不同葡萄廢果組成對(duì)厭氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化活性物質(zhì)的影響

趙崢，周德平，褚長彬，王慶峰，吳淑杭

（上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境保護(hù)研究所，上海 201403）

農(nóng)業(yè)廢棄物的資源化循環(huán)利用是近年來國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)問題[1-2]。以果蔬廢棄物、畜禽糞便和秸稈等農(nóng)業(yè)廢棄物為原材料，通過堆肥或發(fā)酵的方式實(shí)現(xiàn)其資源化循環(huán)利用，是目前處理農(nóng)業(yè)廢棄物的主要手段[3-4]。水果廢棄物是一種潛力巨大的農(nóng)業(yè)可再生資源，其水分含量高，同時(shí)富含各類多糖、纖維素以及營養(yǎng)元素，是用于發(fā)酵制備或提取各類增值產(chǎn)物的理想原材料[5]。例如，可利用水果廢棄物為原材料，在低溫條件下添加酵母菌進(jìn)行發(fā)酵來制備果膠酶[6]；以香蕉廢棄物和柑橘皮等為主要原料，通過添加酵母菌促進(jìn)發(fā)酵并優(yōu)化發(fā)酵參數(shù)，在制備生物酒精方面具有較大潛力[7-8]；而在添加真菌的條件下進(jìn)行蘋果和葡萄廢棄物的混合發(fā)酵則可用于酚類抗氧化劑的制備[9]。此外，相關(guān)研究表明釀酒副產(chǎn)物葡萄皮渣也是一種重要的可再利用資源，將其在不同條件下進(jìn)行二次發(fā)酵可用于花青素和琥珀酸等活性物質(zhì)的提取[10-11]，以及生物炭和生物肥料等農(nóng)業(yè)增值產(chǎn)品的制備[12]。然而，目前有關(guān)葡萄廢棄物的研究多集中于葡萄加工過程產(chǎn)生的葡萄皮渣的再利用，而關(guān)于葡萄生產(chǎn)過程中所產(chǎn)生的葡萄鮮果廢棄物再利用方面的研究則報(bào)道較少。

葡萄是上海郊區(qū)主要栽培的果樹樹種之一，種植面積約為5 267 hm2，約占上海果樹總種植面積的1/4[13]。前期調(diào)查表明，上海郊區(qū)葡萄生產(chǎn)過程中產(chǎn)生的廢果量較大，某些葡萄園中廢果率可超過當(dāng)季葡萄總產(chǎn)量的30%，給果農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。這些葡萄殘次果多因惡劣的天氣條件（雨水較多）、病蟲害以及田間管理（疏花疏果等）而產(chǎn)生，由于達(dá)不到銷售標(biāo)準(zhǔn)，殘次果通常被直接丟棄在葡萄園中，這不僅是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)資源的浪費(fèi)，同時(shí)也極易滋生病蟲害并導(dǎo)致傳播，進(jìn)而影響葡萄的清潔高效生產(chǎn)[14]。葡萄生產(chǎn)因其較大的種植面積和較高的經(jīng)濟(jì)效益，在上?，F(xiàn)代都市農(nóng)業(yè)中具有非常重要的地位。因此，探索一種環(huán)保高效的葡萄廢果資源化循環(huán)利用技術(shù)，是目前上海葡萄產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展亟需解決的問題。

本研究以上海郊區(qū)規(guī)模化葡萄園產(chǎn)生的鮮葡萄廢果為原材料，通過添加原位分離的酵母菌進(jìn)行厭氧發(fā)酵，同時(shí)分析含有葡萄皮和籽粒是否會(huì)對(duì)發(fā)酵過程及發(fā)酵產(chǎn)物活性物質(zhì)成分組成產(chǎn)生影響，以為發(fā)酵產(chǎn)物的后續(xù)應(yīng)用及相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支撐，也為葡萄廢果的資源化循環(huán)利用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 葡萄廢果

