FNAC聯(lián)合BRAF V600E基因突變檢測(cè)在甲狀腺乳頭狀癌診斷中的作用及臨床意義

趙麗輝 孫世珺★ 易冰 曾玉梅

甲狀腺癌是內(nèi)分泌器官最常見(jiàn)的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增高，不同組織學(xué)類(lèi)型和亞型的甲狀腺癌具有不同的細(xì)胞來(lái)源、腫瘤特征和預(yù)后。其中甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）最常見(jiàn)，約占甲狀腺癌的85%～90%［1-2］。BRAF基因在多種惡性腫瘤中發(fā)生突變，研究證實(shí)，V600E 是BRAF突變最常見(jiàn)的突變位點(diǎn)，在PTC 中BRAFV600E 突變的發(fā)生率為40%～80%［3-5］。研究顯示BRAFV600E 與PTC 不良臨床病理結(jié)果有很強(qiáng)的相關(guān)性，如復(fù)發(fā)增加［6］、對(duì)放射性碘的攝取減弱及治療失敗等［7-8］。PTC 原發(fā)灶的BRAFV600E 基因突變與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移灶的攝碘能力下降有關(guān)［9］。甲狀腺細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)檢查（fine needle aspiration cytology，F(xiàn)NAC）可在術(shù)前明確甲狀腺結(jié)節(jié)性質(zhì)，為甲狀腺疾病個(gè)體化精準(zhǔn)治療提供依據(jù)，是甲狀腺診治決策的關(guān)鍵，近幾年在廣東省甲狀腺腫瘤患者診斷中的運(yùn)用較為廣泛。本研究探討B(tài)RAF基因突變?cè)赑TC早期診斷、治療策略選擇及預(yù)后判斷中的意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

分析自2017年11月至2020年10月于中山市人民醫(yī)院就診的甲狀腺結(jié)節(jié)患者601 例，均在B 超引導(dǎo)下行細(xì)針穿刺（FNA），穿刺新鮮細(xì)胞液給予細(xì)胞學(xué)診斷及BRAF基因檢測(cè)，檢測(cè)后保守治療344 例，手術(shù)治療257 例，手術(shù)后病理結(jié)果確診為惡性腫瘤212例，其中PTC 患者208 例，男性44 例，女性164 例，年齡平均（42.03±10.21）歲，甲狀腺濾泡性癌患者2 例，甲狀腺髓樣癌2例。良性病變45例，其中結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40 例，濾泡腺瘤2 例，橋本甲狀腺炎2 例，透明變梁狀腫瘤1 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前有彩超記錄且評(píng)估結(jié)節(jié)為可疑惡性（TI-RAS 分類(lèi)4 類(lèi)及以上結(jié)節(jié)）；②術(shù)前行FNA 及穿刺液BRAF基因檢測(cè)；③行甲狀腺手術(shù)治療；④術(shù)后病理明確。排除標(biāo)準(zhǔn)：①多次手術(shù)患者；②非本院行FNA 及BRAF基因檢測(cè)；③病歷資料不完整。所有患者穿刺及術(shù)前均簽署知情同意書(shū)。本研究經(jīng)過(guò)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

1.2 試劑和方法

601 例甲狀腺結(jié)節(jié)患者均行BRAFV600E 基因檢測(cè)，檢測(cè)試劑為人類(lèi)BRAF基因V600E 突變檢測(cè)試劑盒（廠家：廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司；批號(hào)：11220070701X；規(guī)格：24 人份/盒），用于BRAF基因V600E 體細(xì)胞突變（即1799T＞A）檢測(cè)。PCR 使用擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（amplification refractory mutation system，ARMS）法，RT-PCR 儀為上海宏石熒光定量PCR 儀（規(guī)格型號(hào)：SLAN-96S）。臨床醫(yī)師在超聲引導(dǎo)下，定位穿刺結(jié)節(jié)，用細(xì)針準(zhǔn)確進(jìn)行穿刺后，將穿刺出的新鮮細(xì)胞液一針注入液基保存瓶編號(hào)標(biāo)記后送往病理科進(jìn)行液基細(xì)胞學(xué)診斷，另一針注入預(yù)裝有200 μL DTL 裂解液的1.5 mL 離心管中，編號(hào)標(biāo)記后送往分子診斷中心進(jìn)行BRAF基因檢測(cè)。標(biāo)本保存在4℃，不超過(guò)72 h。核酸提取采用FFPE DNA 核酸提取試劑（廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司），并使用超微量紫外分光光度儀進(jìn)行質(zhì)控及濃度測(cè)定。PCR 上機(jī)時(shí)將樣品濃度稀釋至1 μg/L，濃度不足1 μg/L 的標(biāo)本，DNA 按原濃度上機(jī)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，行卡方檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)后患者BRAF V600E 基因突變情況

