韓貝貝 王寶駒 佟 靜 劉明池 武占會 孟艷玲 劉 寧*
〔1 河北工程大學園林與生態(tài)工程學院,河北邯鄲 056038;2 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部都市農(nóng)業(yè)(北方)重點實驗室,北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所,北京 100097;3 國家蔬菜工程技術(shù)研究中心,北京市農(nóng)林科學院,北京100097〕
韭 菜(Rottl.ex Spreng.)是石蒜科(Amaryllidaceae)蔥屬的多年生宿根蔬菜(Saito,1990;李延龍 等,2020)。韭菜起源于我國華北地區(qū),栽培歷史悠久,全國各地均有分布,常年種植面積達40 萬hm以上,在蔬菜生產(chǎn)和周年供應(yīng)中占據(jù)重要地位(王娟娟 等,2020)。近年來,水培韭菜技術(shù)的出現(xiàn)在一定程度上緩解了長期困擾韭菜產(chǎn)業(yè)的農(nóng)殘超標和病蟲害問題,但與傳統(tǒng)土壤栽培韭菜相比,水培韭菜的風味稍遜一籌,其原因在于風味物質(zhì)積累量不足(Liu et al.,2021)。因此,如何通過栽培技術(shù)創(chuàng)新提升水培韭菜的風味,成為當前水培韭菜產(chǎn)業(yè)的核心問題之一。
韭菜葉片含有豐富的有機硫化合物S-烴基半胱氨酸亞砜〔S-alk(en)yl cysteine sulfoxide,CSO〕,這類風味前體物質(zhì)構(gòu)成了韭菜特征香氣和醫(yī)療保健功效的主要物質(zhì)基礎(chǔ)(Liu et al.,2021)。同位素示蹤研究證實硫酸鹽首先同化生成半胱氨酸(Takahashi,2010,2019),經(jīng)過多步生化反應(yīng)形成谷胱甘肽及其衍生物(Galant et al.,2011),如S-甲基谷胱甘肽、S-(2-羧丙基)-谷胱甘肽等,繼而生成γ-谷氨酰胺-S-烯丙基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-丙烯基半胱氨酸、γ-谷氨酰胺-S-甲基半胱氨酸等一系列γ-谷氨酰胺肽衍生物,最終經(jīng)依賴黃素的單加氧酶(FMO)催化的硫氧化(S-oxygenation)反應(yīng),生成不同的CSO 分子(Jones et al.,2004)。FMO 負責催化立體選擇性較高的硫單加氧反應(yīng),因而該過程可能是CSO 合成限速反應(yīng)(Yoshimoto et al.,2015)。在加工韭菜葉片時,CSO 經(jīng)蒜氨酸酶催化水解和隨后的自發(fā)降解反應(yīng),生成一系列具有刺激性氣味的揮發(fā)性有機硫化物,釋放出蔥屬蔬菜的特征香氣(Yoshimoto &Saito,2019)。研究表明,絲氨酸直接參與半胱氨酸的合成過程,纈氨酸是CSO 合成的中間產(chǎn)物γ-谷氨酰胺-S-(2-羧丙基)-半胱氨酸的反應(yīng)底物,谷氨酸是谷胱甘肽的合成起始底物之一,因而這些氨基酸在CSO 生物合成過程中起著重要作用(Jones et al.,2004,Liu et al.,2021)。綜上所述,CSO 生物合成過程至少涉及纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸、谷氨酸參與的生化反應(yīng)過程,而FMO 在韭菜CSO合成過程中起著至關(guān)重要的作用(Rabinowitch &Currah,2002;Jones et al.,2004;Yoshimoto et al.,2015)。