本研究所用的葡萄廢果原材料由上海馬陸葡萄主題公園提供。馬陸葡萄主題公園位于上海葡萄主產(chǎn)區(qū)——嘉定區(qū)，是上海郊區(qū)最具代表性的葡萄規(guī)模化生產(chǎn)基地。該葡萄園每年夏天由于達(dá)不到銷售標(biāo)準(zhǔn)而產(chǎn)生的葡萄廢果約占葡萄總產(chǎn)量的20%～30%，這些葡萄廢果通常仍具有較好的品質(zhì)，是進(jìn)行葡萄廢果發(fā)酵的良好原材料。2018 年8 月在葡萄園收集葡萄廢果50 kg，帶回實(shí)驗(yàn)室后剔除其中的枝干和雜物等，用水清洗干凈后手工捏碎，使其在發(fā)酵過程中更易于分解。

1.2 菌種

本研究以酵母菌作為啟動(dòng)菌種來提高葡萄廢果的發(fā)酵效率，所接種的酵母菌分離自馬陸葡萄園中的葡萄廢果堆積點(diǎn)，經(jīng)鑒定為魯氏酵母（CGMCC16260）。發(fā)酵前將魯氏酵母在平板上進(jìn)行活化培養(yǎng)，挑取單菌落接種到Y(jié)PD 肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)18 h，之后在37 ℃厭氧條件下再次傳代培養(yǎng)18 h，獲得菌種活力較高的魯氏酵母菌液備用。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期研究中發(fā)現(xiàn)，葡萄廢果經(jīng)過2～3 個(gè)月的厭氧發(fā)酵后葡萄皮和籽粒較難被分解，因此，本研究共設(shè)置了兩種處理，用于考察不同葡萄廢果成分（是否含有葡萄皮和籽粒）對(duì)發(fā)酵過程及發(fā)酵產(chǎn)物的成分組成的影響。具體實(shí)驗(yàn)處理為：T1 處理，發(fā)酵底物為前處理好的葡萄廢果全部成分，包含葡萄的果肉、皮和籽粒；T2 處理，剔除葡萄皮和葡萄籽，僅用葡萄果肉進(jìn)行發(fā)酵；兩種處理均設(shè)置3 次重復(fù)，其他發(fā)酵條件相同。發(fā)酵的基本流程為：將1.5 kg 處理好的葡萄廢果放入6 L 發(fā)酵桶中；加入0.5 kg 紅糖作為微生物的碳源；向發(fā)酵桶中補(bǔ)充蒸餾水至5 L；調(diào)整發(fā)酵體系的pH 值至4.50；將200 mL 酵母菌培養(yǎng)液接種到發(fā)酵桶中，攪拌均勻后開始發(fā)酵。發(fā)酵桶蓋上裝有單向排氣閥，以便于發(fā)酵過程中產(chǎn)生氣體的排出，同時(shí)保證厭氧的發(fā)酵環(huán)境。發(fā)酵第一周，每日打開1 次發(fā)酵桶蓋，攪拌均勻以促進(jìn)排氣，防止發(fā)酵桶中產(chǎn)氣過剩發(fā)生爆裂；一周后每周打開1 次發(fā)酵桶蓋進(jìn)行攪拌，直至發(fā)酵結(jié)束（約2個(gè)月）。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物成分分析

在發(fā)酵過程中，每周測(cè)定發(fā)酵體系的pH 值和電導(dǎo)率（EC）值，其中pH值用pH計(jì)（Mettler Toledo FE20）測(cè)定，EC值用EC計(jì)（MettleR Toledo FE30）測(cè)定。發(fā)酵結(jié)束后，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸、主要陰陽離子以及其他有效物質(zhì)的含量。其中，游離氨基酸含量采用全自動(dòng)高速氨基酸分析儀測(cè)定（日本，Hitachi）；主要陰陽離子含量采用離子色譜儀測(cè)定（德國，Thermo Fisher）；有效氮含量采用堿性水解擴(kuò)散法測(cè)定；總酚含量采用福林比色法測(cè)定；總酸含量采用酸堿滴定法測(cè)定。發(fā)酵前，對(duì)底物的相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，用于分析發(fā)酵前后的性狀差異。T1和T2處理發(fā)酵前的總游離氨基酸含量分別為85.32μg·mL-1和103.87μg·mL-1，有效氮含量分別為85.41 mg·L-1和78.33 mg·L-1，總酚含量分別為405.51 mg·L-1和397.98 mg·L-1，總酸含量分別為86.12 g·kg-1和73.45 g·kg-1。