257 例患者中，術(shù)后病理結(jié)果確診為PTC 208例，BRAFV600E 基因突變型137 例，突變率為65.87%（137/208），野生型71 例，占34.13（71/208），甲狀腺其他類(lèi)型癌（甲狀腺濾泡癌2 例，甲狀腺髓樣癌2 例）及甲狀腺良性病變（結(jié)節(jié)性甲狀腺腫40 例，濾泡腺瘤2 例，橋本甲狀腺炎2 例，透明變梁狀腫瘤1 例）均未檢測(cè)到BRAFV600E 基因突變，甲狀腺結(jié)節(jié)中，PTC 與其它癌變及良性病變BRAFV600E 基因突變比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

表1 甲狀腺結(jié)節(jié)術(shù)后患者BRAF 基因突變的比較［n（%）］Table 1 Comparison of BRAF gene mutations in patients after thyroid nodule surgery［n（%）］

2.2 BRAF V600E 基因檢測(cè)與液基細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果

術(shù)后病理結(jié)果確診為惡性腫瘤的212 例中，BRAFV600E 基因突變陽(yáng)性208 例（均為PTC），突變陰性4 例；術(shù)前FNAC 細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為惡性腫瘤108 例，可疑惡性腫瘤76 例，濾泡性腫瘤2 例，非典型病變21 例，良性病變4 例，無(wú)法診斷1 例，病理結(jié)果為甲狀腺良性病變45 例，均為BRAFV600E 陰性，術(shù)前FNAC 細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果可疑惡性腫瘤19例，濾泡性腫瘤1 例，非典型病變11 例，良性病變12 例，無(wú)法診斷2 例。在病理確診的212 例甲狀腺癌中，F(xiàn)NAC 診斷為惡性腫瘤108 例，敏感性50.94%（108/212）；BRAFV600E 基因檢測(cè)突變陽(yáng)性137 例，敏 感 性64.62%（137/212），F(xiàn)NAC+BRAFV600E 兩種診斷方法聯(lián)合檢測(cè)敏感性83.02%（176/212），聯(lián)合檢測(cè)使診斷的檢出率明顯提高。見(jiàn)表2。

表2 BRAF V600E基因檢測(cè)與液基細(xì)胞學(xué)（FNAC）診斷結(jié)果Table 2 BRAF V600E gene testing and fluid based cytology（FNAC）diagnosis results

2.3 甲狀腺乳頭狀癌BRAF V600E 基因突變狀態(tài)與患者臨床病理特征的關(guān)系

PTC 伴有鈣化灶患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于PTC 不伴有鈣化灶患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PTC 不伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于PTC 伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），腫瘤最大直徑＜1.0 cm 的PTC 患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于最大直徑≥1.0 cm 的PTC 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期的PTC 患者BRAFV600E 基因突變率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期的PTC 患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表3 甲狀腺乳頭狀癌BRAF 基因突變與臨床病理特征的關(guān)系［n（%）］Table 3 Relationship between BRAF gene mutation and clinicopathological features in papillary thyroid carcinoma［n（%）］

3 討論

超聲引導(dǎo)下的細(xì)針穿刺（fine-needle aspiration，F(xiàn)NA）是甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性甄別的首選方法［10］，2017 版Bethesda 系統(tǒng)（TBSRTC），將甲狀腺細(xì)針穿刺后的病理學(xué)結(jié)果分為六類(lèi)，并對(duì)每種分類(lèi)提供了惡性風(fēng)險(xiǎn)判斷與臨床處理原則［11］。但細(xì)胞形態(tài)學(xué)的觀察范圍有限，仍有占比較大的Ⅲ至Ⅴ類(lèi)結(jié)果不能定性。中國(guó)甲狀腺癌診療規(guī)范（2018年版）認(rèn)為，經(jīng)FNA 不能確定良惡性的甲狀腺結(jié)節(jié)，可對(duì)穿刺標(biāo)本進(jìn)行某些甲狀腺癌的分子標(biāo)記物檢測(cè)［10］BRAF基因是RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK信號(hào)通路最為關(guān)鍵的激活因子，參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和凋亡等［12］。BRAF突變主要有兩種類(lèi)型：發(fā)生于exon11 上的甘氨酸環(huán)，如G463、G465、G468等的點(diǎn)突變；發(fā)生在Exon15激活區(qū)，其中約90%位于第1 799 核苷酸上，T突變?yōu)锳（T1799A），導(dǎo)致其編碼的纈氨酸由谷氨酸取代。BRAFV600E 突變檢測(cè)在甲狀腺術(shù)前治療決策的影響不容忽視，突變狀態(tài)不僅可以提高細(xì)胞學(xué)惡性結(jié)節(jié)的診斷率，也為難治性甲狀腺癌的靶向藥物BRAFV600E 抑制劑（如威羅菲尼）治療提供病理依據(jù)［13］。研究顯示，BRAF基因在PTC 中的突變率可達(dá)60%～80%，在亞洲人群中，BRAF突變率甚至更高，BRAF在FTC 中較少突變，在良性結(jié)節(jié)罕見(jiàn)突變［14］。術(shù)前檢測(cè)BRAFV600E突變狀況，有助于PTC 的診斷和臨床預(yù)后預(yù)測(cè)，便于制定個(gè)體化的診治方案［10］。

