽離子自由基清除率。

式中：A0為空白對照（無水乙醇代替樣品或VC）的吸光度；A1為ABTS工作液與樣品或陽性對照VC的吸光度；A2為乙醇代替ABTS工作液的吸光度。

1.3.14 羥自由基清除率測定

參照Smirnoff等[22]的方法稍作修改。將0.6 mL 6 mmol/L FeSO4g7H2O溶液與2.0 mL果膠及其交聯(lián)物溶液（0.5～3.0 mg/mL）分別混勻后，加入0.6 mL 6 mmol/L的H2O2溶液，充分混勻后反應(yīng)10 min，再向各管加入6 mmol/L水楊酸-無水乙醇溶液0.6 mL，將各管中的溶液充分混合后反應(yīng)10 min，在510 nm波長處測定吸光度，以VC為陽性對照（0.06～3.00 mg/mL），按公式（9）計算·OH清除率。

式中：A0為空白對照（蒸餾水代替樣品或VC）的吸光度；A1為顯色體系（除樣品之外的反應(yīng)體系）與樣品或陽性對照VC的吸光度；A2為蒸餾水代替H2O2溶液的吸光度。

1.3.15 Fe2＋螯合率測定

參照Dinis等[23]的方法稍作修改。將1 mL不同質(zhì)量濃度（0.5～3.0 mg/mL）的果膠及其交聯(lián)物溶液和2 mmol/L FeCl2溶液0.1 mL、5 mmol/L啡啰嗪-鈉鹽溶液0.2 mL混合，用3.7 mL蒸餾水補(bǔ)至5 mL混勻。將上述混合好的溶液在室溫條件下進(jìn)行孵育10 min，在560 nm波長處測定吸光度。以EDTA-2Na為陽性對照（0.01～3.00 mg/mL），按公式（10）計算Fe2＋螯合率。

式中：A0為空白對照（蒸餾水代替樣品或EDTA-2Na）的吸光度；A1為樣品與顯色體系（除樣品之外的反應(yīng)體系）的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

實驗結(jié)果皆以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。顯著性差異分析用SPSS Statistics 24.0軟件通過Duncan法進(jìn)行多重比較確定，并以P＜0.05表示具有顯著性差異。利用SPSS軟件的Probit回歸分析計算清除自由基50%對應(yīng)的樣品質(zhì)量濃度（half maximal inhibitory，IC50）。以O(shè)riginPro 2021b軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CLP-CaA、CLP的化學(xué)組成與水溶解度

圖1為果膠及其交聯(lián)物和單糖混標(biāo)的離子色譜圖，和標(biāo)準(zhǔn)品比較發(fā)現(xiàn)，低酯柑橘果膠CLP的GalA含量最多，其次為Gal，然后為Rha和Glc，Ara微量，具備典型的果膠單糖組成特征。與CLP比較，CLP-CaA的GalA尖峰信號強(qiáng)度明顯降低，Gal、Rha、Glc和Ara信號強(qiáng)度明顯增加。

圖1 CLP-CaA、CLP和11種混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品的離子色譜Fig. 1 HPAEC chromatograms of CLP, CLP-CaA and a mixture of 11 monosaccharide standards

