植物乳桿菌-Gm4 發(fā)酵制備酸面團(tuán)粉的工藝優(yōu)化

張國華，賀霞霞，衛(wèi)曉蓉，趙明利，張?jiān)窖?/p>

（山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原 030006）

酸面團(tuán)（Sourdough）是以谷物加工產(chǎn)物、水為主要原料，接種微生物，經(jīng)培養(yǎng)、發(fā)酵等工藝制成的產(chǎn)品[1]，其作為世界范圍內(nèi)的傳統(tǒng)發(fā)酵劑具有悠久的歷史[2]，在歐洲不同的國家被分別稱為“Sourdough”、Lievitonaturale（意大利）、Levain（法國）、Sauerteig（德國）、Masa madre（西班牙）等，主要用于培烤食品。在我國，一般被稱為老面、酵子、面肥等，主要用作面食發(fā)酵。

酸面團(tuán)是一種多菌種復(fù)合發(fā)酵劑，具有改善發(fā)酵面制品的風(fēng)味[3]、延長貨架期[4]、延緩老化[5]、提高面制品的營養(yǎng)價(jià)值[6?9]等作用，主要分為三種類型：自然發(fā)酵型酸面團(tuán)、接種發(fā)酵型酸面團(tuán)和混合型酸面團(tuán)[10]。李曉敏等[11]利用高通量測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)酸面團(tuán)中的優(yōu)勢菌群有乳桿菌屬、乳球菌屬、魏斯氏菌屬及酵母屬等。MICHEL 等[12]的研究也得出相似結(jié)論，酸面團(tuán)中的優(yōu)勢菌種以乳酸菌和酵母菌為主[13]，HAMMESW 等[14]的研究證明植物乳桿菌是酸面團(tuán)中典型的發(fā)酵菌種。不同的菌種在面團(tuán)發(fā)酵過程中所起到的作用不同[15]，植物乳桿菌能優(yōu)化面團(tuán)的流變學(xué)性質(zhì)[16?17]、提高面團(tuán)的拉伸性能[18?19]、增加面團(tuán)的烘焙體積[20]及延長面制品的貨架期[21]。植物乳桿菌利用糖類和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生某些風(fēng)味物質(zhì)的重要前體[22?23]，如小肽、游離氨基酸等，以及豐富的有機(jī)酸[24]，作為酸味劑賦予食品獨(dú)特風(fēng)味[25]。此外，廖蘭等[26]的研究表明植物乳桿菌B02012 可以改變酸面團(tuán)小麥的蛋白結(jié)構(gòu)，并可應(yīng)用于低敏發(fā)酵谷物制品的加工中。

國外相關(guān)研究表明在酸面團(tuán)中接種乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵可延長其保質(zhì)期，使酸面團(tuán)易于儲存和運(yùn)輸，已被廣泛應(yīng)用于面包工業(yè)中[27]。相比之下，國內(nèi)傳統(tǒng)酸面團(tuán)的生產(chǎn)以家庭或小作坊自制為主[28]，由于缺少酸面團(tuán)的相關(guān)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)，目前尚未有工業(yè)化生產(chǎn)的酸面團(tuán)產(chǎn)品[29]。因此，實(shí)現(xiàn)優(yōu)良菌種和新型發(fā)酵改良劑的工業(yè)化生產(chǎn)，對推進(jìn)我國傳統(tǒng)發(fā)酵面食改良劑的工業(yè)化進(jìn)程具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[30]。

本研究以實(shí)驗(yàn)室保藏的植物乳桿菌-Gm4（Lactobacillus plantarum-Gm4, LP-Gm4）為研究對象，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化植物乳桿菌發(fā)酵酸面團(tuán)粉（簡稱酸粉）制備工藝，以期為開發(fā)適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的發(fā)酵面食改良劑提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LP-Gm4 保藏于山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；mMRS培養(yǎng)基：麥芽糖20 g、蛋白胨10 g、牛肉浸粉10 g、酵母粉5 g、乙酸鈉5 g、檸檬酸三銨2 g、磷酸氫二鉀2 g、硫酸鎂0.2 g、硫酸錳0.05 g、吐溫80 1 mL、蒸餾水1000 mL、pH（5.4±0.1）；五得利金特精高筋小麥粉 五得利面粉集團(tuán)；燕牌高活性干酵母 樂斯福管理（上海）有限公司。

