Nugent評分方法技術(shù)改良及在細(xì)菌性陰道病診斷中的應(yīng)用評價(jià)

牛婧 李嬌 李娜 孫婧 張靜 王亞文

細(xì)菌性陰道?。˙acterial vaginosis，BV）是由加德納菌、厭氧菌等增多，乳酸桿菌減少，陰道生態(tài)系統(tǒng)改變而引起的陰道感染性疾病［1］。BV 是育齡期女性中最常見的陰道感染性疾病之一［2］，有研究表明其感染率在20%～60%［3］，且BV 患者中約50%無臨床癥狀表現(xiàn)［4］。BV 可誘發(fā)多種婦科疾病，如尿道炎、其他類型的陰道炎、子宮內(nèi)膜炎、婦科腫瘤［5］，也可導(dǎo)致多種產(chǎn)科疾病，如早產(chǎn)、羊膜炎、羊水感染、絨毛膜炎、新生兒感染等［6-7］。另外由于BV 與其他性傳播疾病，如人類免疫缺陷病毒、單傳皰疹病毒Ⅱ型、沙眼衣原體和淋病奈瑟菌的感染有關(guān)［8-9］，BV 已成為全球關(guān)注的主要問題。因此，對BV 早診斷、早治療對女性生殖道健康具有非常重要的意義。在診斷BV 的實(shí)驗(yàn)室方法中以Nugent 革蘭染色評分方法作為診斷和療效觀察的金標(biāo)準(zhǔn)［10］。但Nugent 評分方法缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分析前條件，傳統(tǒng)方法為使用無菌陰道窺器暴露陰道，使用無菌棉拭子拭取陰道內(nèi)側(cè)分泌物從左至右在載玻片上涂片后送檢。因?yàn)椴煌牟僮髡咴陉幍婪置谖锏牟蓸恿?、均勻性和涂布厚度均沒有質(zhì)量控制，在沒有涂片標(biāo)準(zhǔn)要求下的采樣結(jié)果其差異非常大，嚴(yán)重影響了診斷其結(jié)果的一致性和準(zhǔn)確性［11］。因此，本研究旨在建立Nugent 評分前的樣本采集與涂布的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量規(guī)范，以提高BV 診斷的準(zhǔn)確性，并對改良方法進(jìn)行評價(jià)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

隨機(jī)選取2018年5月至2018年8月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦科門診就診的10 例女性作為研究對象進(jìn)行改良方法的建立實(shí)驗(yàn)，233 例研究對象進(jìn)行改良方法和傳統(tǒng)方法的比較和評價(jià)實(shí)驗(yàn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合陰道微生態(tài)評價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識［12］；②就診24 h 內(nèi)無性生活史、陰道上藥史、陰道灌洗史；③對本研究簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①月經(jīng)期婦女；②合并精神疾病，不能判斷自身癥狀者。本研究經(jīng)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 儀器與試劑

分析天平（生產(chǎn)廠家：賽多利思；型號：BSA224S-SW；精密度0.000 1 g）、顯微鏡（生產(chǎn)廠家：奧林巴斯；型號：C31）、革蘭氏染色液（生產(chǎn)廠家：珠海貝索生物技術(shù)有限公司；批號：C210801；規(guī)格：龍膽紫液×250 mL、碘溶液×250 mL、脫色液×250 mL、沙黃溶液×250 mL）、量勺、一次性無菌棉拭子、載玻片、涂布棒。

1.3 Nugent 評分方法分析前技術(shù)改良方法的建立與評價(jià)

1.3.1 涂片范圍的設(shè)計(jì)

在（76×26）mm 的載玻片上分別選擇（10×10，20×20，20×30）mm，設(shè)計(jì)涂片范圍，并用劃線筆進(jìn)行確定，選擇涂片面積大小易于涂布操作及鏡下觀察。

1.3.2 陰道分泌物取樣量的設(shè)計(jì)

①選取10 位患者，由醫(yī)生取足量的陰道分泌物，分別使用預(yù)制量勺取樣稱重，取樣量分別為半勺、一平勺、兩平勺，每個樣本同一體積取樣三次，分別使用分析天平進(jìn)行稱重，計(jì)算均數(shù)（X）、標(biāo)準(zhǔn)差（SD）和變異系數(shù)（CV），測算取樣最佳重量。②使用涂布棒，分別將這30 個樣本按三種體積、三種面積，在載玻片上進(jìn)行均勻涂片。③將這30 個樣本進(jìn)行革蘭染色后在顯微鏡油鏡下進(jìn)行觀察，認(rèn)為鏡下細(xì)菌分布均勻無聚集時(shí)為涂片薄厚合適，選擇薄厚合適的取樣量作為改良方法的陰道分泌物取樣量。