本研究結(jié)果與既往研究報(bào)道數(shù)據(jù)基本相符，提示BRAFV600E 基因突變與PTC 密切相關(guān)。

Brown 等［15］研究認(rèn)為，BRAF 基因檢測(cè)聯(lián)合FNA 細(xì)胞學(xué)檢查大幅提高了穿刺的敏感度。本研究結(jié)果顯示聯(lián)合檢測(cè)使診斷的敏感性由50.94%提高到83.02%，明顯提高了甲狀腺惡性結(jié)節(jié)的檢出率，因此，聯(lián)合FNAC 及BRAFV600E 基因突變檢測(cè)有助于PTC 的早期診斷。研究報(bào)道，BRAF基因突變假陽(yáng)性非常低，F(xiàn)NA 細(xì)胞標(biāo)本伴BRAF 突變可以高度懷疑惡性結(jié)節(jié)［10］。在本次研究中，發(fā)現(xiàn)一例患者BRAFV600E 基因突變陽(yáng)性，但術(shù)后病理結(jié)果為結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，經(jīng)再次廣泛取材，重新病檢結(jié)果為甲狀腺微小乳頭狀癌。因此，BRAFV600E 基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)病理組織漏檢也有一定幫助。

Changlin Li 的最新報(bào)道證實(shí)，腫瘤組織鈣化與PTC 的侵襲性呈正相關(guān)［16］。本研究結(jié)果提示BRAF基因突變更易發(fā)生在腫瘤直徑小于1cm 的PTC 中，在伴有鈣化、不伴結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的甲狀腺乳頭狀癌BRAFV600E 基因突變率較高。慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎（chroniclymphocytic thyroiditis，CLT）又稱(chēng)伴橋本氏甲狀腺炎，是原發(fā)性甲狀腺功能減退癥最主要的原因。Ju-Han Lee 等［17］基于10648 例PTC 患者的薈萃分析顯示，PTC 與CLT 顯著相關(guān)，CLT 的合并率為23.2%，比合并良性甲狀腺結(jié)節(jié)性疾病高2.8 倍。本研究中，甲狀腺乳頭狀癌合并CLT 的比例為11.5%，低于文獻(xiàn)報(bào)道，但在兩組間BRAF基因突變率無(wú)明顯差異。因此，PTC 患者BRAFV600E 基因突變狀態(tài)與是否伴有鈣化灶、是否伴有結(jié)節(jié)性甲狀腺腫及腫瘤最大徑、TNM 分期相關(guān)，在伴有鈣化、腫瘤最大徑小于1.0 cm、不伴結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的甲狀腺乳頭狀癌中BRAFV600E 基因突變率較高。BRAFV600E 基因突變狀態(tài)與PTC 患者年齡、性別、病理亞型、腫瘤穿刺部位、慢性淋巴細(xì)胞性甲狀腺炎等無(wú)明顯相關(guān)。

綜上所述，本組研究中山市地區(qū)甲狀腺癌患者BRAFV600E 基因突變主要發(fā)生在甲狀腺乳頭狀癌患者中，其它組織學(xué)類(lèi)型的甲狀腺癌BRAFV600E 基因突變率較低，PTC 患者女性發(fā)病率高于男性。BRAFV600E 基因突變更易發(fā)生在腫瘤直徑小于1 cm 的PTC 中，在伴有鈣化灶、不伴結(jié)節(jié)性甲狀腺腫、臨床分期較高的PTC 中BRAF基因突變率越高，預(yù)后越差。BRAFV600E 基因檢測(cè)結(jié)果對(duì)防止病理組織漏檢也有一定幫助，尤其是微小癌。聯(lián)合FNAC 及BRAF基因的檢測(cè)有助于PTC 的早期發(fā)現(xiàn)、早期診治和預(yù)后判斷。