基于脫氧核酶-熒光共振能量轉移效應的食品中 鉛離子快速檢測

劉玉梅，史雅辰，任堯，鄧銳杰，趙志峰，何強

（四川大學輕工科學與工程學院，四川成都 610065）

鉛是人體非必需金屬元素[1]，人體微量暴露即具有潛在的生殖毒性[2]、神經毒性[3,4]和基因毒性[5]。相較于其它金屬離子，鉛離子具有較長的半衰期[6]及一定的生物富集性[7]。在人體富集后會誘發(fā)關節(jié)炎[8]、肝腎損傷[9]，甚至癌癥[10]。飲水[11]、膳食[12]、呼吸[13]和皮膚接觸[14]是鉛離子暴露的主要形式，因此有必要對食品及環(huán)境中的鉛離子進行監(jiān)測。傳統(tǒng)的鉛離子檢測方法[15]如石墨爐原子吸收光譜法（Graphite Furnace Atomic Absorption Spectrometry，GFAAS），電感耦合等離子體質譜法（Inductively-Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS）和火焰原子吸收光譜法（Flame Atomic Absorption Spectroscopy，F(xiàn)AAS）作為食品中鉛測定的國標方法，檢測靈敏、結果準確。然而這些方法需要專業(yè)的技術人員操作、依賴昂貴的實驗室設備，同時存在樣品前處理復雜、檢測時間長等問題。

脫氧核酶（DNAzymes）是通過體外指數富集的配體系統(tǒng)進化篩選技術（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment，SELEX）篩選出的單鏈DNA序列，在溶液中可自我折疊形成復雜的三維結構，具有可設計性、可組裝性、可儲存性及高效的催化活性[16]。不同的脫氧核酶可被特定的金屬離子激活，如鉛離子[17]、鈾酰離子[18]、鈉離子[19]、銀離子[20]、鉈離子[21]等。脫氧核酶具有極高的特異性及穩(wěn)定性，因此是鉛離子檢測體系的常見構成單元。Li等[22]將脫氧核酶與Cas12a蛋白結合起來用于快速、高效地檢測鉛離子。該方法十分靈敏，檢出限僅為0.053 nmol/L，然而該反應依賴于昂貴的Cas蛋白及轉錄、磁分離技術，操作較為復雜。

熒光共振能量轉移（Fluorescence Resonance Energy Transfer，F(xiàn)RET）是處于激發(fā)態(tài)的供體將能量轉移給鄰近處于基態(tài)的受體，即是一種表征和探測相鄰供體和受體之間相互作用的技術。供體與受體間距離不同，F(xiàn)RET效率不同，因此FRET效率可以反應供體與受體之間的距離。鑒于FRET效應的靈敏性及靈活性，F(xiàn)RET已被應用于監(jiān)測脫氧核酶的構型變化、核酸鏈之間的結合情況及金屬離子介導的酶切過程等。He等[23]基于金納米離子與TAMRA基團之間的FRET效應設計了一種靈敏、精確的銅離子檢測熒光傳感器。Chen等[24]將雜交鏈式反應（Hybridization Chain Reaction，HCR）與FRET結合起來用于銅離子的檢測。Liu等[25]將碳點、金納米棒與FRET效應結合起來設計了一種“Off-On”型的生物傳感器。不僅如此，Yang等[26]設計了一種可以在單細胞內靈敏檢測鉛離子的傳感器，檢出限僅為10 nmol/L，遠低于世界衛(wèi)生組織的相關標準。然而這些方法設計較為復雜、耗時長、需要擴增反應、成本較高。

本文基于脫氧核酶對鉛離子的高度選擇性及FRET效應對供體、受體間距離感知的靈敏性，設計了一種操作簡單、不依賴擴增的室溫鉛離子快速檢測方法。當鉛離子存在時，脫氧核酶在特定位點切割底物鏈并釋放修飾了BHQ1猝滅基團的斷鏈，因此供體分子的熒光得以保存。該方法成功應用于自來水及雞蛋中鉛離子的檢測，有望用于食品重金屬污染的現(xiàn)場檢測分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

