分子標(biāo)記篩選抗馬鈴薯Y 病毒種質(zhì)資源研究

蔣 偉 盧麗麗 包麗仙 李秀芬，2 楊紹英，3 楊榮凱 楊美青 李先平*

（1 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，云南昆明 650205；2 云南省文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南文山 663109；3 云南省玉溪市峨山縣化念鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)農(nóng)村綜合服務(wù)中心，云南玉溪 653203；4 云南省德宏州盈江縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，云南德宏 679300；5 包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014040）

病毒病是危害馬鈴薯健康生產(chǎn)的重要病害，特別是馬鈴薯Y 病毒（potato virus Y，PVY）。馬鈴薯感染PVY 后一般減產(chǎn)50%左右，當(dāng)其與馬鈴薯X 病毒（PVX）或馬鈴薯A 病毒（PVA）復(fù)合侵染時(shí)，減產(chǎn)可達(dá)80%。PVY 不僅能降低馬鈴薯的產(chǎn)量，還嚴(yán)重影響馬鈴薯的品質(zhì)，是種薯退化的主要原因（Wang et al.，2011；沈林林 等，2016）。馬鈴薯抗病毒育種能有效控制病毒病對(duì)馬鈴薯的危害，是解決馬鈴薯病毒病危害、促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)發(fā)展的有效手段（Solomon-Blackburn &Barker，2001a；王曉明 等，2005）。病毒的進(jìn)化速度比較快，已被鑒定命名的PVY 株系至少有7 類(lèi)（Singh et al.，2008）。隨著馬鈴薯抗病毒基因的克隆及抗性遺傳研究發(fā)展，開(kāi)發(fā)分子標(biāo)記篩選及聚合多個(gè)抗性基因的馬鈴薯種質(zhì)已成為一種有效的育種策略（Solomon-Blackburn &Barker，2001b；聶碧華，2010）。通過(guò)傳統(tǒng)育種方法將多個(gè)抗不同病毒或其他病害的抗性基因聚合到一個(gè)馬鈴薯品種中是非常困難且非常耗時(shí)的，分子生物學(xué)技術(shù)（如分子標(biāo)記輔助育種）的運(yùn)用可以大大縮短育種進(jìn)程，快速有效地融合多個(gè)目標(biāo)性狀（Solomon-Blackburn &Barker，2001b）。

目前已發(fā)現(xiàn)3 個(gè)馬鈴薯Y 病毒抗性基因Ry（Munoz et al.，1975）、Ry（Cockerham，1943）和Ry（Asama et al.，1982），能 夠 對(duì)PVY 所 有生理小種產(chǎn)生極端抗性。為了檢測(cè)馬鈴薯資源中是否含有這些抗性基因，已開(kāi)發(fā)多個(gè)分子標(biāo)記用于抗病毒馬鈴薯品種分子輔助育種，其中ADG2BbvI、RYSC3 和RYSC4 用于檢測(cè)抗性基因Ry（H?m?l?inen et al.，1998；Sorri et al.，1999；Kasai et al.，2000；劉程 等，2021）。因RYSC3 只需要一次PCR 而且準(zhǔn)確率高，被廣泛用于Ry的 檢測(cè)（Kasai et al.，2000；Ottoman et al.，2009；Ortega &Lopez-Vizcon，2012；Fulladolsa et al.，2015）。SSR 標(biāo) 記STM0003（Song et al.，2005）和STS 標(biāo)記YES3-3A、YES3-3B（Song &Schwarzfischer，2008）用于檢測(cè)Ry。YES3-3A可以有效地檢測(cè)馬鈴薯品種Barbara 及其后代的PVY 極端抗性（Nie et al.，2016）。分子標(biāo)記Ry186和Ry364 用于檢測(cè)Ry極端抗性（Hosaka et al.，2001；Mori et al.，2011）。

