黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌種群結(jié)構(gòu)及PAI致病基因分析

張鉉哲 趙 雪 陳蘇慧 徐浩然 任雪琦 朱二龍

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150030）

馬鈴薯瘡痂?。╬otato common scab，PCS）是一種由致病鏈霉菌（spp）引起的土傳病害，在各地馬鈴薯生產(chǎn)區(qū)幾乎均有發(fā)生。該病害的特點(diǎn)是馬鈴薯塊莖表皮層上有凸起、凹陷、網(wǎng)狀或其他類型木栓狀壞死病斑，顏色由褐色至黑色不等，其中病斑最深可造成約7 mm 的組織凹陷（劉淑娜，2019）。致病鏈霉菌除了能侵染馬鈴薯外，還能感染其他根菜類蔬菜，如胡蘿卜、蘿卜、根甜菜等，在肉質(zhì)根表面形成瘡痂病斑，降低蔬菜的品質(zhì)和市銷性，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失（Wanner，2004；Hill &Lazarovits，2005；Qu et al.，2008）。近幾年，馬鈴薯瘡痂病的發(fā)生越來(lái)越嚴(yán)重，很大程度上影響了馬鈴薯的市銷性。瘡痂病是由1 種或幾種鏈霉菌復(fù)合侵染引起的病害。鏈霉菌屬放線菌，種類繁多，幾乎所有的鏈霉菌都是土壤腐生菌，具有較強(qiáng)的抗逆性，產(chǎn)生的孢子在干燥條件下能長(zhǎng)期存活。常見的致病鏈霉菌主要有3 種，即、以及（Loria et al.，1997）。是第1 個(gè)被報(bào)道的致病鏈霉菌，是全球引起瘡痂病的主要病原菌（Lambert &Loria，1989；Corrêa et al.，2015），且被認(rèn)為是分布最廣的一種，其次是和（Lerat et al.，2009）。國(guó)內(nèi)外對(duì)馬鈴薯瘡痂病病原菌的分類進(jìn)行了大量研究，不斷有致病性鏈霉菌新菌株被發(fā)現(xiàn)，致病菌的組成趨于復(fù)雜化。

引起馬鈴薯瘡痂病的致病鏈霉菌具有多樣性，但致病性的基因和機(jī)制似乎在引起瘡痂病的鏈霉菌中共享。致病菌的致病基因聚集在染色體一個(gè)大的區(qū)域中，且該區(qū)域具有在鏈霉菌種間水平移動(dòng)的特點(diǎn)，可以水平轉(zhuǎn)移到新的鏈霉菌物種中以產(chǎn)生致病性物種或菌株，從而起到致病島（pathogenicity island，PAI）作用。該致病島上參與毒素合成及調(diào)控的基因有、、、、、等（Healy et al.，2002；Kers et al.，2004；Joshi et al.，2010）。目前研究最多的基因是、和基因。

為了解黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌的種類和鏈霉菌PAI 致病基因的特點(diǎn)，本試驗(yàn)從黑龍江省不同馬鈴薯種植地區(qū)采集具有典型馬鈴薯瘡痂病癥狀的薯塊，進(jìn)行瘡痂病菌的分離，通過(guò)病原菌的形態(tài)特征、生理生化特性結(jié)合鏈霉菌16S rDNA 序列對(duì)病原菌進(jìn)行分類鑒定，并檢測(cè)、和3種PAI 致病基因的組成，以期為追蹤馬鈴薯瘡痂病相關(guān)鏈霉菌的進(jìn)化歷史和傳播資源，也為有效防治馬鈴薯瘡痂病提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 馬鈴薯瘡痂病菌的采集與分離

2018—2020 年馬鈴薯收獲期間，在黑龍江省牡丹江市、雞西市、綏化市、鶴崗市、佳木斯市及哈爾濱市等馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集瘡痂病薯塊。參考趙偉靖（2018）稀釋分離法進(jìn)行瘡痂病菌的分離。在無(wú)菌條件下，選擇白色粉狀單菌落，劃線純化3 次，將純化后的菌株編號(hào)保存，備用。