如表1所示，CLP的DE為38.33%，總酚含量為1.20 mg/g，蛋白質(zhì)量百分比為2.36%，溶解度為86.95%。與CLP比較，交聯(lián)物CLP-CaA DE顯著上升到46.93%；總酚含量也顯著提高到9.64 mg/g；蛋白質(zhì)量百分比顯著提升至4.12%；溶解度顯著降低到81.19%。單糖組成方面，CLP的GalA摩爾百分比（GalA%）為51.99%，Gal摩爾百分比（Gal%）為30.95%，Rha摩爾百分比（Rha%）為7.44%，Glc摩爾百分比（Glc%）為9.02%，Ara摩爾百分比（Ara%）為0.60%。與CLP比較，交聯(lián)物CLP-CaA的GalA摩爾百分比顯著降低到44.63%，Gal摩爾百分比顯著上升到35.51%，Rha（8.46%）、Glc（10.04%）和Ara（1.36%）摩爾百分比也顯著高于CLP。此外還評估了5?種結(jié)構(gòu)指標(biāo)：同型半乳糖醛酸聚糖摩爾百分比（HG%）、第一型鼠李糖半乳糖醛酸聚糖I摩爾百分比（RG-I%）、GalA%/（Rha%＋Ara%＋Gal%）、Rha%/GalA%和（Ara%＋Gal%）/Rha%，后三者分別代表果膠的線性比值（果膠鏈的線性結(jié)構(gòu)，用于評估果膠的線性結(jié)構(gòu)的完整性）、分枝度和RG-I分支側(cè)鏈的長度。與CLP比較，HG%顯著降低、RG-I%顯著上升，GalA%/（Rha%＋Ara%＋Gal%）顯著降低，Rha%/GalA%和（Ara%＋Gal%）/Rha%無顯著變化。綜上，CLP結(jié)構(gòu)具有大量的HG（44.55%）和RG-I（46.43%）區(qū)域，RG-I的中性糖側(cè)鏈主要為聚半乳糖，由于無Xyl和Fuc等單糖存在，故CLP中無木糖半乳糖醛酸聚糖，且無第二型的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖II（RG-II）；Glc的存在可歸因于黏附在果膠側(cè)鏈上的半纖維素[24-25]。

表1 CLP-CaA和CLP的化學(xué)組成與水溶解度Table 1 Chemical compositions and water solubilities of CLP-CaA and CLP

綜上所述，CLP的DE與低酯蘋果果膠（DE 41%）[25]和低酯向日葵果膠（DE 34%）[26]相近，低于歐李果膠（DE 52%）[25]和高酯柑橘果膠（DE 55%～56%）[27-28]。此外，CLP的HG%、RG-I%、線性比值和分枝度均接近高酯柑橘果膠（HG% 46%～50%、RG-I% 42%～44%、線性比值1.37～1.78、分枝度0.12～0.15）[27-28]，明顯不同于蘋果、歐李果和向日葵果膠的結(jié)構(gòu)特征（HG% 59%～70%、RG-I% 24%～106%、線性比值0.7～3.5、分枝度0.04～0.16）[25-26]。因此可推知CLP富含RG-I分子片段且中性糖分枝（由Ara和Xyl組成）含量低是柑橘果膠的共同特征，并受酸液提取條件部分影響。CLP-CaA交聯(lián)物的DE和總酚含量均顯著上升，溶解度和GalA摩爾百分比均顯著降低，提高了果膠側(cè)鏈相對占比。本研究以CLP制得的CLP-CaA總酚含量（9.64 mg /g）低于超低酯柑橘果膠-阿魏酸交聯(lián)物總酚含量（54.7 mg/g）[13]以及阿拉伯膠-阿魏酸交聯(lián)物總酚含量（86.2 mg/g）[29]，接近偶聯(lián)反應(yīng)制備的殼聚糖-CaA交聯(lián)物CaA含量（7.67～10.21 mg/g）[30]，故知CLP-CaA的總酚含量是合理的。

2.2 CLP-CaA、CLP的分子質(zhì)量及構(gòu)象表征

CLP及CLP-CaA的分子質(zhì)量參數(shù)如表2所示，CLP的重均分子質(zhì)量（mw）為226.1 kDa，數(shù)均分子質(zhì)量（mn）為86.4 kDa，多分散性指數(shù)（polymer dispersity index，PDI）（PDI＝mw/mn）為2.62、固有黏度[η]平均為222.5 mL/g、MHS參數(shù)K為0.436 mL/g、a為0.552；而假設(shè)果膠分子在0.1 mol/L硝酸鈉溶液中為球狀，將上述mw和[η]代入Flory-Fox和Einstein-Simha公式，所得Rg為38.9 nm、Rh為16.35 nm、ρ為2.38。CLP的mw和Rg介于高酯柑橘果膠之間（mw174～282 kDa，Rg33～49 nm）[27-28]。交聯(lián)CaA后，CLP-CaA的mw、mn和K均顯著增加（分別為271.4 kDa、114.1 kDa和0.479 mL/g），但PDI、[η]、a、Rg以及ρ均明顯降低，分別降至2.38、183.2 mL/g、0.524、30.6 nm以及1.88。綜上所述，CaA交聯(lián)促使CLP果膠的分子質(zhì)量增加、分布更均一，但分子質(zhì)量并未增加至使CLP產(chǎn)生雙聚合；在0.1 mol/L的硝酸鈉溶液中CLP和CLP-CaA皆呈柔軟的無規(guī)則線圈狀（由兩者a為0.5～0.8和CLP-CaA的ρ為1.88判知），但CLP的環(huán)動體積顯著增大、鏈段較硬（由ρ＞2判知）。