分子標(biāo)記輔助育種在發(fā)達(dá)國(guó)家的抗病毒育種中開(kāi)展比較早且研究比較深入。如Whitworth 等（2009）利用分子標(biāo)記RYSC3、RYSC4 和ADG2成功鑒定了抗PVY 的親本來(lái)源，同時(shí)準(zhǔn)確鑒定出后代分離群體中具極端抗性的個(gè)體，加速了抗性品種的篩選并為下一步育種親本的選擇提供了重要的參考。Fulladolsa 等（2015）利用與PVY 抗性基因Ry和Ry緊密連鎖的分子標(biāo)記RYSC3 和YES3-3B 從46 個(gè)品種和品系中鑒定出19 個(gè)抗性株系。我國(guó)在馬鈴薯病毒病抗性資源分子育種方面起步較晚且報(bào)道較少。趙興濤（2012）利用RYSC3 對(duì)國(guó)內(nèi)190 個(gè)主要育成品種和699 個(gè)國(guó)外引進(jìn)育種資源進(jìn)行快速鑒定，發(fā)現(xiàn)國(guó)內(nèi)品種中22 個(gè)品種、國(guó)外引進(jìn)資源中202 份資源含有Ry。白磊和郭華春（2017）利用RYSC3 對(duì)140 份馬鈴薯資源進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)28 份資源中含有Ry。綜上可知，RYSC3 和YES3-3A 廣泛用于Ry和Ry的檢測(cè)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這2 個(gè)分子標(biāo)記的準(zhǔn)確性和篩選可利用的抗性資源材料，本試驗(yàn)以云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院從美國(guó)引進(jìn)的親本含有Ry或（和）Ry基因的9 個(gè)薯?xiàng)l加工型雜交組合為試驗(yàn)對(duì)象，利用RYSC3和YES3-3A 篩選含有Ry和Ry的抗性資源，并通過(guò)人工接種PVY 來(lái)驗(yàn)證分子標(biāo)記預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，同時(shí)結(jié)合田間表現(xiàn)，開(kāi)展連續(xù)兩年的產(chǎn)量評(píng)價(jià)，篩選具有PVY 抗性且產(chǎn)量高的材料作為薯?xiàng)l加工型馬鈴薯品種選育的親本材料或候選品種。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源和種植

供試材料為云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院引自美國(guó)的9 個(gè)薯?xiàng)l加工型馬鈴薯雜交組合，這些雜交組合至少有1 個(gè)親本含有PVY 抗性基因（表1），共包含852個(gè)株系。2018 年3 月26 日，在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嵩明科研基地溫室內(nèi)，將實(shí)生種子播種在育苗盤(pán)內(nèi)，4 月24 日移栽到16 cm × 14 cm 的花盆中，期間進(jìn)行正常的水肥管理。1 個(gè)月后采集新鮮的葉片提取DNA，用于后續(xù)抗性基因分子標(biāo)記的檢測(cè)。同年8 月，單株收獲作為后續(xù)人工接種PVY 評(píng)價(jià)和田間評(píng)價(jià)的材料。

表1 從美國(guó)引進(jìn)的薯?xiàng)l加工型馬鈴薯雜交組合信息

1.2 分子標(biāo)記鑒定供試材料的PVY 抗性

采用新型植物基因組DNA 提取試劑盒〔天根生化科技（北京）有限公司〕提取供試樣品基因組DNA，通過(guò)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 質(zhì)量。檢測(cè)抗性基因Ry的分子標(biāo)記采用RYSC3，其引物序列為正向5′ATACACTCATCTAAATTTGATGG 3′，反向5′AGGATATACGGCATCATTTTTCCGA 3′，產(chǎn)物大小為321 bp（Kasai et al.，2000）。檢測(cè)抗性基因Ry的分子標(biāo)記采用YES3-3A，其引物序列為正向5′TAACTCAAGCGGAATAACCC 3′，反向5′AATTCACCTGTTTACATGCTTCTTGTG 3′，產(chǎn)物大小為341 bp（Song &Schwarzfischer，2008）。PCR 擴(kuò)增體系為15 μL，包括2×PCR 預(yù)混試劑7.5 μL，正反向引物各0.3 μmol·L，DNA 模板為10 ng，用雙蒸水補(bǔ)齊至15 μL。PCR 擴(kuò)增后的產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)。