1.2 鏈霉菌的致病性測(cè)定

參考趙偉靖（2018）的方法利用蘿卜幼苗法測(cè)定分離菌株的致病性。挑選已發(fā)芽長(zhǎng)勢(shì)一致的蘿卜種子放入含有1%水瓊脂的試管內(nèi)，每支試管3 粒，接種10CFU·mL的馬鈴薯瘡痂病菌菌懸液200 μL，以接種等量無(wú)菌水的處理作為空白對(duì)照。于光照培養(yǎng)箱中每天16 h 光照、8 h 黑暗培養(yǎng)7 d 后，統(tǒng)計(jì)蘿卜幼苗的長(zhǎng)度并計(jì)算病原菌對(duì)蘿卜幼苗的抑制率。

抑制率=（1 -處理幼苗平均長(zhǎng)度/對(duì)照幼苗平均長(zhǎng)度）× 100%

1.3 致病鏈霉菌的鑒定

1.3.1 形態(tài)觀察 挑取長(zhǎng)勢(shì)良好的致病鏈霉菌單一菌落，劃線接種于ISP2 培養(yǎng)基（酵母提取物4 g，麥芽糖提取物10 g，葡萄糖4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL）平板上，28 ℃黑暗條件下培養(yǎng)7 d，觀察各測(cè)試菌株的色素產(chǎn)生情況。將菌株接種于高氏1 號(hào)培養(yǎng)基（可溶性淀粉20 g，NaCl 0.5 g，KHPO0.5 g，KNO1.0 g，MgSO·7HO 0.5 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.01 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 000 mL）平板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，14 d 后測(cè)試菌株充分生長(zhǎng)，觀察菌落形態(tài)及孢子鏈形態(tài)等特征。孢子鏈形態(tài)觀察采用印片法（殷修魯，2018）。

1.3.2 生物學(xué)特性測(cè)定 參考徐麗華等（2007）的方法對(duì)馬鈴薯瘡痂病致病鏈霉菌的黑色素產(chǎn)生、硫化氫產(chǎn)生、纖維素利用、明膠液化、淀粉酶產(chǎn)生、碳源利用、氮源利用、敏感性等進(jìn)行測(cè)定。

1.3.3 分子生物學(xué)鑒定 鏈霉菌總DNA 的提取采用細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）進(jìn)行，用鏈霉菌16S rDNA 通用引物PA/PH 進(jìn)行檢測(cè)（李馳 等，2019）。PCR 產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序，將序列拼接處理后的基因序列通過(guò)NCBI 進(jìn)行Blast比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，對(duì)菌株進(jìn)行同源性分析。

1.4 致病鏈霉菌的PAI 致病基因檢測(cè)

通過(guò)PCR 的方法檢測(cè)致病鏈霉菌的致病基因類型，檢測(cè)菌株中是否含有、和致病基因，引物序列、PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件和體系參考李馳等（2019）方法，PCR 擴(kuò)增結(jié)果用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，統(tǒng)計(jì)致病菌株的致病基因組成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯瘡痂病菌的分離純化

2018—2020 年每年8—9 月馬鈴薯收獲時(shí)節(jié)，采用5 點(diǎn)取樣法從黑龍江省共6 個(gè)市8 個(gè)采樣點(diǎn)的馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)采集瘡痂病薯塊，得到154 份馬鈴薯瘡痂病樣品，進(jìn)行菌株分離，挑選具有鏈霉菌形態(tài)特征的單菌落，純化菌株，共分離得到鏈霉菌菌株312 株（表1）。

表1 2018—2020 年黑龍江省各馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)樣品采集與菌株分離統(tǒng)計(jì)

2.2 鏈霉菌菌株的致病性測(cè)定

利用蘿卜幼苗法測(cè)定純化的鏈霉菌菌株的致病性，根據(jù)鏈霉菌菌株是否會(huì)對(duì)蘿卜幼苗的生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制判斷其致病能力。結(jié)果表明，與空白對(duì)照相比，致病菌株使蘿卜幼苗的生長(zhǎng)受到明顯抑制，抑制率均在45%以上，且使根須的數(shù)量減少（圖1）。通過(guò)蘿卜幼苗法從分離純化的312 株鏈霉菌菌株中篩選出263 株致病鏈霉菌，致病菌株所占比例達(dá)到84%。各地區(qū)致病菌株數(shù)及所占比例有差異，在哈爾濱市香坊區(qū)、呼蘭區(qū)和阿城區(qū)3 個(gè)地點(diǎn)共分離鏈霉菌菌株131 株，致病菌株為109 株，所占比例約為83%，其中香坊區(qū)致病鏈霉菌菌株所占比例為80%，呼蘭區(qū)所得鏈霉菌菌株全為致病菌株，即所占比例為100%，阿城區(qū)獲得21 株鏈霉菌菌株，致病菌株占比達(dá)到76%；佳木斯市共分離78 株鏈霉菌菌株，致病菌株為59 株，所占比例為76%；鶴崗市致病鏈霉菌菌株為36 株，所占比例為90%；綏化市5 個(gè)分離菌株中致病菌株所占比例為100%；牡丹江市致病菌株所占比例為90%；雞西市為95%（表1）。