氨基酸作為一種有機氮源可以被作物直接吸收利用,外源施用氨基酸可以顯著提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆性(張連秋 等,2014;Teixeira et al.,2018)。大量研究證實,氨基酸等小分子物質(zhì)作為水溶肥料,不僅能促進作物生長,還能顯著提高茄子、芹菜、豇豆、番茄等蔬菜的品質(zhì),作物凈光合速率、葉綠素含量、株高、莖粗等指標顯著高于對照組(曹洪鳳 等,2010;Koukounaras et al.,2013;王軍 等,2014;王蓓 等,2017)。目前,氨基酸肥料在韭菜生產(chǎn)中的應(yīng)用報道較少,因此本試驗利用水培韭菜生產(chǎn)系統(tǒng),以苗齡為3 年的791 韭菜為試驗材料,通過向水培營養(yǎng)液中添加CSO 合成相關(guān)的4 種氨基酸(纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和谷氨酸),研究它們對水培韭菜生長、產(chǎn)量、品質(zhì)及風味的影響,以期明確能夠促進韭菜CSO 積累,提升水培韭菜風味的氨基酸。
試驗在北京市農(nóng)林科學院蔬菜研究所連棟玻璃溫室內(nèi)進行,供試韭菜品種為791。采用新型韭菜水培系統(tǒng),架床使用72 孔無底栽培格盤(54 cm ×28 cm),營養(yǎng)液使用千葉農(nóng)式蔥配方(杜紅艷 等,2015;季延海 等,2017):Ca(NO)1.0 mmol ·L、KNO4.0 mmol·L、NHNO2.0 mmol·L、KHPO2.0 mmol·L、(NH)SO1.0 mmol·L、MgSO·7HO 1.0 mmol·L。在此配方基礎(chǔ)上,參考水培營養(yǎng)液添加氨基酸的試驗(Khan et al.,2019),將營養(yǎng)液中氨基酸處理條件分別設(shè)定為添加1 mmol·L纈氨酸、絲氨酸、半胱氨酸和谷氨酸,以不添加氨基酸的千葉農(nóng)式蔥配方營養(yǎng)液為對照(CK)。試驗以3 年生的韭菜為研究材料,每個處理使用3 個栽培格盤的韭菜,設(shè)置3 次重復(fù)。營養(yǎng)液pH 值控制在6.0 ± 0.3 范圍,每周測1 次EC和pH 并及時使用相應(yīng)的營養(yǎng)液進行補充和更換。試驗于2021 年4 月3 日、5 月12 日和6 月19 日分別收獲第1、2、3 茬韭菜,第1 茬韭菜采收后開始進行不同氨基酸處理,并在第2 茬采收時測定各項生長、生理及品質(zhì)指標。
每個處理隨機選取10 株韭菜進行測定,設(shè)置3 次重復(fù)。用電子游標卡尺測定韭菜假莖粗,用直尺測量韭菜株高、葉長、葉寬,觀察葉片數(shù)。采用乙醇浸提比色法測定韭菜葉片光合色素含量,采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法測定韭菜根系活力(李合生,2000),采用硫酸-蒽酮比色法測定韭菜葉片可溶性糖含量(張以順 等,2009),采用2,6-二氯酚靛酚鈉滴定法測定韭菜葉片VC 含量(蔡慶生,2013),采用考馬斯亮藍G-250 法測定韭菜葉片可溶性蛋白質(zhì)含量(李合生,2000),采用水楊酸法測定韭菜葉片硝酸鹽含量(曹建康 等,2007)。
每個處理隨機選取5 株韭菜測定單株干鮮質(zhì)量,3 次重復(fù)。鮮質(zhì)量直接用分析天平稱量,干質(zhì)量測定在105 ℃殺青,75 ℃烘干至恒重后稱重記錄。單位面積理論產(chǎn)量是根據(jù)收獲的3 個水培盤(每盤面積0.151 2 m)內(nèi)的韭菜產(chǎn)量進行估算,計算公式如下。
理論產(chǎn)量〔kg ·(667 m)〕=單個格盤收獲韭菜產(chǎn)量(kg)× 667 m/單個格盤面積
韭菜辛辣度測定參考大蒜和洋蔥的檢測方法,通過測定CSO 水解后酶促丙酮酸的含量,評估蔥屬作物的辛辣程度(Liu et al.,2021)。每個處理取4~6 株新鮮韭菜葉片中段共0.5 g,混成一個樣品放入離心管中,以未添加氨基酸營養(yǎng)液的水培韭菜為CK1,以土壤栽培的韭菜為CK2,3 次重復(fù)。在離心管中加入2 mL 含5% TCA 的磷酸緩沖液(pH 6.5),經(jīng)高通量植物勻漿提取儀研磨成漿,用臺式高速冷凍離心機10 000 r·min離心后取上清液,樣品組按比例加入10 倍稀釋的韭菜組織上清液、0.012 5% 2,4-二硝基甲苯、0.6 mol·L氫氧化鈉(比例為3∶1∶5),空白組加入與韭菜組織上清液等體積的蒸餾水,室溫反應(yīng)5 min 后用BioTek 酶標儀進行比色測定吸光值,檢測波長為520 nm。利用丙酮酸鈉溶液繪制標準曲線,計算韭菜葉片的酶促丙酮酸含量,測定其辛辣度。