1.5 數(shù)據(jù)分析

兩處理之間的顯著性差異檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)在0.05水平進(jìn)行（SPSS Statistics 23）；圖表采用Origin 9.0繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵過程中pH值和EC值的動(dòng)態(tài)變化

pH 值是影響發(fā)酵過程的關(guān)鍵因素，同時(shí)也是反映發(fā)酵活躍程度的重要指標(biāo)。不同葡萄廢果成分發(fā)酵過程中pH 值的動(dòng)態(tài)變化如圖1 所示，兩種處理的pH 值動(dòng)態(tài)變化規(guī)律基本一致，均在第1 周急劇下降，然后緩慢升高，在第6周后趨于穩(wěn)定。在發(fā)酵前2周，兩種處理的pH 值較為接近，第2 周后含有葡萄皮和葡萄籽的T1 處理的pH 值明顯低于僅含葡萄果肉的T2處理。在發(fā)酵第4周，T1和T2處理的pH 值分別為3.81 和4.10，而 在 第8 周，二者分別穩(wěn)定在3.95 和4.12。與pH 值的變化規(guī)律不同，葡萄廢果發(fā)酵過程中EC 值的動(dòng)態(tài)變化呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)（圖2），在整個(gè)發(fā)酵過程中，T1 和T2 處理EC 值的差異較小。在發(fā)酵的第2 周，T1 和T2 處理的EC 值達(dá)到峰值，分別為5.22 mS·cm-1和4.91 mS·cm-1，之后急劇下降，從第3 周開始分別穩(wěn)定在3.50 mS·cm-1和3.28 mS·cm-1左右。

圖1 葡萄廢果發(fā)酵過程pH值的動(dòng)態(tài)變化Figure 1 Dynamic variations of pH value during the fermentation process of grape waste

圖2 葡萄廢果發(fā)酵過程EC值的動(dòng)態(tài)變化Figure 2 Dynamic variations of EC value during the fermentation process of grape waste

2.2 發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量

游離氨基酸是葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中主要的活性成分之一，同時(shí)也是后續(xù)開發(fā)功能性肥料產(chǎn)品的核心指標(biāo)。發(fā)酵產(chǎn)物中16 種游離氨基酸的含量如圖3 所示，去除葡萄皮和籽粒后葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量有明顯提升，與T1 處理相比，T2 處理在13 類游離氨基酸的含量上具有優(yōu)勢(shì)，包括Asp、Thr、Glu、Gly、Val、Cys、Met、Ile、Leu、Phe、g-ABA、Orn 和Lys，其中9類氨基酸含量具有顯著差異（P＜0.05）。T1處理僅在Ser、Ala和Tyr 3類游離氨基酸的含量上具有優(yōu)勢(shì)，其中Ser 的含量顯著高于T2 處理（P＜0.05）。從總游離氨基酸的含量來看，T2 處理比T1 處理高出40.64%；與發(fā)酵前相比，T1 處理的總游離氨基酸含量提升了226.05%，T2處理則提升了276.66%。

圖3 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的含量Figure 3 Free amino acids contents in the fermented products with different grape parts

2.3 發(fā)酵產(chǎn)物中主要離子的含量

無機(jī)鹽離子是植物營養(yǎng)元素的重要來源，發(fā)酵產(chǎn)物中各類離子的含量是決定發(fā)酵產(chǎn)物可再利用價(jià)值的關(guān)鍵。葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中5 種陽離子的含量如圖4 所示，可以看出發(fā)酵產(chǎn)物中K+的含量最高，達(dá)992.41～1 083.33 mg·L-1，而NH+4的含量最低，為10.75～18.89 mg·L-1，兩種處理之間5種陽離子的含量均無顯著差異（P＞0.05）。兩種處理之間5種陰離子的含量如圖5 所示，葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中Cl-的含量最高，為543.46～577.82 mg·L-1，而NO-3的含量最低，為23.01～26.30 mg·L-1。兩種處理之間僅在F-的含量上有顯著差 異，T1 處理（283.43 mg·L-1）顯 著高 于T2 處 理（184.99 mg·L-1）（P＜0.05）。