表1所示DNA序列均購于上海生工生物技術有限公司（中國上海），其中底物鏈GR-B為HPLC純化，并在5’端修飾了熒光猝滅基團BHQ1，其余序列均為PAGE純化。EvaGreen（20×），美國賽默飛公司；醋酸鉛標品，美國默克公司。氯化鈉、氯化鎂和4-羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES），阿法埃莎（中國）化學有限公司（中國上海）。Tris-HCl，成都金山化學試劑有限公司（中國成都）；醋酸錳，天津大茂化學試劑廠（中國天津）。氯化鈷、硝酸鉻、硫酸銅、硝酸鋁、氯化鎳、氯化鉀、硝酸和高氯酸，成都科龍化學試劑廠（中國成都）。50× TAE buffer、10000× Gel Red，北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。6× Loading buffer，北京擎科生物科技有限公司。瓊脂糖及25 bp-500 bp DNA marker，生工生物工程（上海）股份有限公司。實驗用水為分子級生物水，美國康寧公司。實驗所用儀器為多功能酶標儀Biotek Synergy H1（美國博騰）、電泳儀（北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司）、凝膠成像儀Gel Doc XR+System（美國伯樂）。

表1 核苷酸序列表Table 1 Nucleotide sequences

1.2 鉛離子檢測體系

40 μL鉛離子檢測體系包括4 μL 10× buffer（buffer組成為50 mmol/L HEPES，50 mmol/L氯化鈉，5 mmol/L氯化鎂，pH 7.26）、3 μL 4 μmol/L底物鏈、1 μL 4 μmol/L不同臂長的酶鏈、2 μL 20× EvaGreen、26 μL水及4 μL不同濃度的鉛離子?；旌暇鶆蚝罅⒓次?5 μL測定熒光值并計算信噪比。信噪比為實驗組熒光信號值與空白組熒光信號值的比值。

1.3 光譜分析與凝膠電泳分析

EvaGreen的激發(fā)波長為480 nm，發(fā)射波長范圍為510～650 nm，步幅為2 nm，最大發(fā)射波長為530 nm。電泳時上樣5 μL，電泳電壓為90 V，電泳時間為1 h。

1.4 實際樣品檢測

新鮮雞蛋及自來水樣品用于檢測該方法的可行性。新鮮雞蛋購自超市（中國成都），自來水樣品取自實驗室。雞蛋提前進行消化處理，取0.5 mL充分混勻的蛋液、10 mL 70%的硝酸和0.5 mL 70%的高氯酸于消化管中，置于消化爐上按以下程序進行消化：120 ℃ 1 h，180 ℃ 3 h，200 ℃ 1 h。用1 mol/L KOH將剩余溶液的pH值調節(jié)至7.0左右，最后用該溶液配制不同濃度的鉛離子溶液，置于4 ℃?zhèn)溆肹27]。

1.5 數據分析

每個樣品設三個平行組，測定結果以平均值±標準差表示。數據分析采用Prism 8.0，繪圖采用origin 8.0。

2 結果與討論

2.1 檢測原理

本文設計了一種檢測鉛離子的“Turn on”型傳感器，其原理如圖1所示。當底物鏈與酶鏈雜交時，形成的復合物具有部分雙鏈DNA的性質。EvaGreen染料是一種非特異識別雙鏈DNA的熒光分子，因此可以識別底物鏈與酶鏈的雜交復合物。由于底物鏈的5’端修飾有BHQ1熒光猝滅基團，當體系中沒有鉛離子時，BHQ1與EvaGreen處于鄰近狀態(tài)，此時在480 nm處激發(fā)時將產生FRET效應，供體為EvaGreen分子，受體為BHQ1基團。受BHQ1的影響，供體EvaGreen的熒光會有明顯的猝滅現(xiàn)象。當鉛離子存在時，酶鏈被激活，底物鏈被切割，降低了5’端底物鏈與酶鏈的雜交穩(wěn)定性[28]，并釋放5’端底物鏈。此時EvaGreen與BHQ1之間的距離增大，而FRET效應又與供體、受體分子之間的空間距離密切相關[29]，因此EvaGreen與BHQ1之間FRET效應減弱，EvaGreen的熒光得以保留，基于鉛離子誘導的FRET效應減弱可以靈敏地檢測體系中的鉛離子。在“Turn off”型傳感器中，當鉛離子存在時，EvaGreen的熒光僅略微減弱，且“Turn off”型傳感器容易產生假陽性和檢測靈敏度較低的問題。后續(xù)實驗將探究這兩種傳感器對鉛離子響應的靈敏程度。

