卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC及FS與PCOS患者卵泡發(fā)育的關(guān)系

劉建梅

多囊卵巢綜合征（Polycystic Ovary Syndrome，PCOS）的發(fā)生，能夠?qū)е禄颊吒咝奂に匮Y的發(fā)生，增加了患者繼發(fā)性不孕的發(fā)生風(fēng)險［1］。流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，PCOS 的發(fā)病率可超過485/1 萬人左右，同時在肥胖或者相關(guān)家族史的人群中，PCOS的發(fā)病率可進(jìn)一步的上升［2-3］。卵泡發(fā)育的障礙，在影響到PCOS 的病情進(jìn)展過程中具有核心的作用。不同的細(xì)胞因子，均能夠影響到卵泡細(xì)胞的募集和成熟。干細(xì)胞因子（Stem cell factor，SCF）的表達(dá)上升，能夠提高卵泡上皮細(xì)胞的分化成熟能力，提高卵泡細(xì)胞的定向誘導(dǎo)成熟程度［4］；生長分化因子-9（Growth differentiation factor-9，GDF-9）的表達(dá)，能夠通過提高卵泡細(xì)胞的核基因轉(zhuǎn)錄激活程度，提高優(yōu)勢卵泡的發(fā)育成熟速度［5］；激活素（Activin，ACTA）能夠通過提高顆粒細(xì)胞或者卵泡細(xì)胞膜表面的雌激素受體的敏感性，進(jìn)而參與到PCOS 的病情進(jìn)展過程［6］；卵泡抑素（Follistatin，F(xiàn)S）能夠通過抑制卵泡細(xì)胞DNA 的擴增，降低卵泡細(xì)胞的富集過程，進(jìn)而干預(yù)到卵泡的發(fā)育［7］。為了揭示GDF-9、SCF、ACTA 及FS 的表達(dá)與PCOS患者卵泡發(fā)育的關(guān)系，從而為臨床上PCOS 患者的病情評估提供參考，本次研究選取實施體外受精治療的PCOS 患者42 例，探討了卵泡液體中相關(guān)因子的表達(dá)，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取林州市人民醫(yī)院2017年1月至2021年4月實施體外受精治療的PCOS 患者42 例（PCOS組），年齡平均（29.5±2.8）歲，病程（3.9±1.5）年，體質(zhì)量指數(shù)（Body mass index，BMI）（24.2±2.0）kg/m2、正常排卵婦女42 例作為對照組，年齡平均（29.3±3.0）歲，BMI（24.0±2.2）kg/m2。兩組研究對象的年齡、BMI 比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①PCOS 的診斷標(biāo)準(zhǔn)參考中華醫(yī)學(xué)會制定的標(biāo)準(zhǔn)［8］；②PCOS 患者主要表現(xiàn)為無排卵、稀發(fā)排卵、高雄激素血癥；③超聲檢查發(fā)現(xiàn)一側(cè)卵巢中2～9 mm 的小卵泡個數(shù)≥12 個和（或）一側(cè)卵巢體積≥10cm3；④對照組為正常排卵的婦女；⑤本研究經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)（倫研批［2016］第14 號），所有入試者均知情并簽署同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有全身感染性疾病；②惡性腫瘤；③具有放化療病史、免疫治療病史；④伴有垂體、腎上腺、甲狀腺等其他內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。

1.2 指標(biāo)檢測方法

檢測兩組的卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平、血清中促卵泡生成素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）、雌激素（Estrogen，E2）、黃體生成素（Luteinizing hormone，LH）、孕酮（progesterone，P），并對比兩組的卵母細(xì)胞體外成熟（M Ⅱ期）率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率差異。

在超促排卵后，在超聲引導(dǎo)下進(jìn)行卵泡的穿刺取卵。穿刺取卵的過程中留取一個純卵泡液，3～5 mL，1 500 r/min 離心15 min（離心半徑13 cm）收集上清液。采用貝克曼庫爾特公司生產(chǎn)的DX800 免疫發(fā)光儀器及配套試劑進(jìn)行FS 檢測，采用電化學(xué)發(fā)光法檢測FSH、E2、LH、P 等性激素的檢測，室內(nèi)質(zhì)量控制符合標(biāo)準(zhǔn)。