表2 CLP及CLP-CaA交聯(lián)物的分子質(zhì)量、固有黏度和分子粒徑參數(shù)Table 2 Molecular masses, intrinsic viscosities and molecular size parameters of CLP and CLP-CaA conjugate

2.3 CLP-CaA、CLP的紫外-可見吸收光譜和色差

從圖2A可見，CLP在190～450 nm范圍內(nèi)無明顯吸收峰。CaA有兩個吸收峰區(qū)域：200～250 nm和260～330 nm，其中218、243、299 nm和326 nm為最大吸收波長。CLP-CaA交聯(lián)物僅在288 nm波長處發(fā)現(xiàn)吸收峰。和CLP相比，CLP-CaA呈現(xiàn)出與CaA相關(guān)的特征性吸收峰（288 nm波長處吸收峰和225 nm波長處肩峰），表明CaA的存在。此外，CaA與自由羧基有關(guān)的299 nm波長處吸收峰在CLP-CaA中藍(lán)移到288 nm，此藍(lán)移現(xiàn)象也發(fā)現(xiàn)于殼聚糖-CaA系統(tǒng)[9,31-32]，與羧基酯化有關(guān)。圖2B顯示CLP溶液的L*、a*和b*值分別為38.04、2.91和17.22，與CLP相比，CLP-CaA的L*值顯著降低，表明其亮度下降；a*值顯著降低，表明其顏色更偏綠；b*值顯著升高，表明其顏色變黃；綜合得出與CLP相比（對照組），CLP-CaA的ΔE顯著提高（10.40），偏向暗黃色。本研究發(fā)現(xiàn)漆酶催化合成CLP-CaA交聯(lián)物的紫外光-可見光光譜圖與色差的變化類似于殼聚糖-CaA[32-33]。

圖2 CLP-CaA和CLP的紫外-可見光吸收光譜與CIE色差Fig. 2 UV-visible spectra and CIE color parameters of CLP-CaA and CLP

CLP-CaA交聯(lián)物呈黃色，與柑橘果膠-阿魏酸交聯(lián)物[13]以及白蘿卜果膠-阿魏酸交聯(lián)物[34]的黃色一致，不同于利用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽/1-羥基苯并三唑（1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride/1-hydroxybenzotriazole，EDC/HOBt）偶聯(lián)反應(yīng)合成的殼聚糖-CaA交聯(lián)物呈暗黃色[33]及以酪氨酸酶催化合成的殼聚糖-CaA交聯(lián)物呈褐色[35]。綜上可知，多糖-酚酸交聯(lián)物呈黃色或褐色，隨酚酸和多糖種類不同而異，顏色變化可歸因于漆酶催化酚酸與多糖的交聯(lián)反應(yīng)，通過漆酶催化，酚羥基兩階段氧化分別生成酚氧自由基和醌類物質(zhì)，其中醌作用在果膠分子[13,29]上聚合而呈現(xiàn)褐色。