1.3 PVY 接種鑒定驗(yàn)證供試材料的PVY 抗性

Ry和Ry對(duì)所有PVY 株系都具有抗性，為了驗(yàn)證分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取179 份材料進(jìn)行PVY 人工接種，接種毒株為PVY型，檢測(cè)病毒侵染情況。2019 年3 月，在云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院嵩明基地溫室內(nèi)種植待接種材料，每份材料播種3 盆，以感病品種底希瑞（Desiree）作為陽(yáng)性對(duì)照。待馬鈴薯幼苗具有4～5 片真葉時(shí)，采用人工機(jī)械摩擦方法接種。接種緩沖液為0.1 mol·L磷酸緩沖液，pH 為7。采集PVY毒株葉片10～15 g，加入20～30 mL 磷酸緩沖液，在研缽中充分研磨，用紗布過(guò)濾研磨的汁液。在待接種材料的第4 片展平的真葉表面撒上金剛砂（600 目），用棉簽蘸取毒株汁液在葉片表面來(lái)回涂抹。接種3 周后開(kāi)始取樣，取接種植株新生葉片3～4 片，放于自封袋中于-80 ℃保存。待所有樣品采集完后，進(jìn)行DASELISA 血清學(xué)檢測(cè)。

1.4 供試材料田間產(chǎn)量評(píng)價(jià)

將檢測(cè)含有抗性基因分子標(biāo)記的材料于2019、2020 年3—10月連續(xù)兩年種植在云南會(huì)澤縣駕車(chē)鄉(xiāng)鋼廠村（25°52′2.88″N，103°18′12.80″E）進(jìn)行田間產(chǎn)量評(píng)價(jià)。每份材料種植5 株，株距30 cm、行距60 cm。種植期間進(jìn)行正常田間管理。收獲時(shí)統(tǒng)計(jì)收獲株數(shù)、薯塊數(shù)目，并稱(chēng)重。利用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記鑒定供試材料的PVY 抗性結(jié)果

馬鈴薯PVY 抗性基因Ry連鎖分子標(biāo)記RYSC3 和Ry連鎖分子標(biāo)記YES3-3A 的PCR擴(kuò)增條帶如圖1 所示。由表2 可知，4 個(gè)雜交組合后代中163 個(gè)株系含有分子標(biāo)記RYSC3，占比19.13%，分別是A07748（40 個(gè)株系，占比48.19%）、A08465（32個(gè)株系，占比53.33%）、A11784（30 個(gè)株系，占比62.50%）和A12340（61個(gè)株系，占比50.00%）；7 個(gè)雜交組合后代中330個(gè)株系含有分子標(biāo)記YES3-3A，占比38.73%，分別是A07781（54 個(gè)株系，占比43.20%）、A08419（16個(gè)株系，占比59.26%）、A08474（44 個(gè)株系，占比51.76%）、A11783（47 個(gè)株系，占比40.17%）、A11784（25 個(gè)株系，占比52.08%）、A12312（94個(gè)株系，占比50.81%）和A12340（53 個(gè)株系，占比43.44%）。其中A11784 和A12340 后代中共42個(gè)株系同時(shí)檢測(cè)到2 種分子標(biāo)記。