LY01-3 厭氧培養(yǎng)箱 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；CF340C 卡士發(fā)酵箱 中山卡士電器有限公司；HMJ-A35A1 小熊和面機(jī) 佛山市小熊廚房電器有限公司；JYS-A800 絞肉機(jī) 九陽股份有限公司；DHG-9240A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SC-3614 低速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；雷磁pHS-3C pH 計(jì) 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 LP-Gm4 菌株活化 挑取斜面保藏的LP-Gm4，接種至10 mL 無菌mMRS 液體培養(yǎng)基中，將其于32 ℃厭氧培養(yǎng)活化24 h。按1%的接種量接種于無菌mMRS 液體培養(yǎng)基中，厭氧培養(yǎng)得到LP-Gm4 發(fā)酵液，4500 r/min 離心5 min 收集沉淀得LP-Gm4 菌。

1.2.2 LP-Gm4 酸面團(tuán)的制作 用無菌蒸餾水清洗LP-Gm4 菌兩次得菌懸液。將小麥粉、LP-Gm4 菌懸液和無菌蒸餾水按比例加入和面機(jī)中，和面10 min，保證面團(tuán)得率[31]（D（%）=100×（面粉質(zhì)量+水質(zhì)量）/面粉質(zhì)量）為150%。手工揉制3~5 min 保證面團(tuán)呈表面光滑，置于發(fā)酵箱，在相對濕度80%、選定的時(shí)間和溫度條件下發(fā)酵。

1.2.3 LP-Gm4 酸面團(tuán)制備工藝的單因素實(shí)驗(yàn) 以LP-Gm4 酸面團(tuán)的pH 和總可滴定酸度（total titratable acidity，TTA）值為指標(biāo)，設(shè)定LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發(fā)酵時(shí)間為12 h，探究發(fā)酵溫度（20、25、30、35、40 ℃）對LP-Gm4 酸面團(tuán)品質(zhì)的影響；設(shè)定LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發(fā)酵溫度為30 ℃，探究發(fā)酵時(shí)間（8、12、16、20、24 h）對LP-Gm4 酸面團(tuán)品質(zhì)的影響；設(shè)定發(fā)酵時(shí)間為12 h，發(fā)酵溫度為30℃，探究LP-Gm4 添加量（6、7、8、9、10 lg（CFU/g）小麥粉）對LP-Gm4 酸面團(tuán)品質(zhì)的影響。

1.2.4 LP-Gm4 酸面團(tuán)制備工藝的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和LP-Gm4 添加量（C）為自變量，以LP-Gm4 酸面團(tuán)的TTA 值（R）為響應(yīng)值進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平如表1 所示。

表1 響應(yīng)面實(shí)試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor and level design

1.2.5 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉制備方法 采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化后的工藝參數(shù)制備LP-Gm4 酸面團(tuán)，將其揉搓成小塊后置于篦上，放置到電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中35 ℃干燥6 h，再絞肉機(jī)碎制成LP-Gm4 發(fā)酵酸粉過40 目篩。

1.2.6 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭的制作方法 LP-Gm4發(fā)酵酸粉饅頭的制作配方見表2，參考陳友磊等[32]的方法，將小麥粉、LP-Gm4 發(fā)酵酸粉、高活性干酵母、水按配方加入和面機(jī)攪拌10 min，手工揉制3~5 min 至面團(tuán)表面光滑完整，將饅頭坯置于相對濕度80%、發(fā)酵溫度35 ℃的醒發(fā)箱中醒發(fā)40 min，隨后汽蒸25 min 即得饅頭樣品，樣品于室溫冷卻后裝袋密封。

表2 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭配方Table 2 Formula of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.2.7 指標(biāo)測定

1.2.7.1 LP-Gm4 活菌數(shù)的測定 參考GB 4789.35-2016 食品微生物學(xué)乳酸菌檢驗(yàn)的操作步驟，在無菌環(huán)境下取1 mL LP-Gm4 培養(yǎng)液于裝有9 mL 滅菌蒸餾水的試管中，梯度稀釋至10?9濃度，選取3 個(gè)適宜濃度的稀釋液，各吸取100 μL 分別涂布至mMRS固體培養(yǎng)皿上，將培養(yǎng)基于35 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h 后計(jì)菌落數(shù)，每個(gè)梯度做3 個(gè)平行。