在每個聚苯乙烯板中加入上述液體0.1 mL，4℃過夜孵育，加入磷酸鹽緩沖液（Phosphate buffer，PBS）洗滌3 次，每次3 min，在每個聚苯乙烯板孔中加入GDF-9、SCF、ACTC 抗體（1∶800 購自南京伯斯金生物公司），37℃孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌3 次，每次3 min，每孔中加入TMB 溶液底物0.1mL，37℃20 min，加入2M 硫酸0.05 mL 終止反應(yīng)，采用DG5033A 酶標(biāo)儀（南京華東電子科技公司）進(jìn)行OD 值檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0 軟件版本進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。本研究中符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)表述采用（±s）表示，兩組間比較采用兩組獨立樣本的t 檢驗；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，。

2 結(jié)果

2.1 兩組卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比較

PCOS 組患者的卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PCOS 組患者的卵泡液中的FS 水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比較（±s）Table 1 Comparison of GDF-9，SCF，ACTC and FS levels in follicular fluid of two groups of subjects（±s）

表1 兩組卵泡液中的GDF-9、SCF、ACTC 及FS 水平比較（±s）Table 1 Comparison of GDF-9，SCF，ACTC and FS levels in follicular fluid of two groups of subjects（±s）

組別PCOS 組對照組t 值P 值n 42 42 GDF-9（ng/L）126.4±11.0 138.2±13.9-4.314 0.000 SCF（ng/L）21.1±4.8 23.6±4.2-2.540 0.013 ACTC（pg/mL）67.8±8.5 115.8±24.8-11.866 0.000 FS（pg/mL）1.35±0.22 1.04±0.45 4.011 0.000

2.2 兩組研究對象的血清生殖激素水平比較

PCOS 組患者的血清中LH 水平顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；PCOS 組患者的血清中FSH、E2、P 水平與對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 兩組研究對象的血清生殖激素水平比較（±s，mU/mL）Table 2 Comparison of serum reproductive hormone levels in two groups of subjects（±s，mU/mL）

表2 兩組研究對象的血清生殖激素水平比較（±s，mU/mL）Table 2 Comparison of serum reproductive hormone levels in two groups of subjects（±s，mU/mL）

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2.3 兩組研究對象的卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較

PCOS 組患者的卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組研究對象的卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較（±s）Table 3 Comparison of oocyte MⅡrate，normal fertilization rate and high-quality embryo rate between two groups of subjects（±s）

表3 兩組研究對象的卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率比較（±s）Table 3 Comparison of oocyte MⅡrate，normal fertilization rate and high-quality embryo rate between two groups of subjects（±s）

組別PCOS 組對照組t 值P 值n 42 42卵母細(xì)胞MⅡ率（%）71.9±6.8 84.8±8.0-7.962 0.000正常受精率（%）64.9±5.2 73.3±7.0-6.243 0.000優(yōu)質(zhì)胚胎率（%）40.8±14.8 60.7±18.0-5.534 0.000

3 討論

家族性的遺傳易感基因的攜帶，雌激素受體敏感性的改變，均能夠促進(jìn)PCOS 的發(fā)生，增加遠(yuǎn)期妊娠結(jié)局的惡化風(fēng)險［9］。特別是在體重指數(shù)大于28 的人群中，PCOS 的發(fā)病率可進(jìn)一步的上升，其體內(nèi)胰島素抵抗、高雄激素血癥的表現(xiàn)更為明顯［10］。卵泡成熟程度或者優(yōu)勢卵泡的形成，能夠在PCOS 的治療過程中發(fā)揮作用，且能夠在提高胚胎移植、增加宮內(nèi)妊娠成功率等方面發(fā)揮作用［11］。但迄今為止臨床上缺乏對于PCOS 患者卵泡發(fā)育成熟調(diào)控的相關(guān)機制研究，本次研究通過對于PCOS患者卵泡液中GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的分析研究，不僅能夠揭示PCOS 卵泡發(fā)育障礙的原因，同時還能夠為臨床上PCOS 患者卵泡定向誘導(dǎo)成熟、胚胎移植成功率的提升提供理論基礎(chǔ)。