2.2 原理驗證

為了驗證“Turn on”型傳感器及“Turn off”型傳感器對體系中鉛離子的響應靈敏度。在相同實驗條件下探究了其熒光變化程度。由圖2a可知，對“Turn off”型傳感器而言，當鉛離子存在時，EvaGreen的熒光略微下降，原因是鉛離子誘導了底物鏈的斷鏈，降低了5’端底物鏈與酶鏈的雜交穩(wěn)定性，而3’端底物鏈與酶鏈結合較為穩(wěn)定，所以EvaGreen的熒光對底物鏈的斷裂并不十分敏感，熒光值僅下降9.64%。對“Turn on”型傳感器而言，當鉛離子存在時，EvaGreen的熒光值有明顯升高現(xiàn)象，相較于空白組升高了116.37%，這是因為FRET效應的受體BHQ1對供體EvaGreen的熒光有良好的吸收作用。圖2b分別分析了“Turn on”型與“Turn off”型傳感器對鉛離子響應的顯著程度。結果可知“Turn off”型對鉛離子的響應并不靈敏，因此在同等條件下“Turn on”型傳感器更具有優(yōu)勢。

圖2c探究了鉛離子及底物鏈（GR-B）本身對EvaGreen熒光值的影響，由圖2a及圖2c中①④可知鉛離子可以誘導EvaGreen熒光值的顯著上升。因此首先探究鉛離子本身對EvaGreen熒光值的影響，如圖2c中②③所示，鉛離子本身并不能使EvaGreen的熒光值升高。同時探究了鉛離子本身對猝滅基團的影響，由圖2c中⑤⑥所示，GR-B的熒光很低，加入鉛離子后也不會導致熒光的改變。同時對比圖2c中②③與⑤⑥可以發(fā)現(xiàn)，BHQ1與EvaGreen之間的FRET效應可以顯著降低實驗背景，得到更準確的實驗結果。圖2d驗證了鉛離子對脫氧核酶的特異性識別及核酶對底物鏈的特異性切割作用，當底物鏈（泳道2）與酶鏈（泳道3）同時存在時，二者雜交產生了新的二聚物條帶（泳道4），當鉛離子存在時有了更短的片段產生（泳道5），說明鉛離子可以作為輔酶對底物鏈進行切割，釋放與酶鏈雜交不穩(wěn)定的5’端底物鏈。

2.3 實驗條件優(yōu)化

為了得到更好的實驗結果，分別對酶切反應時間、脫氧核酶的酶鏈臂長、EvaGreen濃度、底物鏈與酶鏈的比例進行了優(yōu)化（圖3）。反應時間直接決定了底物鏈與酶鏈之間形成的雜交復合物的量及EvaGreen嵌入雙鏈的多少，間接決定了FRET效應的強弱，因此首先對酶切時間進行了優(yōu)化。由圖3a可知，隨著反應時間的延長，實驗組與空白組的熒光值都有一定程度的升高，然而信噪比在加入鉛離子的一瞬間即達到最大值，這說明鉛離子的切割是高效的，并能及時釋放斷裂的5’端底物鏈，減弱FRET效應。接下來對酶鏈臂長（15 nt-X nt）進行了優(yōu)化，過長的臂長將影響斷裂的底物鏈從酶鏈上分離，過短將影響核酶的切割活性。由圖3b可知，隨著酶鏈5’端的延長，實驗組與背景組的熒光強度都有顯著升高，當酶鏈臂長為15 nt～5 nt時，有最大信噪比。EvaGreen濃度優(yōu)化的實驗結果如圖3c所示，隨著EvaGreen濃度的增加，背景與信號的熒光值都有顯著增加，當濃度為1×時，信噪比逐漸趨于穩(wěn)定并達到最大值。最后對底物鏈及酶鏈的比例進行了優(yōu)化，由圖3d可知，當酶鏈濃度與底物鏈濃度分別為400 nmol/L與100 nmol/L時，有最大信噪比。因此后續(xù)實驗將采用15 nt～5 nt的酶鏈（GR15-5）、1×的EvaGreen、400 nmol/L的酶鏈與100 nmol/L的底物鏈并在室溫條件下混勻后立即進行熒光檢測。 濃度依次為800、100 nmol/L；600、100 nmol/L；400、100 nmol/L；200、100 nmol/L；100、100 nmol/L；100、200 nmol/L；100、400 nmol/L。