1.4 改良方法與傳統(tǒng)方法的比較

1.4.1 比較結(jié)果判讀方法

233 例研究對象分別使用傳統(tǒng)方法（將陰道分泌物從左至右進(jìn)行涂片）及改良方法（采用標(biāo)準(zhǔn)的涂片量及標(biāo)準(zhǔn)的涂片范圍進(jìn)行涂片），鏡下分別觀察菌群密集度、多樣性、Nugent 評分結(jié)果及BV 診斷結(jié)果并記錄，比較兩組結(jié)果的差異性。分別對傳統(tǒng)方法和改良方法的菌群密集度和菌群多樣性的鏡檢結(jié)果進(jìn)行數(shù)值化，以“+”為1、“++”為2、“+++”為3、“++++”為4 進(jìn)行量化值計(jì)算，對兩種方法的BV 診斷結(jié)果進(jìn)行數(shù)值化，以“BV 陰性”為0，“中間型BV”為1，“BV 陽性”為2 進(jìn)行量化值計(jì)算，分別計(jì)算同一患者樣本采用兩種方法檢測結(jié)果的差異，差異結(jié)果為傳統(tǒng)方法量化值減去改良方法量化值，差異≠0 即為有差異，差異率為（差值≠0 的樣本例數(shù)/總檢測例數(shù)）×100%。兩種方法的Nugent 評分差異結(jié)果為傳統(tǒng)方法的評分減去改良方法的評分，差異≠0 即為有差異，差異率為（差值≠0 的樣本例數(shù)/總檢測例數(shù)）×100%［12］。

1.4.2 染色結(jié)果判讀方法

按照2016年中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科分會發(fā)布的陰道微生態(tài)評價(jià)的臨床應(yīng)用專家共識［12］及2021年細(xì)菌性陰道病診治指南［13］中革蘭染色Nugent 評分標(biāo)準(zhǔn)，對菌群密集度、多樣性進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化評價(jià)以及BV的診斷。Nugent 評分以BV 陽性（細(xì)菌性陰道病）：≥7 分；中間型BV：4～6 分；BV 陰性（正常）：0～3 分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；計(jì)數(shù)資料以n（%）描述，方法間進(jìn)行配對卡方檢驗(yàn)；方法評價(jià)采用受試者工作特征（ROC）曲線；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 改良方法建立結(jié)果

涂片范圍為20 mm×20 mm 時(shí)涂片面積大小合適，易于涂布以及鏡下觀察，最終涂片范圍選擇20 mm×20 mm 的面積進(jìn)行定量涂布。陰道分泌物在20 mm×20 mm 范圍內(nèi)均勻涂片，半勺取樣量鏡下菌量較少稀薄，菌群分步少，易漏診和錯誤判讀，見圖1A；二平勺取樣量鏡下菌群聚集成團(tuán)，不易于觀察計(jì)數(shù)，見圖1C；一平勺取樣量鏡下菌群分布均勻，無聚集成團(tuán)的現(xiàn)象，見圖1B；最終選擇分泌物取樣量一平勺，即0.01 g。改良方案最終確定為：取0.01 g陰道分泌物，在載玻片上20 mm×20 mm 范圍內(nèi)進(jìn)行均勻涂片，染色后進(jìn)行后續(xù)觀察和Nugent 評分。

圖1 陰道分泌物不同取樣量在20 mm×20 mm 面積下涂片革蘭染色結(jié)果（革蘭染色，×1 000）Figure 1 Gram staining results of smear under different sampling quantities of vaginal secretions at 20 mm×20 mm area（Gram staining，×1 000）

2.2 改良方法與傳統(tǒng)方法對菌群密集度差異分析

傳統(tǒng)方法與改良方法的菌群密集度結(jié)果見表1。兩種方法的差異率為56.2%（131/233），改良方法與傳統(tǒng)方法密集度比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表1 傳統(tǒng)方法與改良方法菌群密集度結(jié)果［n（%）］Table 1 Results of flora density of traditional and improved methods［n（%）］