圖1 蘿卜幼苗法測(cè)定菌株的致病性

2.3 致病鏈霉菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)觀察 將263 株鏈霉菌致病菌株在ISP2 培養(yǎng)基平板上黑暗培養(yǎng)7 d，MDJ-1、AC-1、SH-4、JMS-17 和HL-23 等5 個(gè)菌株對(duì)蘿卜幼苗的抑制效果明顯，且形態(tài)各異，因此選擇這5 個(gè)菌株進(jìn)行觀察鑒定。MDJ-1 和AC-1 菌株能在ISP2 培養(yǎng)基上產(chǎn)生褐色色素，其余菌株均無(wú)色素產(chǎn)生（圖2-A）。菌株菌落表面粗糙，形狀有圓形和邊緣不規(guī)則兩種，多數(shù)菌落菌絲平鋪于培養(yǎng)基上，但AC-1菌株的菌落中央凸起；大部分菌株菌落表面能產(chǎn)生無(wú)色小液滴，僅SH-4 菌株無(wú)液滴產(chǎn)生（圖2-B）。MDJ-1 和AC-1 的孢子鏈為螺旋狀，SH-4、JMS-17 和HL-23 的孢子鏈形態(tài)為直柔狀（圖2-C）。

圖2 致病鏈霉菌色素的產(chǎn)生、菌落形態(tài)及孢子鏈顯微形態(tài)（400 倍）

2.3.2 生物學(xué)特性測(cè)定 對(duì)5 株具有代表性的菌株進(jìn)行黑色素產(chǎn)生、硫化氫產(chǎn)生、纖維素利用、明膠液化、淀粉酶產(chǎn)生、碳源利用、氮源利用、敏感性等生理生化特性測(cè)定。詳細(xì)結(jié)果見表2。

表2 致病鏈霉菌菌株生理生化特性

2.3.3 分子生物學(xué)鑒定 用鏈霉菌通用引物PA/PH對(duì)5 個(gè)代表性菌株DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物測(cè)序后，將所得序列于NCBI 進(jìn)行序列Blast 比對(duì)，并通過(guò)Mega 7.0 軟件對(duì)序列進(jìn)行多重比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，以確定測(cè)試菌株的種類。從圖3 可以看出，代表性菌株MDJ-1 與親緣關(guān)系最近，序列在NCBI 中Blast 比對(duì)同源性達(dá)到99%。哈爾濱市阿城區(qū)的代表性菌株AC-1 與親緣關(guān)系相近，同源性為99%。菌株JMS-17 與親緣關(guān)系最近，Blast 比對(duì)同源性為99%。SH-4 與的同源性為99%，HL-23 與的同源性為99%。

圖3 根據(jù)16S rDNA 基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4 黑龍江省馬鈴薯瘡痂病菌種類分析

從黑龍江省6 個(gè)市8 個(gè)采樣點(diǎn)共分離得到、、、、等5 種致病性鏈霉菌。263 株致病菌株中，127 株為，占比48.3%；14 株為，占比5.3%；46 株為，占比17.5%；24 株為，占比9.1%；52 株為，占比19.8%。各地區(qū)病原菌種類結(jié)果如下（表3）：哈爾濱市有3 種，其中香坊區(qū)為（39 株）和（30 株），呼蘭區(qū)為（24 株），阿城區(qū)為（16 株）；佳木斯市有2 種，分別為（45株）和（14 株）；鶴崗市有（24 株）和（12 株）2 種；綏化市為（5 株）；牡丹江市為（19 株）；雞西市為（35 株）。其中，分布最廣泛，在哈爾濱市、佳木斯市、鶴崗市和牡丹江市均有分布。

表3 致病鏈霉菌種屬的地區(qū)分布

2.5 致病鏈霉菌PAI 致病基因的檢測(cè)