2.4 鉛離子定量分析

在優(yōu)化的實驗條件基礎上，探究鉛離子濃度與熒光信號之間的關系。由圖4a可知，隨著鉛離子的增加（0、0.1、1、10、30、50、100、500、1000、2000 nmol/L），EvaGreen的熒光值逐漸升高，這是因為鉛離子的增加加速了底物鏈的切割。鉛離子與熒光信號之間的線性關系如圖4b所示，在0 nmol/L到50 nmol/L鉛離子濃度范圍內，鉛離子濃度與熒光強度之間擬合得到標準曲線為y=86.98x+3097.90（R2=0.997），其中y代表加入鉛離子后EvaGreen的熒光強度，x代表對應的鉛離子濃度。根據36原則計算得到檢出限（LOD）為5.80 nmol/L。同時，在相同實驗條件下，對“Turn off”型傳感器的靈敏度進行了探究，結果表明在沒有足夠的酶切時間條件下，幾乎沒有熒光變化，因此在與“Turn on”型同等實驗條件下無法做出有效的關系曲線（數據并沒有展示）。食品的原產地不同，不同食品原料中的鉛離子含量大有不同，不同的食品原料在生長過程中對鉛離子的富集能力不同。因此該方法有望用于多種不同產地的不同食品中的鉛離子污染檢測。

2.5 選擇性實驗

食品原料組成復雜，有的本身就富含金屬離子。為了驗證本方法對鉛離子的選擇性，分別取10、50、500 nmol/L的鉛離子、鎘離子、鎳離子、鈷離子、鋁離子、錳離子和銅離子用于分析選擇性。由圖5可知，除了鉛離子有明顯信號響應之外，其它金屬離子的熒光信號在不同濃度梯度的范圍內變化不大，這是由于只有鉛離子能作為酶鏈的輔酶因子激活其活性，其它的金屬離子并無此作用。脫氧核酶對鉛離子的高度選擇性保證了本實驗設計的高度特異性。因此本方法有望用于復雜的食品樣品中的鉛離子檢測，并得到較為準確的結果。

2.6 實際樣品檢測

雞蛋是常見的食品原料，環(huán)境中的鉛離子容易以禽類為媒介富集到雞蛋中。同時飲水也是人體攝入鉛離子的主要形式之一。為了驗證本設計有一定的應用可能性，選擇新鮮雞蛋及自來水為樣品，分別配置30、40、50 nmol/L的實際樣品待檢液用于檢測，結果如圖6所示?？梢园l(fā)現(xiàn)該方法有良好的回收率（86.79%～ 113.32%），其中雞蛋與自來水檢測結果的差異可能是由于它們本身的特性決定的，因此該方法有望用于實際樣品的現(xiàn)場檢測。同時本文比較了不同基于核酶的鉛離子檢測方法，結果如表2所示。

表2 基于核酶的鉛離子檢測方法Table 2 DNAzyme-based Pb2+ detection methods

3 結論

本文構建了一種基于脫氧核酶和FRET效應的鉛離子快速檢測方法，該方法操作簡單，具有高度的選擇性并成功應用于復雜的實際樣品檢測。相比之前的核酸探針檢測方法，該方法原理簡單，反應靈敏，與便攜式熒光計結合有望用于現(xiàn)場監(jiān)測不同復雜樣品中的鉛污染，同時該方法也為設計其它金屬離子檢測傳感器提供了思路。