圖1 雜交組合A12340 后代中不同株系分子標(biāo)記RYSC3 和YES3-3A 檢測(cè)結(jié)果

表2 9 個(gè)雜交組合后代中檢出RYSC3、YES3-3A 分子標(biāo)記的株系數(shù)目及比例

2.2 PVY 接種鑒定與分子標(biāo)記預(yù)測(cè)綜合分析

共接種鑒定179 個(gè)株系，其中165 個(gè)株系含有基因連鎖分子標(biāo)記，14 個(gè)株系不含分子標(biāo)記（表3）。結(jié)合ELISA 檢測(cè)PVY 接種株系的結(jié)果進(jìn)行綜合分析，9 個(gè)雜交組合中陽(yáng)性預(yù)測(cè)率（即含有基因連鎖標(biāo)記的株系中，通過(guò)接種鑒定確定具有PVY 抗性株系的概率）為80.00%～100.00%，A11784 的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率最低，為80.00%，A08419、A08465、A08474 和A12340 的陽(yáng)性預(yù)測(cè)率最高，達(dá)到100.00%；9 個(gè)雜交組合平均陽(yáng)性預(yù)測(cè)率為92.73%。陰性預(yù)測(cè)率（即不含有基因連鎖標(biāo)記的株系中，通過(guò)接種鑒定確定不具有PVY 抗性株系 的概 率）為0～100.00%，A07748、A07781、A08474、A11784 和A12340 后代中經(jīng)檢測(cè)不含抗性標(biāo)記的株系，但接種鑒定表現(xiàn)為抗病，故陰性預(yù)測(cè)率為0；A08465 和A11783 后代中經(jīng)檢測(cè)不含抗性標(biāo)記的株系，接種鑒定均表現(xiàn)為感病，陰性預(yù)測(cè)率為100.00%；8 個(gè)雜交組合（未取A08419 后代中不含抗性標(biāo)記的株系進(jìn)行接種鑒定）平均陰性預(yù)測(cè)率為28.57%。

表3 9 個(gè)雜交組合后代接種鑒定材料及結(jié)果分析

2.3 田間產(chǎn)量評(píng)價(jià)

對(duì)372 份含有抗性基因分子標(biāo)記的材料進(jìn)行兩年的產(chǎn)量評(píng)價(jià)，結(jié)果表明（表4），這些材料平均單株結(jié)薯數(shù)為4.11 ± 2.34 個(gè)，變幅為0.25～17.30 個(gè)，變異系數(shù)為0.57；平均單株產(chǎn)量為0.31 ± 0.21 kg，變幅為0.01～1.47 kg，變異系數(shù)為0.68。A11783平均單株結(jié)薯數(shù)最多（5.26 ± 2.44 個(gè)），A08419平均單株結(jié)薯數(shù)最少（3.28 ± 1.53 個(gè)）；A08465（0.35 ± 0.29 kg）、A11783（0.35 ± 0.24 kg）和A12340（0.35 ± 0.23 kg）平均單株產(chǎn)量較高，A08474 平均單株產(chǎn)量最低（0.27 ± 0.19 kg）。根據(jù)單株產(chǎn)量及兩年產(chǎn)量的穩(wěn)定性（變異系數(shù)），篩選出10 份產(chǎn)量高、變異系數(shù)小的株系材料作為候選品種或親本材料（表5），即A11784-7、A12340-6、A12340-7、A11784-37、A12312-53、A12340-41、A08474-58、A11783-108、A12312-55和A11784-29。

表4 9 個(gè)雜交組合后代單株結(jié)薯數(shù)和產(chǎn)量

表5 篩選獲得的10 份薯?xiàng)l加工型馬鈴薯材料產(chǎn)量相關(guān)指標(biāo)

3 討論與結(jié)論

利用分子標(biāo)記篩選具有PVY 抗性的馬鈴薯資源，可以在馬鈴薯品種選育的早期快速篩選到攜帶PVY 抗性基因的雜交組合后代，為抗病育種提供優(yōu)良的材料。本試驗(yàn)以引自美國(guó)的薯?xiàng)l加工型馬鈴薯雜交組合后代為試材，并結(jié)合其親本PVY 抗性基因信息，通過(guò)對(duì)抗性基因連鎖的分子標(biāo)記篩選，在品種選育早期選擇含有PVY 抗性的后代進(jìn)一步篩選。研究結(jié)果表明，結(jié)合親本譜系信息，分子標(biāo)記篩選的效率更高（Slater et al.，2014），如雜交組合A11784 和A12340，其雙親含有2 種抗性基因Ry和Ry，所以在其42 個(gè)后代株系中檢測(cè)到2種分子標(biāo)記。

