鹽脅迫對于聚球藻PCC 7942大片段DNA刪除突變株的生理效應

許 軼 徐旭東

(1. 中國科學院水生生物研究所, 武漢 430072; 2. 中國科學院大學, 北京 100049)

藍藻(藍細菌)是一類進行放氧光合作用的原核生物, 可利用太陽光能固定CO2, 并利用碳、氮、磷和硫等無機營養(yǎng)合成生命活動所需要的各種有機分子。一些藍藻種類可進行大規(guī)模培養(yǎng), 并具備遺傳操作系統(tǒng), 適合于合成生物學改造[1]。在合成生物學的研究中, 基因組簡化是底盤生物構建的一個重要方面。通過簡化基因組刪除掉在人工培養(yǎng)條件下不需要的基因, 包括響應環(huán)境變化和各類脅迫的復雜系統(tǒng)[2]。藍藻底盤生物的構建同樣需要對基因組開展系統(tǒng)的刪除和改造。

目前大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和鏈霉菌等模式生物均有基因組簡化的報道。譬如, 有人構建了基因組簡化22.2%的大腸桿菌MGF-01, 與野生型菌株相比其生長和蘇氨酸產量都有所提高[3]; 還有人構建了基因組簡化20.7%的枯草芽孢桿菌MBG874,其纖維素酶和蛋白激酶的產量較野生型均獲得提高[4]。由此可見, 通過適當的基因組簡化, 微生物可表現(xiàn)出更好的生產特性, 成為合成生物學理想的底盤細胞。但是也有研究表明, 基因組簡化可導致生長速率減緩, 對生長環(huán)境的適應能力變弱, 遺傳穩(wěn)定性變差。譬如, 有人通過同源重組和P1噬菌體轉導獲得基因組簡化29.7%的大腸桿菌Δ16, 與野生型相比生長減慢, 細胞的長度和寬度發(fā)生改變, 胞內核酸定位異常[5]。還有人獲得基因組刪減達23.5%的枯草芽孢桿菌MG1M, 其生長速率、細胞形態(tài)和重組蛋白產量等性狀均不穩(wěn)定[6]。因此, 對基因組不適當的刪減也可能對生長、代謝及后續(xù)遺傳改造產生不利影響。

本實驗室利用DNA同源重組和基于RNA介導的DNA剪切篩選對聚球藻PCC 7942基因組開展了系統(tǒng)的刪除, 得到了一系列大片段非必需區(qū)域刪除的突變株。在BG11培養(yǎng)條件下, 這些突變株與野生型在生長上無差異, 但測試不同脅迫條件時發(fā)現(xiàn), 鹽度對某些突變株有顯著影響。其中將基因組區(qū)域Synpcc7942_0233-0253和Synpcc 7942_2169-2187分別敲除得到的突變株, 在BG11+0.4 mol/L NaCl培養(yǎng)條件下生長被抑制, 與野生型差異顯著。比較聚球藻PCC 7942和這兩個突變株在鹽脅迫下的光合電子傳遞鏈和呼吸活性的差異, 結果顯示, 這兩個區(qū)域很可能存在適應脅迫所需要的基因。然而, 這些區(qū)域的刪除并不妨礙在非脅迫條件下的生長, 是有利于合成生物學目標實現(xiàn)的。

1 材料與方法

1.1 藻株和培養(yǎng)條件

聚球藻(Synechococcus elongatus)PCC 7942, 由中國科學院青島生物能源所呂雪峰實驗室提供。野生型與突變株均在30℃、30 μE/(m2·s)連續(xù)光照下于BG11中靜置或旋轉搖動培養(yǎng)(轉速為90 r/min),測試鹽脅迫效應時加0.4 mol/L NaCl。通過測定培養(yǎng)物在730 nm的光密度(OD730)來監(jiān)測藻細胞的生長。生長曲線是3個平行培養(yǎng)的測試結果。

1.2 聚合酶鏈式反應(PCR)

PCR反應總體積為20 μL, 其中含10 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3), 50 mmol/L (NH4)2SO4, 2.5 mmol/L MgCl2, 50 μmol/L dNTPs, 引物各100 pmol(引物序列見表 1), DNA模板50 ng, 1UTaqDNA聚合酶(TaKaRa)。反應先經過94℃預變性6min, 之后為30個循環(huán)(94℃ 30s, 58℃ 30s, 72℃ 2min), 最后在72℃再反應7min。

表1 本研究中所用到的引物Tab. 1 Primers used in this study

1.3 藻細胞掃描吸收光譜

取適量野生型和突變株藻液, 在4000 r/min離心3min收集后重懸于新鮮培養(yǎng)液, 調整OD730到相同水平, 再用UV-1601分光光度計(Shimadzu)在400—800 nm波長范圍內掃描測定吸收光譜。分別用BG11和添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基作空白對照, 比色皿的毛玻璃面朝向光源。