圖4 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產(chǎn)物中陽離子的含量Figure 4 Positive ions contents in the fermented products with different grape parts

圖5 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產(chǎn)物中陰離子的含量Figure 5 Negative ions contents in the fermented products with different grape parts

2.4 發(fā)酵產(chǎn)物中總有效氮、總酚和總酸的含量

葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中總有效氮、總酚和總酸的含量結(jié)果見圖6，不同葡萄廢果成分的處理在發(fā)酵產(chǎn)物總有效氮的含量上沒有顯著差異，T1 和T2 處理的總有效氮含量較發(fā)酵前分別提高了31.13%和40.75%。T2 處理的發(fā)酵產(chǎn)物中總酚和總酸的含量均顯著低于T1 處理（P＜0.05），與發(fā)酵前相比，T1 處理的總酚和總酸含量分別提高了25.56%和3.08%，而T2 處理則比發(fā)酵前分別降低了10.46%和5.69%。

圖6 不同葡萄廢果成分發(fā)酵產(chǎn)物中總有效氮、總酚和總酸的含量Figure 6 Total available nitrogen，total phenol and total acids contents in the fermented products with different grape parts

3 討論

在厭氧條件下，通過添加有益菌（酵母菌或乳酸菌等）或功能微生物將果蔬及其廢棄物進(jìn)行發(fā)酵，提高發(fā)酵產(chǎn)物中有效成分和活性物質(zhì)的含量，并在不同的領(lǐng)域進(jìn)行應(yīng)用，是目前提高果蔬廢棄物再利用價(jià)值的有效手段[15]。本研究以上海郊區(qū)規(guī)?；咸褕@中產(chǎn)生的葡萄殘次果為原材料，添加原位分離的酵母菌在厭氧條件下進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵產(chǎn)物中具有豐富的游離氨基酸、營養(yǎng)元素、有效氮及酚類物質(zhì)，有較高的再利用價(jià)值，可作為液體肥料在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中施用，是一種葡萄廢果資源化循環(huán)利用的潛在途徑。諸多研究表明，水果廢棄物具有特殊的理化性狀，是通過發(fā)酵進(jìn)行資源化循環(huán)利用的良好原材料。葛瑞宏等[16]以桂圓作為原材料，通過添加保加利亞乳桿菌和嗜酸乳桿菌等制備的桂圓發(fā)酵產(chǎn)物具有良好的抗氧化活性；李杰等[17]以核桃青皮和果蔬廢棄物為原材料制備的發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的超氧化物歧化酶、礦物質(zhì)元素、多酚和黃酮類物質(zhì)；董銀卯等[18]以火龍果為原材料制備的發(fā)酵產(chǎn)物具有很強(qiáng)的抗氧化能力，同時(shí)也含有一定的超氧化物歧化酶、淀粉酶和脂肪酶；馮昕煒等[19]利用釀酒副產(chǎn)物葡萄渣為原料，通過添加酵母菌進(jìn)行二次發(fā)酵，制備的產(chǎn)物中粗蛋白、磷和鈣等營養(yǎng)成分含量大幅度增加，有效提高了葡萄渣的再利用價(jià)值。此外，藍(lán)莓、蘋果和葡萄等也是厭氧發(fā)酵的良好原材料，有研究表明這些水果廢棄物的發(fā)酵產(chǎn)物中含有豐富的有機(jī)酸，如琥珀酸、檸檬酸、蘋果酸和酒石酸等，具有較高的可再利用價(jià)值[20-22]。