PVY 抗性由單個(gè)顯性基因控制（Fulladolsa et al.，2015），且基因位于著絲粒遠(yuǎn)端（H?m?l?inen et al.，1998；Song &Schwarzfischer，2008）。由于檢測(cè)的雜交組合為同源四倍體，染色單體分離過(guò)程更加復(fù)雜，如基因與著絲粒之間發(fā)生交叉（Elison et al.，2020）。因此，檢測(cè)的雜交組合A11784 后代 中RYSC3+∶RYSC3-和A07781、A11783、A12340 后代中YES3-3A+∶YES3-3A-的分離比偏離1∶1（表2）。理想的分子標(biāo)記應(yīng)該與目的性狀精準(zhǔn)匹配，但是目前植物育種中所使用的大部分分子標(biāo)記都不理想（Park et al.，2018）。RYSC3 和YES3-3A 是檢測(cè)PVY 抗性基因Ry和Ry常用的分子標(biāo)記，本試驗(yàn)檢測(cè)的9 個(gè)雜交組合中有4 個(gè)組合分子標(biāo)記篩選攜帶抗PVY 基因，與人工接種鑒定結(jié)果100%吻合，其余5 個(gè)組合出現(xiàn)不同比例假陽(yáng)性預(yù)測(cè)結(jié)果（表3），可能是由于基因與分子標(biāo)記發(fā)生了重組，而71.43%未攜帶標(biāo)記的株系表現(xiàn)出抗病性狀即假陰性。Ottoman 等（2009）的研究結(jié)果表明，接種后取樣時(shí)間對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響比較大，接種后20 d 取樣檢測(cè)，僅46%的樣本兩種檢測(cè)結(jié)果相對(duì)應(yīng)，即含有抗性基因分子標(biāo)記的樣本ELISA 檢測(cè)呈陰性，而不含有抗性基因分子標(biāo)記的樣本ELISA 檢測(cè)呈陽(yáng)性；接種后40 d 取樣檢測(cè)，86%的樣本在兩種檢測(cè)中表現(xiàn)一致。本試驗(yàn)的取樣時(shí)間為接種后3 周（即21 d），因此，可能取樣時(shí)間偏早導(dǎo)致分子標(biāo)記鑒定結(jié)果與人工接種后ELISA 鑒定結(jié)果偏差稍大。除此之外，本試驗(yàn)對(duì)感病的判定標(biāo)準(zhǔn)較為嚴(yán)格，3 個(gè)重復(fù)中有1 個(gè)重復(fù)檢測(cè)出感病即判定該樣本不抗病，因此盡管Ry和Ry對(duì)所有PVY 株系都具有抗性，但仍有攜帶抗性標(biāo)記的個(gè)體檢測(cè)出感病。本試驗(yàn)共接種鑒定179個(gè)株系，其中含有分子標(biāo)記的樣本（165 個(gè)）是不含有分子標(biāo)記樣本數(shù)目（14 個(gè)）的近12 倍，且人工接種鑒定結(jié)果與分子標(biāo)記結(jié)果一致的比例達(dá)到92.73%，即153 個(gè)樣本含有分子標(biāo)記，同時(shí)也確實(shí)表現(xiàn)出抗病性，符合本試驗(yàn)的設(shè)想，即可以通過(guò)分子標(biāo)記篩選抗PVY 的材料。

產(chǎn)量評(píng)價(jià)中，9 個(gè)雜交組合后代的平均單株結(jié)薯數(shù)偏少，為3.28～5.26 個(gè)，平均單株產(chǎn)量偏低，為0.27～0.35 kg，且不同年份間產(chǎn)量變化比較大，平均變異系數(shù)分別為0.57 和0.68。究其原因主要為美國(guó)資源材料偏早熟且晚疫病抗性比較差，而云南大春生產(chǎn)季晚疫病高發(fā)，盡管田間管理時(shí)對(duì)晚疫病嚴(yán)格防控，但是部分株系仍在未達(dá)到最佳產(chǎn)量前死亡而導(dǎo)致減產(chǎn)或絕收。本試驗(yàn)從372 個(gè)株系中篩選出10 份產(chǎn)量較高、抗性較好的資源材料，可為抗PVY 和薯?xiàng)l加工型馬鈴薯新品種選育提供優(yōu)良的親本材料。