每個處理取韭菜的第4 片葉,每5 株的葉片材料混成一個樣品,液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱,用于RNA 提取。使用EasyPure? Plant RNA Kit 試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取韭菜葉片總RNA,隨后用TransScript? II All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄,合成cDNA。使用SYBR Green Realtime PCR Mater Mix試 劑 盒〔Toyobo(shanghai)Biotech CO.,Ltd.〕進行基因表達分析。qRT-PCR 反應(yīng)體系為:SYBR Green Mix(2×)10.0 μL、上下游引物(10 μmol ·L)各0.5 μL、cDNA 1.0 μL、補足滅菌ddHO 至20.0 μL;qRT-PCR 反應(yīng)程序:95 ℃ 30 s;95 ℃ 5 s,56 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,40 個循環(huán)。試驗設(shè)置3個生物學重復(fù),選用()為內(nèi)參基因,采用2法計算基因相對表達量(Tong et al.,2021)。
使用SPSS 22.0 以Tukey 法進行多重比較,檢驗數(shù)據(jù)差異顯著性,采用EXCEL 2016 軟件分析試驗數(shù)據(jù)并進行圖表繪制。
從表1 可以看出水培韭菜營養(yǎng)液添加不同氨基酸后,株高、假莖粗、葉長、葉片數(shù)、根系活力等多數(shù)指標優(yōu)于對照,其中以谷氨酸處理的韭菜表現(xiàn)最佳,株高、假莖粗、葉長、葉寬、葉片數(shù)和根系活力分別較對照提高了30.6%、47.2%、29.7%、34.8%、16.2%和166.9%,且與對照差異顯著。絲氨酸、纈氨酸對水培韭菜生長也有一定的促進作用,而半胱氨酸對韭菜生長影響不大。
表1 不同氨基酸處理對韭菜生長指標的影響
由表2 可知,纈氨酸、絲氨酸和半胱氨酸處理韭菜的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素a+b、葉綠素a/b 等生理指標均與對照差異不顯著。但谷氨酸處理的韭菜葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素和葉綠素a+b 含量均顯著低于對照,分別較對照降低了41.2%、15.0%、42.8%和38.7%。
表2 不同氨基酸處理對韭菜光合色素含量的影響
由表3 可以看出,谷氨酸處理顯著促進了VC積累,韭菜葉片的VC 含量比對照增加50.9%。添加氨基酸處理對韭菜可溶性糖、可溶性蛋白含量影響不大。纈氨酸處理導(dǎo)致葉片硝酸鹽含量顯著升高,而其他3 種氨基酸對葉片的硝酸鹽含量影響不大。
表3 不同氨基酸處理對韭菜品質(zhì)的影響
由表4 可知,氨基酸處理對韭菜鮮質(zhì)量和干質(zhì)量的影響趨勢完全一致。谷氨酸處理能顯著促進韭菜單株干、鮮質(zhì)量增加,分別比對照增加44.4%、42.2%;半胱氨酸處理導(dǎo)致韭菜干、鮮質(zhì)量顯著降低,分別比對照降低43.4%、49.5%。
表4 不同氨基酸處理對韭菜單株干鮮質(zhì)量和產(chǎn)量的影響
韭菜產(chǎn)量的變化趨勢為:谷氨酸>纈氨酸>絲氨酸>對照>半胱氨酸,其中谷氨酸、纈氨酸處理的產(chǎn)量顯著高于對照,分別實現(xiàn)增產(chǎn)41.5%、33.1%,而半胱氨酸處理的產(chǎn)量顯著低于對照,比對照降低17.6%。
由圖1 可以看出,谷氨酸處理的韭菜酶促丙酮酸含量達4.3 μmol·g(FW),辛辣度較對照提高70.9%,與土壤韭菜辛辣度相近。半胱氨酸和纈氨酸處理也能提高韭菜辛辣度,但與對照差異不顯著。
圖1 不同氨基酸處理對韭菜辛辣度的影響