2.4 CLP-CaA、CLP的傅里葉變換紅外光譜分析結(jié)果

圖3A為交聯(lián)前后果膠和CaA的傅里葉變換紅外光譜圖，樣品在3 423 cm－1處附近的寬峰為OüH的伸縮振動所引起，為糖類的特征吸收峰；在2 935 cm－1處吸收峰為多糖中CüH鍵的伸縮振動所引起；1 735 cm－1和1 616 cm－1處的吸收峰分別對應(yīng)于甲酯化和游離羧基中的C＝O鍵的拉伸振動；1 400～1 200 cm－1處為CüH伸縮振動和變角振動吸收峰；在1 200～800 cm－1之間的光譜被認(rèn)為是碳水化合物的“指紋”區(qū)域[36]，其中1 145 cm－1處為糖苷鍵上OüCüO不對稱的拉伸振動吸收峰，1 100 cm－1與1 017 cm－1處吸收峰與糖環(huán)和側(cè)鏈上的CüCüO拉伸振動有關(guān)，為GalA的特征信號，而953 cm－1處小肩峰和835 cm－1處吸收峰分別為β-和α-糖苷鍵C?O彎曲振動的特征信號[24]。CaA在3 431、2 983、1 648、1 618、1 530、1 278 cm－1處的吸收峰（圖3B）分別與芳香環(huán)的OüH、CüH、C＝O、C＝O、C＝C和CüO的拉伸振動相關(guān)，在803 cm－1和852 cm－1處的兩個小而尖銳的峰與CaA苯環(huán)上相鄰的兩個氫原子有關(guān)。和CLP相比，CLP-CaA在1 613 cm－1處的峰面積明顯減小，出現(xiàn)新的1 519 cm－1特征吸收峰（為CaA獨(dú)有的特征吸收峰，CLP沒有），此結(jié)果與CLP-CaA的DE顯著高于CLP（表1）和紫外-可見吸收光譜的特征峰藍(lán)移現(xiàn)象（圖2A）都證明CLP-CaA的羧基發(fā)生酯化，與柑橘果膠-阿魏酸[13]和白蘿卜果膠-阿魏酸[34]的研究結(jié)果類似，且柑橘果膠-阿魏酸交聯(lián)物的特征峰在1 515 cm－1（阿魏酸）和1 650 cm－1（自由羧基）處發(fā)生變化，表明該酚酸交聯(lián)鍵結(jié)到果膠的羧基上[37]。

圖3 CLP-CaA, CLP和CaA的傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 FTIR spectra of CLP-CaA, CLP and CaA

2.5 CLP-CaA、CLP的核磁共振結(jié)構(gòu)特征

由上文可知CLP主要由HG主干和RG-I分枝區(qū)所組成，RG-I的中性糖側(cè)鏈為聚半乳糖（表1）；HG由α-(1,4)-GalA組成，RG-I的聚半乳糖由β-(1,4)-Gal組成，Rha為分枝點[2-3]。參考百香果皮果膠[36]、柔毛橘鳳榴果膠[38]以及猴面包樹果漿果膠[39]的核磁共振圖譜特征，可鑒定出CLP的主要結(jié)構(gòu)單元對應(yīng)的化學(xué)位移信號（δ），如圖4A所示，其中氫譜皆為CüH相關(guān)的信號。α-D-GalA糖基C1δC99.10和H1δH5.25；C2δC68.02，H2δH3.66；C3δC68.63，H3δH4.02；C4δC77.92，H4δH4.05；C5δC71.07，H5δH4.90；C6羧基δC174.92，無δH；甲氧基C7δC52.82，H7δH3.73。β-D-Gal糖基C1’δC104.32，H1’δH4.48；C2’δC71.77，H2’δH3.51；C3’δC73.26，H3’δH3.6；C4’δC77.62，H4’δH4.26；C5’δC74.47，H5’δH3.6；C6’δC60.69，H6’δH3.89。H5、H1’和H4’信號因接近水HOD信號（δH4.6～4.7）而受去偶合程序去除水信號的影響減小。α-L-Rha糖基C6（以R6表示）δC16.50和H6δH1.11特征明顯，伴隨δC97.47（C1）和δC70.05（C3）小尖峰。δH3.2～3.7部分尖峰來自甲基酯化的α-D-GalA（圖4A中2e、3e）。

圖4B為CLP-CaA交聯(lián)物的核磁共振圖譜與鑒定結(jié)果。根據(jù)幾丁聚糖-CaA交聯(lián)物[32]、羧甲基普魯蘭多糖-阿魏酸交聯(lián)物[40]和阿拉伯膠-阿魏酸交聯(lián)物[41]，可知CaA的特征信號區(qū)在δC112～168和δH6.3～12.2，反應(yīng)前CaA C9δC167.7明顯不同于CLP糖基的特征區(qū)（δC60～110和δH3～6）。氫譜上δH6～8為CaA苯環(huán)上次甲基和亞甲基的特征尖峰區(qū)，δH6.3、6.75、6.88、7.25和7.51分別來自H8”、H6”、H5”、H2”和H7”。CaA的碳共振信號（δC112～168）受到CLP的化學(xué)遮蔽而未顯示出。圖4B清楚呈現(xiàn)了未交聯(lián)的糖基信號（同圖4A的CLP）及因交聯(lián)而位移的新共振尖峰（標(biāo)有*），位移最大的是α-D-GalA糖苷鍵碳C1*（δC上移到92.12較高磁場遮蔽區(qū)）和C4*（δC下移到81.31較低磁場遮蔽區(qū)），伴隨原來C1（δC99.10）和C4（δC77.92）共振尖峰明顯變小，氫譜H1*δH下移到5.34，H4*δH下移到4.11，且H1（δH5.25）和H4（δH4.05）的尖峰明顯變小。其他的碳?xì)浜挺?D-Gal糖基碳?xì)涞男录夥逦灰菩?，僅在原尖峰附近。