對(duì)分離的263 株致病菌株進(jìn)行PAI 致病基因（、和）的檢測(cè)，用3 種致病基因引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)，共檢測(cè)出2 種致病基因類型，分別為和。其 中和的致病基因類型均為。、和致病基因類型均為（表3）。哈爾濱市和鶴崗市均具有2 種致病基因型，其中哈爾濱市香坊區(qū)致病基因型和的分離比率為56.5%和43.5%，鶴崗市和的分離比率分別為66.7%和33.3%。

3 討論與結(jié)論

由致病鏈霉菌（spp.）引起的馬鈴薯瘡痂病是一種嚴(yán)重的土傳病害，已報(bào)道的病原菌種類較多。目前黑龍江省已報(bào)道的鏈霉菌有、、和4 種病原菌（邢瑩瑩 等，2016；楊德潔等，2018）。本試驗(yàn)從黑龍江省6 個(gè)市采集了154份馬鈴薯樣品，分離出312 株鏈霉菌菌株，利用蘿卜幼苗法測(cè)定菌株致病性，共獲得263 株致病菌株，結(jié)合致病菌株的形態(tài)學(xué)、生理生化特性和分子生物學(xué)特征進(jìn)行分類鑒定。結(jié)果表明，各地區(qū)致病菌種類有差異，6 個(gè)市共分離到5 種致病鏈霉菌、、、、，說(shuō)明黑龍江省馬鈴薯瘡痂病病原菌具有多樣性。是分布范圍最廣的種類，分離率達(dá)到全部致病菌的48.3%，、和是黑龍江省首次報(bào)道的馬鈴薯瘡痂病菌。

基因的水平轉(zhuǎn)移在細(xì)菌進(jìn)化中發(fā)揮著重要作用，使細(xì)菌快速獲得新的性狀以提高對(duì)特殊環(huán)境（包括與致病相關(guān)的真核寄主）的適應(yīng)能力。細(xì)菌菌株可能含有1 個(gè)或多個(gè)PAI 致病基因，親緣關(guān)系相同的菌株可能含有不同的PAI（增加或完全缺失PAIs），該P(yáng)AI 是使農(nóng)業(yè)系統(tǒng)中出現(xiàn)新的植物致病鏈霉菌種的原因（Kers et al.，2005；Lapaz et al.，2017）。致病基因在病原菌致病性中起著重要作用，PAI 致病基因存在種內(nèi)和種間水平轉(zhuǎn)移的特性，可以從致病鏈霉菌中轉(zhuǎn)移至非致病鏈霉菌中，改變菌株的致病基因組成，使致病基因類型多樣化、復(fù)雜化，最終導(dǎo)致新致病菌的產(chǎn)生（Armijos-Jaramillo et al.，2017）。具有遺傳多樣性的鏈霉菌分離株中高度保守的致病基因是測(cè)定致病性的理想分子標(biāo)記。例如，基因已被用作育種計(jì)劃中潛在致病性的遺傳標(biāo)記，該基因編碼一種分泌的壞死蛋白（Joshi et al.，2007），的異位表達(dá)足以將非致病性鏈霉菌轉(zhuǎn)化為致病菌（Bukhalid &Loria，1997；Bukhalid et al.，1998）。有報(bào)道認(rèn)為基因在非親緣病原鏈霉菌中結(jié)構(gòu)和功能高度保守，而在非致病性菌株中不存在（Bukhalid et al.，1998；Kreuze et al.，1999）。致病性、和菌株可能同時(shí)含有基因和毒素thaxtomin A，但thaxtomin A 的產(chǎn)生不需要（Bukhalid &Loria，1997；Bukhalid et al.，1998）。Joshi 等（2007）研究表明對(duì)于致病性是必要的，但也有人認(rèn)為它在致病性中起輔助作用（Bukhalid et al.，1998），因?yàn)閃anner（2004）發(fā)現(xiàn)其在鏈霉菌的其他一些致病菌株中缺失。本試驗(yàn)將分離鑒定的具有代表性的菌株進(jìn)行PAI 致病基因（、和）的PCR 擴(kuò)增，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察。結(jié)果表明，致病基因的組成類型有2 種，即和，大多數(shù)菌株均含有全部3種致病基因，、和含有和，但缺乏，是非典型的致病基因組成類型，有些地區(qū)缺少含有全部3 種致病基因的分離株，因此，在這些地區(qū)對(duì)致病鏈霉菌PAI 基因的組成還需進(jìn)一步調(diào)查。