表2 傳統(tǒng)方法與改良方法密集度差異結(jié)果［n（%）］Table 2 Results of the difference in density between the traditional method and the improved method［n（%）］

2.3 改良方法與傳統(tǒng)方法對菌群多樣性分析

傳統(tǒng)方法與改良方法的菌群多樣性結(jié)果，見表3。改良方法與傳統(tǒng)方法多樣性比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表3 傳統(tǒng)方法與改良方法菌群多樣性結(jié)果［（n%）］Table 3 Results of flora diversity of traditional and improved methods［（n%）］

表4 傳統(tǒng)方法與改良方法多樣性差異結(jié)果［n（%）］Table 4 Diversity differences between traditional methods and improved methods［n（%）］

2.4 Nugent 評分結(jié)果差異分析

兩種方法的Nugent 評分結(jié)果，見表5。改良方法與傳統(tǒng)方法Nugent 評分結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表6、圖2。

表5 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分結(jié)果［n（%）］Table 5 Nugent score results of traditional and improved methods［n（%）］

表6 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分差異結(jié)果［n（%）］Table 6 Difference results between traditional method and improved method Nugent score［n（%）］

圖2 傳統(tǒng)方法與改良方法的Nugent 評分差Figure 2 Nugent score difference between traditional and improved methods

2.3 改良方法與傳統(tǒng)對233 例患者細(xì)菌性陰道病診斷結(jié)果的比較

改良方法與傳統(tǒng)方法對BV 的診斷結(jié)果比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表7。

表7 傳統(tǒng)方法與改良方法Nugent 評分診斷BV 結(jié)果［n（%）］Table 7 Traditional and improved methods Nugent score in the diagnosis of BV［n（%）］

2.4 傳統(tǒng)方法與改良方法的方法學(xué)評價(jià)

兩種方法的方法學(xué)評價(jià)結(jié)果顯示，改良方法（AUC 0.696）優(yōu)于傳統(tǒng)方法（AUC 0.662）。見表8、圖3。

圖3 傳統(tǒng)方法與改良方法的ROC 曲線Figure 3 ROC curves of traditional and improved methods

表8 傳統(tǒng)方法與改良方法的方法學(xué)評價(jià)結(jié)果Table 8 Methodological evaluation results of traditional and improved methods

3 討論

Nugent 評分標(biāo)準(zhǔn)是目前臨床診斷中診斷BV的一種重要方法。但Nugent 評分標(biāo)準(zhǔn)缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的分析前條件，因?yàn)椴煌娜庸ぞ吆统绦驅(qū)е玛幍婪置谖飿?biāo)本的均勻性和涂片厚度不同，這些差異都將影響其結(jié)果的解釋［11］。因此，在進(jìn)行Nugent評分時(shí)應(yīng)有定量化的規(guī)范操作，才能實(shí)現(xiàn)質(zhì)量控制。本研究針對Nugent 評分方法的分析前處理進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化的制定及操作，用制定的改良方法涂片后在鏡下觀察菌群密集度、多樣性以及進(jìn)行Nugent評分，并將結(jié)果與傳統(tǒng)方法涂片后的相關(guān)結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果都具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。并以醫(yī)生診斷為陰道炎作為標(biāo)準(zhǔn)，比較兩種方法診斷結(jié)果的準(zhǔn)確性，并對兩種方法進(jìn)行方法學(xué)評價(jià)，得出結(jié)果：改良方法對BV 的診斷結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)方法。

本研究的局限性在于改良方法并非絕對定量化，由于采樣工具以及涂片工具為自我研制，采樣量無法精準(zhǔn)定量仍可導(dǎo)致部分誤差。在今后的工作中，需要進(jìn)一步制定商業(yè)化的采樣工具采樣涂片為Nugent 評分方法分析前處理提供可推廣的支持，改良方法得以推廣應(yīng)用于診斷BV 的工作中。

綜上所述，本研究認(rèn)為建立分析前操作規(guī)范及定量采樣，規(guī)定面積下涂布，是對Nugent 評分標(biāo)準(zhǔn)在診斷細(xì)菌性陰道病的準(zhǔn)確性的前提條件，改良方法的建立和使用可提高BV 診斷的準(zhǔn)確性。