圖4 CLP和CLP-CaA的核磁共振圖譜與相關(guān)結(jié)構(gòu)示意圖Fig. 4 NMR spectra and structural illustration of CLP and CLP-CaA

綜合上述核磁共振特征變化，可推知漆酶催化CaA作用在CLP的α-D-GalA糖基上，由分子質(zhì)量的增加程度（表2）說明兩者為1分子CaA對1分子自由羧基結(jié)合，交聯(lián)物沒有再聚合。此外，α-D-GalA的C6δc由174.92偏移到175.12，此結(jié)果和CLP-CaA DE增加（表1）、288 nm波長處有吸收尖峰（圖2A）和傅里葉變換紅外光譜（圖3A）皆支持了CaA作用在α-D-GalA C6羧基上形成酯基的推論，此機(jī)制與漆酶催化阿魏酸（和CaA同屬于羥基酚酸類）作用于柑橘果膠[13]、羧甲基普魯蘭多糖[40]和阿拉伯膠[41]的羧基上形成酯基的機(jī)理類似，涉及半醌中間產(chǎn)物的生成和親核性作用于GalA C6上，但本研究CLP-CaA沒有再聚合形成雙聚體，而阿魏酸-普魯蘭多糖交聯(lián)物涉及生成雙聚體[40]。

2.6 CLP-CaA、CLP的微觀形態(tài)觀察結(jié)果

圖5為CLP及交聯(lián)物CLP-CaA的掃描電子顯微鏡圖。在放大300 倍下，樣品均呈空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，CLP的結(jié)構(gòu)較為粗糙和疏松，而CLP-CaA表面較為光滑和緊湊。放大10 000 倍下可更清楚地看出兩者的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)皆呈現(xiàn)細(xì)絲交聯(lián)纏繞推疊，但CLP的網(wǎng)格結(jié)構(gòu)比較雜糅疏松，由無規(guī)則卷曲的細(xì)絲夾雜著棒狀、薄片狀、團(tuán)塊狀等結(jié)構(gòu)組成；而CLP-CaA多呈柔性細(xì)絲狀結(jié)構(gòu)纏繞，結(jié)構(gòu)較致密。綜上所述，CaA交聯(lián)可促使CLP-CaA材料表面較細(xì)致和均勻光滑，可能是酚酸酯化作用賦予果膠分子鏈部分疏水性所致。阿魏酸交聯(lián)于柑橘果膠[7]及CaA交聯(lián)于殼聚糖[33]也有類似的結(jié)構(gòu)細(xì)致化效果。

圖5 CLP-CaA和CLP的掃描電子顯微鏡圖Fig. 5 Scanning electron micrographs of CLP-CaA and CLP

2.7 CLP-CaA、CLP的抗氧化活性

圖6顯示CLP和CLP-CaA對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH、O2－·清除率以及Fe2＋螯合率都有明顯的濃度依賴性，且CLP-CaA的效果總體顯著高于CLP。在1 mg/mL下，VC、CLP和CLP-CaA的DPPH自由基清除率分別為95.1%、13.4%和55.3%（圖6A）；ABTS陽離子自由基清除率分別為100%、2.0%和27.8%（圖6B）；·OH清除率分別為100%、37.8%和54.7%（圖6C）；O2－·清除率分別為92.2%、6.6%和67.9%（圖6D）；而Fe2＋螯合率分別為99.0%、3.6%和11.5%（圖6E）。