不同底物成分是影響果蔬廢棄物發(fā)酵產(chǎn)物活性物質(zhì)成分組成以及進(jìn)一步應(yīng)用的關(guān)鍵因素[23-25]。本研究設(shè)置的兩種實(shí)驗(yàn)處理中，含有葡萄皮和葡萄籽的T1處理發(fā)酵過程的pH值更低，這與發(fā)酵產(chǎn)物中T1處理有更高的總酸含量相符。而去除葡萄皮和葡萄籽的T2 處理發(fā)酵產(chǎn)物中總酚含量降低，這可能與葡萄皮和葡萄籽的主要成分有關(guān)，葡萄皮的主要成分為花青素，同時(shí)其也含有豐富的白藜蘆醇（酚類）[26]，而葡萄籽則以油脂類和蛋白質(zhì)為主，同時(shí)也有一定量的酚類、不飽和脂肪酸以及黃酮類物質(zhì)[27-28]，因此，去除葡萄皮和葡萄籽后勢(shì)必會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)物中總酚含量的降低。與此相反，T2處理的發(fā)酵產(chǎn)物在9種游離氨基酸和總游離氨基酸含量上表現(xiàn)出了顯著優(yōu)勢(shì)，可能是由于葡萄的果肉比果皮和籽粒更易于分解，經(jīng)有益微生物的分解代謝作用后，更多的氨基酸以游離態(tài)的形式被釋放到了發(fā)酵產(chǎn)物中，從而有效提高了游離氨基酸的含量。

此外，葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物中還含有豐富的礦物質(zhì)元素離子，例如Ca2+、Mg2+、K+、Na+、NH+4、NO-3、PO3-4等，這些均是植物生長過程中所需的重要營養(yǎng)元素，因此，將葡萄廢果經(jīng)厭氧發(fā)酵制成肥料產(chǎn)品也具有良好的應(yīng)用前景，這也是本研究的最終目的。相關(guān)研究表明，葡萄酒糟中含有豐富的氮、磷、鉀等營養(yǎng)元素，經(jīng)二次堆積漚制后在葡萄園中施用，不僅能改善土壤結(jié)構(gòu)、產(chǎn)生良好的肥效，同時(shí)對(duì)促進(jìn)葡萄生長和提高果實(shí)品質(zhì)也有明顯作用[29]。葡萄酒糟中也含有豐富的中微量元素，因此可作為功能性產(chǎn)品進(jìn)行開發(fā)利用，作為農(nóng)業(yè)常規(guī)施肥的輔助手段補(bǔ)充土壤中微量元素的虧缺。葡萄酒糟經(jīng)二次發(fā)酵后制成的有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)復(fù)混肥，在經(jīng)濟(jì)作物和大田作物中施用均表現(xiàn)出了良好的效果，優(yōu)于傳統(tǒng)復(fù)合肥和有機(jī)肥，在改善農(nóng)作物產(chǎn)量和品質(zhì)的同時(shí)也具有一定的改土培肥效果[30-31]。然而，這些研究多以葡萄酒渣為原材料進(jìn)行相關(guān)肥料產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用，目前以新鮮葡萄廢果為原料進(jìn)行發(fā)酵研究并制備相關(guān)肥料產(chǎn)品的報(bào)道較少。本研究也僅對(duì)葡萄廢果發(fā)酵產(chǎn)物的成分進(jìn)行了初步分析，為發(fā)酵產(chǎn)物的進(jìn)一步應(yīng)用和相關(guān)產(chǎn)品研發(fā)提供了一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，發(fā)酵產(chǎn)物在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用效果還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

（1）添加酵母菌可顯著提高葡萄廢果厭氧發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)的含量，與發(fā)酵前相比總游離氨基酸含量提高了226.05%～276.66%，總有效氮含量提高了31.13%～40.75%。

（2）不同葡萄廢果成分對(duì)發(fā)酵過程中pH 值的動(dòng)態(tài)變化有一定影響，但對(duì)EC值的變化沒有明顯影響。

（3）去除葡萄皮和籽粒有利于發(fā)酵產(chǎn)物中游離氨基酸的積累，其中9 類游離氨基酸具有顯著優(yōu)勢(shì)，但F-、總酚和總酸的含量顯著降低。