1.2.7.2 LP-Gm4 酸面團(tuán)的酸度測定 參考ZHANG等[33]的方法，測定pH 和TTA。準(zhǔn)確稱取10.0 g LP-Gm4 酸面團(tuán)樣品，加入少量無二氧化碳水，用磁力攪拌器中速攪拌10 min 后用無二氧化碳水轉(zhuǎn)移至100 mL 容量瓶中定容至100 mL。以pH 計(jì)測定所得樣液即LP-Gm4 酸面團(tuán)pH，每份樣品平行測定3 次。

那么，在鄭大一附院，護(hù)理部是如何從最初發(fā)現(xiàn)問題所在，到進(jìn)行頭腦風(fēng)暴，將創(chuàng)新思維融入其中的呢？這一模式兩年蛻變的點(diǎn)滴均值得一探究竟。

以0.1 mol/L 的NaOH 標(biāo)準(zhǔn)溶液將上述樣液滴定至pH 為8.2，記消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的數(shù)值為V1，用無菌水代替試液進(jìn)行空白實(shí)驗(yàn)，重復(fù)上述操作，記空白試液消耗標(biāo)準(zhǔn)溶液體積的數(shù)值為V2。樣品中TTA 用乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)X 表示，數(shù)值以克每千克（g/kg）表示。根據(jù)以下公式計(jì)算TTA 值，計(jì)算結(jié)果保留一位小數(shù)，每份樣品平行測定3 次。

1.2.7.3 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉理化及微生物指標(biāo)的測定

在無菌環(huán)境中稱取25 g LP-Gm4 發(fā)酵酸粉置于滅菌錐形瓶中，加入225 mL 蒸餾水并用磁力攪拌器攪拌10 min。最后參照 1.2.7.1 進(jìn)行稀釋涂布并計(jì)菌數(shù)，并參照GB 5009.3-2016 食品中水分的測定中的直接干燥法測定LP-Gm4 發(fā)酵酸粉中的水分含量，參照 1.2.7.2 測定pH 和TTA 值。

1.2.7.4 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭的感官評價(jià) 參考張國華等[34]的感官評定方法，遴選6 名（男女各半）食品專業(yè)的成員組成評定小組，對LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭進(jìn)行感官評價(jià)，滿分為100 分，實(shí)驗(yàn)三次重復(fù)后取均值。LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭的感官評分標(biāo)準(zhǔn)見表3。

表3 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭感官評分標(biāo)準(zhǔn)Table 3 Sensory scoring criteria of LP-Gm4 sourdough powder steamed bread

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2019 及Origin 2021 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和圖表繪制，采用Design Expert 8.0.6 進(jìn)行響應(yīng)面分析，數(shù)據(jù)顯著性分析利用ANOVA 進(jìn)行，P＜0.05 判斷差異顯著，P＜0.01 判斷差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 發(fā)酵溫度對LP-Gm4 酸面團(tuán)pH 和TTA 值的影響 在LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發(fā)酵時(shí)間為12 h 的條件下，不同發(fā)酵溫度對LP-Gm4酸面團(tuán)pH 和TTA 值的影響見圖1。隨著溫度的升高，LP-Gm4 酸面團(tuán)的pH 先迅速降低，到達(dá)最低值3.65 后緩緩升高；TTA 值則先迅速升高，達(dá)到最高值9.3 后緩慢降低。二者的拐點(diǎn)都出現(xiàn)在發(fā)酵溫度為30 ℃時(shí)，可能是由于植物乳桿菌的最適溫度在30 ℃[35]，發(fā)酵溫度較低時(shí)LP-Gm4 活動(dòng)受到抑制，生長緩慢，面團(tuán)發(fā)酵不充分，產(chǎn)酸量不足；當(dāng)發(fā)酵溫度到達(dá)適宜溫度時(shí)，LP-Gm4 生長旺盛，利用糖類和蛋白質(zhì)發(fā)酵大量產(chǎn)酸；而隨著發(fā)酵溫度的持續(xù)升高，LPGm4 的活性降低。因此，選擇28~32 ℃的溫度范圍進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖1 發(fā)酵溫度對 LP-Gm4 酸面團(tuán) pH 和 TTA 值的影響Fig.1 Effect of fermentation temperature on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