圖6 CLP和CLP-CaA的體外抗氧化活性Fig. 6 In vitro antioxidant activity of CLP and CLP-CaA

上述抗氧化活性的IC50見表3。CLP只有對·OH清除率的IC50為2.02 mg/mL；而CLP-CaA對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH和O2－·清除率的IC50分別為0.82、2.47、0.92 mg/mL和0.72 mg/mL，雖然弱于VC的清除效果（IC50分別為0.01、0.05、0.11 mg/mL和0.32 mg/mL），但對O2－·的清除效果約達(dá)到VC的一半，具有潛在的商業(yè)利用價值。

表3 CLP和CLP-CaA對不同自由基清除能力的IC50或螯合能力的IC50Table 3 IC50 of CLP and CLP-CaA for scavenging of free radicals and chelating of Fe2＋

本研究發(fā)現(xiàn)CaA交聯(lián)作用可使CLP-CaA抗氧化活性明顯提升，尤其是在DPPH自由基、·OH和O2－·的清除方面。比較不同的多糖-酚酸交聯(lián)物的體外抗氧化活性發(fā)現(xiàn)，CLP-CaA的抗氧化活性顯著高于果膠-阿魏酸交聯(lián)物（對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率IC50分別為1.4 mg/mL和11.2 mg/mL）[7]，與殼聚糖-阿魏酸交聯(lián)物（對·OH和O2－·清除率IC50分別為0.75 mg/mL和0.76 mg/mL）[31]無明顯差異，但顯著低于殼聚糖-CaA交聯(lián)物（對DPPH自由基、ABTS陽離子自由基、·OH和O2－·清除率IC50分別為0.37、0.17、0.50 mg/mL和0.30 mg/mL）[31-32]。綜上可知，CaA交聯(lián)物比阿魏酸交聯(lián)物的抗氧化活性高，可歸因于CaA的苯環(huán)結(jié)構(gòu)中對位和鄰位的羥基對自由基具有協(xié)同的共振穩(wěn)定效果，優(yōu)于具有單一對位羥基阿魏酸的效果。本研究也發(fā)現(xiàn)CLP的體外抗氧化活性僅體現(xiàn)在對·OH的清除方面（IC50＝2.0 mg/mL），對其他自由基的清除率效果相對較差，此外，研究表明柑橘果膠（對DPPH自由基和ABTS陽離子自由基清除率IC50分別為29.5 mg/mL和116.2 mg/mL）[7]和阿拉伯膠（對ABTS陽離子自由基清除率IC50為562.28 mg/mL）[29]的抗氧化活性也不明顯，說明多糖結(jié)構(gòu)對體外抗氧化活性的貢獻(xiàn)相當(dāng)有限。

3 結(jié) 論

本研究主要分析了CLP和CLP-CaA的組成結(jié)構(gòu)差異、色差和表面微觀形態(tài)，并重點探究了交聯(lián)機(jī)理及其與抗氧化性的構(gòu)效關(guān)系。結(jié)果顯示CLP和CLP-CaA的DE分別為38.33%和46.93%，總酚含量分別為1.20 mg/g和9.64 mg/g。單糖組成分析結(jié)果表明CLP-CaA主要由HG和RG-I組成，其GalA摩爾百分比顯著降低、側(cè)鏈含量增多、分子質(zhì)量明顯增加、構(gòu)象偏軟以及紫外光譜和紅外光譜分別在288 nm和1 519 cm－1出峰都證明了CLP-CaA中含有CaA單元。核磁共振波譜發(fā)現(xiàn)相較于CLP，CLP-CaA在δH6～8出現(xiàn)CaA質(zhì)子峰，且接枝反應(yīng)主要在α-D-GalA糖基的C6羧基上。此外，交聯(lián)物的微觀結(jié)構(gòu)趨于緊密和光滑，更偏柔性且顏色變黃。此外，交聯(lián)果膠的抗氧化性也得到了顯著性提升，歸因于果膠鏈上接枝CaA含有酚羥基，故CLP-CaA可作為新型果膠抗氧化劑。后續(xù)研究可以探索果膠交聯(lián)物的抗菌性、免疫活性以及在多種應(yīng)用條件（如pH值、溫度和鹽離子）下的流變特性變化，以優(yōu)化應(yīng)用的配方。