GDF-9 是分化誘導(dǎo)因子，其能夠通過誘導(dǎo)卵泡膜細(xì)胞及其細(xì)胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞器的組裝，提高卵泡細(xì)胞的成熟能力和內(nèi)分泌功能。GDF-9 不僅能夠影響到卵泡細(xì)胞的結(jié)構(gòu)的發(fā)育成熟，同時還能夠提高卵泡細(xì)胞內(nèi)性激素囊泡轉(zhuǎn)運機制的成熟，穩(wěn)定性激素的分泌過程；SCF 是干細(xì)胞分化調(diào)控因子，其能夠提高卵泡細(xì)胞核DNA 持續(xù)性自我增殖過程，提高損傷DNA 的損傷，改善卵泡細(xì)胞的無氧糖酵解及有氧氧化的能力；ACTC 的表達(dá)，能夠通過激活卵泡細(xì)胞的旁分泌和內(nèi)分泌的功能，提高相關(guān)卵泡細(xì)胞對于促性腺激素的敏感性，從而參與到卵泡生理功能的維持過程中；FS 作為抵抗素家族成員，其對于卵泡細(xì)胞內(nèi)的c-kit 信號通路的拮抗作用，能夠降低卵泡細(xì)胞對于卵泡雌激素（FSH）的敏感性，導(dǎo)致其發(fā)育障礙［12］。部分研究者探討了SCF 的表達(dá)與PCOS 的關(guān)系，認(rèn)為SCF的表達(dá)下降是PCOS 發(fā)生的危險性因素［4］，但對于GDF-9、ACTC 及FS 的分析研究不足。

本次研究可以發(fā)現(xiàn)，在PCOS 患者卵泡液體中，GDF-9、SCF、ACTC 的表的濃度明顯的下降，而FS 的表達(dá)濃度明顯的上升，提示了GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的差異性表達(dá)，推測相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)均影響到了PCOS 卵泡的發(fā)育過程。深入探討GDF-9、SCF、ACTC 及FS 的表達(dá)對于PCOS 病情的影響，考慮由于其對于卵泡顆粒細(xì)胞或者膜細(xì)胞的下列影響有關(guān)［13-14］：①GDF-9 的下降影響到了卵泡膜細(xì)胞細(xì)胞壁及細(xì)胞內(nèi)囊泡結(jié)構(gòu)的成熟，導(dǎo)致優(yōu)勢卵泡形成障礙；②SCF、ACTC 的表達(dá)下降，不僅能夠影響到優(yōu)勢卵泡的形成，同時還能夠?qū)е侣雅莅l(fā)育停滯，并影響到原始卵泡向初級卵泡的轉(zhuǎn)換；③FS 的表達(dá)上升，能夠阻斷下游c-kit信號通路，導(dǎo)致下游信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙，進(jìn)而抑制了卵泡的發(fā)育成熟。余雁等［15］研究者也發(fā)現(xiàn)，在PCOS 患者中，GDF-9 的表達(dá)濃度可下降35%～55%，特別是在PCOS 病程較長或者性激素紊亂較為明顯的患者中，GDF-9 的表達(dá)濃度下降更為明顯。PCOS 組患者的血清中黃體生成素（LH）水平顯著的低于對照組，差異較為明顯，提示了PCOS患者卵泡液體中存在明顯的LH 的分泌障礙，LH高峰的形成異常能夠?qū)е虏煌A段卵泡轉(zhuǎn)化和成熟的異常，進(jìn)而加劇PCOS 的病情進(jìn)展程度。PCOS 組患者，其卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率顯著的低于對照組，提示了PCOS 組臨床結(jié)局的惡化，這主要由于GDF-9、SCF、ACTC 的表達(dá)異常，導(dǎo)致卵泡結(jié)構(gòu)和數(shù)量的異常，導(dǎo)致優(yōu)勢卵泡生理功能的喪失，進(jìn)而干預(yù)到其妊娠結(jié)局。

綜上所述，在PCOS 患者卵泡液體中，GDF-9、SCF、ACTC 的表達(dá)明顯下降，而FS 的表達(dá)明顯上升，同時PCOS 患者的卵母細(xì)胞MⅡ率、正常受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率明顯下降。本次研究與國內(nèi)外相關(guān)研究的創(chuàng)新之處在于探討了卵泡液體中GDF-9、SCF、ACTC 的表達(dá)，而非血清中GDF-9、SCF、ACTC 的表達(dá)，相同之處在于探討了生殖性激素水平的變化。