2.1.2 發(fā)酵時(shí)間對LP-Gm4 酸面團(tuán)pH 和TTA 值的影響 在LP-Gm4 添加量為9 lg（CFU/g）小麥粉、發(fā)酵溫度為30 ℃的條件下，發(fā)酵時(shí)間對LP-Gm4 酸面團(tuán)pH 和TTA 值的影響，見圖2。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，LP-Gm4 酸面團(tuán)的pH 有遞減趨勢，TTA 值呈現(xiàn)遞增趨勢。在發(fā)酵8~12 h 時(shí)，LP-Gm4 產(chǎn)酸速度最快；隨后LP-Gm4 酸面團(tuán)的pH 緩慢降低，TTA 值略有升高。這可能是由于隨著時(shí)間的延長，有機(jī)酸等代謝產(chǎn)物逐漸積累，LP-Gm4 自身的生長受到抑制。因此，結(jié)合曲線變化趨勢，考慮經(jīng)濟(jì)性，選擇發(fā)酵時(shí)間在10~14 h 范圍內(nèi)，每間隔2 h 選擇實(shí)驗(yàn)點(diǎn)進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

圖2 發(fā)酵時(shí)間對 LP-Gm4 酸面團(tuán) pH 和 TTA 值的影響Fig.2 Effect of fermentation time on pH and TTA value of LP-GM4 sourdough

圖3 LP-Gm4 添加量對 LP-Gm4 酸面團(tuán) pH 和 TTA 值的影響Fig.3 Effect of LP-Gm4 added amount of bacteria on pH and TTA value of LP-Gm4 sourdough

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析 在三組單因素實(shí)驗(yàn)確定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken 原理選擇發(fā)酵溫度（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）和LP-Gm4 添加量（C）作為自變量，以LP-Gm4 酸面團(tuán)的TTA 值（R）為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平的優(yōu)化試驗(yàn)共17 個(gè)。響應(yīng)面數(shù)據(jù)結(jié)果見表4。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Response surface experimental design and results

通過對表4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以LP-Gm4 酸面團(tuán)的TTA 值為響應(yīng)值的擬合方程 Y=10.10+0.16A+0.90B+5.86C+0.55AB+1.48 AC+0.50BC+0.01A2?0.86B2+1.71C2。對模型進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，結(jié)果見表5。模型方差分析表明，該模型P＜0.0001，模型極顯著；失擬項(xiàng)P值>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明該方程擬合程度較好。模型總決定系數(shù)R2=0.9780，校正決定系數(shù)=0.9497，說明此模型可以解釋94.97%的響應(yīng)值變化，自變量選擇合適，可用來預(yù)測LP-Gm4 酸面團(tuán)的TTA 值，具有較高的可信度和可行性。

表5 Box-Behnken 二次回歸模型方差分析Table 5 Analysis of variance of Box-Behnken quadratic regression model

由F值檢驗(yàn)可獲得影響LP-Gm4 酸面團(tuán)TTA值的主次因素為：LP-Gm4 添加量（C）>發(fā)酵時(shí)間（B）>發(fā)酵溫度（A）。其中，一次項(xiàng)B、C，二次項(xiàng)C2和交互項(xiàng)AC 對LP-Gm4 酸面團(tuán)的TTA 值影響顯著（P＜0.05），而一次項(xiàng)A，二次項(xiàng)A2、B2和交互項(xiàng)AB、BC 對響應(yīng)值的影響不顯著（P>0.05）。由此可知，各實(shí)驗(yàn)因素對LP-Gm4酸面團(tuán)的TTA 值的影響比較復(fù)雜，不是簡單的線性關(guān)系。

2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析 使用Design Expert 8.0.6 軟件對發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度和LP-Gm4 添加量三因素及其之間的交互作用進(jìn)行分析得到相應(yīng)的響應(yīng)面。交互作用的顯著性可以由等高線的形狀呈現(xiàn)出來，即趨于橢圓交互作用強(qiáng)，趨于圓形則相反[37]。由圖4 可知，發(fā)酵溫度（A）與LP-Gm4 添加量（C）之間的交互作用對LP-Gm4 酸面團(tuán)TTA 值的影響最大（圖4-c），發(fā)酵時(shí)間（B）和LP-Gm4 添加量（C）之間的交互作用對LP-Gm4 酸面團(tuán)TTA 值的影響最?。▓D4-b）。在適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵時(shí)間和溫度下，添加較高比例的LP-Gm4，面團(tuán)TTA 值增長較快，這與單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