為明確氨基酸處理對韭菜FMO 基因表達的影響,本試驗利用qPCR 方法研究了已知的6 個韭菜FMO 基因在4 種氨基酸處理條件下的表達情況。試驗結(jié)果表明,__和__表達不受4 種氨基酸處理的影響,其他4 個韭菜FMO 基因的表達至少響應(yīng)1 種氨基酸處理(圖2)。值得注意的是,與對照相比,谷氨酸處理能促進4 個FMO 基因(__、__、__和__)表達量顯著增加,而半胱氨酸僅能顯著促進1 個FMO 基因(__)的表達。
圖2 4 種氨基酸處理對韭菜FMO 基因表達的影響
水培韭菜的辛辣度不及土壤栽培韭菜,嚴重影響消費者的購買意愿和農(nóng)戶的種植收益,因此如何通過栽培技術(shù)創(chuàng)新提升水培韭菜的風味成為當前一項重要的產(chǎn)業(yè)需求。構(gòu)成韭菜風味的主要成分是一類有機硫化物CSO,其合成過程需要半胱氨酸、絲氨酸、纈氨酸、谷氨酸參與,因此筆者在水培韭菜營養(yǎng)液中添加上述4 種氨基酸,研究了它們對韭菜辛辣度及生長、生理指標的影響。
不同作物對氨基酸肥料的需求存在顯著差異。李磊等(2019)發(fā)現(xiàn)適宜濃度的氨基酸水溶肥作用在辣椒現(xiàn)蕾期時能促進作物生長,辣椒果實的氨基酸含量有所增加,表明植物不僅可以吸收氨基酸,還可以將外源氨基酸轉(zhuǎn)換利用,從而提高植物體內(nèi)氨基酸含量。張政(2005)以5 種具有代表性的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、賴氨酸和谷氨酸)進行黃瓜營養(yǎng)效應(yīng)的試驗,結(jié)果表明丙氨酸和甘氨酸能顯著提高黃瓜的生長指標,而賴氨酸處理下黃瓜干鮮質(zhì)量甚至低于對照。本試驗發(fā)現(xiàn),谷氨酸、絲氨酸和纈氨酸處理能促進水培韭菜生長,其中谷氨酸的促生效果最好,然而半胱氨酸對韭菜生長基本無影響。由此可見,韭菜更傾向利用谷氨酸,在營養(yǎng)液中添加谷氨酸能促進韭菜生長。
本試驗發(fā)現(xiàn)添加氨基酸對水培韭菜的光合色素合成影響不大,韭菜的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素、葉綠素a+b、葉綠素a/b 含量均低于對照或與對照無顯著差異。這與前人的研究結(jié)果基本一致,如在以硝酸鹽為氮源的培養(yǎng)基中,谷氨酸促進了小球藻的生物量但是葉綠素含量沒有變化(劉學銘和梁世中,1999)。推測這可能是由于試驗添加的4 種氨基酸并不直接參與光合作用代謝途徑,因而對光合色素合成過程影響輕微。
根系的生長情況直接影響植株生長特性和肥水吸收能力。本試驗中,水培韭菜在添加絲氨酸、谷氨酸和纈氨酸的營養(yǎng)液中根系活力均顯著高于對照,反映它們能促進水培韭菜更好生長。同時,添加谷氨酸、纈氨酸使韭菜產(chǎn)量顯著提高,其中谷氨酸的增產(chǎn)效果最為顯著。因此,結(jié)合考慮生長、生理和產(chǎn)量指標,在水培韭菜營養(yǎng)液中添加谷氨酸,有利于改善水培韭菜的生長狀況。
外源施用4 種氨基酸對韭菜的營養(yǎng)品質(zhì)指標影響不大,但能影響韭菜的風味。本試驗發(fā)現(xiàn)僅谷氨酸處理能顯著提高水培韭菜的VC 含量,然而可溶性糖、可溶性蛋白等指標與對照差異不顯著,其他3 種氨基酸處理對水培韭菜的營養(yǎng)指標影響輕微;谷氨酸處理能顯著提高水培韭菜酶促丙酮酸含量,使水培韭菜變得更為辛辣,這表明谷氨酸能促進CSO 的合成和積累。
為探究氨基酸處理提升水培韭菜風味的機理,進一步分析了CSO 合成關(guān)鍵基因FMO 表達的變化情況。筆者前期在韭菜組織特異性轉(zhuǎn)錄組鑒定到6個韭菜葉片組織中豐度較高的韭菜FMO 基因,它們是編碼CSO 合成限速反應(yīng)的一類氧化酶基因(Liu et al.,2021)。qRT-PCR 試驗表明,谷氨酸能促進其中4 個FMO 基因的表達,效果明顯好于其他3種氨基酸處理,從而更有利于韭菜合成風味物質(zhì)前體分子,提升韭菜風味。因此綜合考慮生長、生理和營養(yǎng)風味指標,在營養(yǎng)液中添加1 mmol·L谷氨酸,能有效改善水培韭菜品質(zhì),提高產(chǎn)量,并有效提升其辛辣風味。