圖4 各因素之間的交互作用對 LP-Gm4 酸面團(tuán) TTA 值的影響Fig.4 Influence of interaction of various factors on TTA value of LP-GM4 sourdough

2.2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果驗(yàn)證 如前所述，有機(jī)酸過多的積累會(huì)抑制菌株的生長、降低面團(tuán)的品質(zhì)，而且酸澀的口感導(dǎo)致發(fā)酵終產(chǎn)品不被消費(fèi)者接受，故以TTA=20 為目標(biāo)值，根據(jù)回歸模型預(yù)測植物乳桿菌發(fā)酵面團(tuán)的最佳發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度31.76 ℃、發(fā)酵時(shí)間13.44 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉，預(yù)測LP-Gm4 酸面團(tuán)TTA 值為20。考慮實(shí)際操作的簡便性，將各參數(shù)修正為發(fā)酵溫度31.8 ℃、發(fā)酵時(shí)間13.5 h、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉，在此優(yōu)化條件下進(jìn)行3 次重復(fù)性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，實(shí)際測得LP-Gm4 酸面團(tuán)TTA 值的平均值為20.1，與預(yù)測值之間沒有顯著性差異，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合良好，通過響應(yīng)面法優(yōu)化得到的最佳工藝參數(shù)可靠性高。

2.2.4 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉理化及微生物指標(biāo)測定經(jīng)工藝優(yōu)化后制得的LP-Gm4 發(fā)酵酸粉微酸且?guī)в行←溝銡猓谧匀还庀鲁尸F(xiàn)淡黃色，其理化及微生物指標(biāo)如表6 所示。

表6 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉理化及微生物指標(biāo)Table 6 Physicochemical and microbial indices of LP-Gm4sourdough powder

2.2.5 饅頭感官評定分析 使用優(yōu)化參數(shù)制備的LP-Gm4 發(fā)酵酸粉制作饅頭，經(jīng)評定小組品評打分后繪得感官評定雷達(dá)圖（圖5）。在4 組實(shí)驗(yàn)樣品中，添加了LP-Gm4 發(fā)酵酸粉的饅頭感官評分優(yōu)于未添加LP-Gm4 發(fā)酵酸粉的干酵母饅頭。且當(dāng)LP-Gm4發(fā)酵酸粉添加量為1:8（實(shí)驗(yàn)組2）時(shí)，饅頭的感官評分最高。由圖5 可直觀看出LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭在表皮結(jié)構(gòu)、內(nèi)部彈性、口感、滋味和氣味上明顯優(yōu)于干酵母饅頭，而在表皮色澤和內(nèi)部組織上與干酵母饅頭差異不明顯。

圖5 LP-Gm4 發(fā)酵酸粉饅頭感官評分雷達(dá)圖Fig.5 Sensory score radar map of LP-GM4 sourdough powder steamed bread

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面試驗(yàn)確定影響LP-Gm4酸面團(tuán)TTA 值的主次因素為：LP-Gm4 添加量>發(fā)酵時(shí)間>發(fā)酵溫度。最佳工藝參數(shù)為：發(fā)酵時(shí)間13.5 h、發(fā)酵溫度31.8 ℃、LP-Gm4 添加量10 lg（CFU/g）小麥粉。此條件下制得的LP-Gm4 發(fā)酵酸粉具備較好的理化特性，其pH 為3.51，TTA 值為17.8，LP-Gm4菌數(shù)為7.2×108CFU/g。當(dāng)LP-Gm4 發(fā)酵酸粉添加量為1:8 時(shí)，饅頭的感官評分高達(dá)89.9，相比干酵母饅頭具有更光滑完整的表皮結(jié)構(gòu)、更細(xì)膩均勻的內(nèi)部結(jié)構(gòu)、更濃郁的麥香味和老面饅頭獨(dú)有的發(fā)酵香味。