1.4 聚球藻PCC 7942總膜的制備

根據文獻[7]所述方法制備聚球藻PCC 7942的總膜。離心收集50 mL藻液, 重懸于1 mL的磷酸鉀緩沖液(20 mmol/L, pH 7.8)。再加入適量的直徑為0.17 mm左右的玻璃珠(Sigma), 在漩渦振蕩器振蕩1min, 然后置于冰上1min, 重復此步驟5次。先后在4000 r/min、6000 r/min 離心10min, 收集上清, 再以35000 r/min超速離心收集總膜, 重懸于2 mL 10 mmol/L NaHCO3(pH 7.0)溶液。

1.5 光合放氧、呼吸耗氧速率的測定

按Gao和Xu描述的方法[7], 具體操作如下: 離心收集2 mL藻細胞(A730=0.5), 重懸于含10 mmol/L NaHCO3的25 mmol/L HEPES(pH 7.0), 先在黑暗條件下用Oxy-Lab氧電極(Hansatech)在30℃條件下測定藻細胞的呼吸耗氧速率, 每個樣品測定時間為5min左右; 打開光源, 光強800 μmol/(m2·s), 測定藻細胞的放氧速率。

利用全細胞測量PSII電子傳遞鏈的活性, 在細胞懸浮液中加入1 mmol/L K3Fe(CN)6和0.5 μmol/L DCBQ(2,6-dichloro-p-benzoquinone), 測定放氧速率。利用總膜測定PSI電子傳遞鏈活性, 在2 mL總膜懸浮液中加入10 μmol/L DCMU[3-(3,4-dichlorophenyl)-l, l-dimethyl urea], 1 mmol/L 抗壞血酸鈉, l mmol/L MV(methyl viologen)和l μmol/L DCPIP(2,6-dichlorophenol-indophenol), 測定耗氧速率。

光合放氧速率/呼吸耗氧速率 [μmol O2/(mg Chl.a)·h]=(斜率×60000)/(13.34×A664)。式中,13.34×A664為葉綠素a含量, 是葉綠素的甲醇提取液在664 nm處的光吸收值。

2 結果

2.1 突變株的檢測驗證

ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187是基因組非必需區(qū)域Synpcc7942_0233-0253(18 kb)和Synpcc7942_2169-2187(14 kb)分別被刪除的聚球藻PCC 7942突變株(基因組系統(tǒng)刪除和簡化過程將另文發(fā)表)。由于藍藻基因組在細胞中存在多拷貝, 我們利用PCR檢測確認突變株中是否仍殘留部分野生型。如圖 1所示, 引物對0233-0253-F′/R′在基因組中相距20.0 kb, 2169-2187-F′/R′相距16.2 kb, 均位于刪除區(qū)域之外, 而0233-0253-2和2169-2187-2位于刪除區(qū)域內。對野生型和突變株進行檢測, 結果如圖 2所示。以引物0233-0253-F′/R′或2169-2187- F′/R′進行PCR檢測, 突變株可擴增出約2.1 kb的條帶, 說明已刪除該區(qū)域。以普通PCR檢測并不能檢測出野生型的20 或16.2 kb條帶, 所以我們還用引物0233-0253-F′/2和2169-2187- F′/2進行PCR, 如果擴增出1.1或者1.2 kb的條帶, 則說明存在野生型拷貝, 但是擴增結果證明并沒有野生型拷貝, 說明突變株確實是完全分離的。

圖1 兩個缺失突變檢測引物在基因組上位置的示意圖Fig. 1 Schematic diagrams showing genomic positions of the primers for detection of deletions

圖2 兩個突變株的PCR檢測結果Fig. 2 PCR examination of 2 mutants

2.2 鹽脅迫下生長的差異

比較突變株ΔSynpcc7942_0233-0253、ΔSynpcc7942_2169-2187與野生型在不同條件下的生長,發(fā)現(xiàn)在BG11中沒有顯著差異或僅有微小差異(圖 3A),但在BG11+0.4 mol/L NaCl中, 突變株的生長相對于野生型被嚴重抑制了(圖 3B)。

圖3 鹽脅迫對聚球藻PCC 7942及突變株生長的影響Fig. 3 Effects of salt stress on the growth of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants

在0和96h兩個時間點掃描藻細胞吸收光譜, 將各樣品在730 nm處調成一致(調整濁度使生物量一致), 結果顯示: 在0時突變株與野生型差異較小(圖 4A),而在鹽脅迫96h后, 突變株的葉綠素(440和680 nm)、藻膽素(630 nm)、類胡蘿卜素(480—490 nm肩峰)吸收峰均明顯低于野生型(圖 4B)。

圖4 聚球藻PCC 7942及突變株以0.4 mol/L NaCl處理0 (A)和96h (B)的整細胞掃描吸收光譜Fig. 4 The whole cell scanning absorption spectra of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants at 0 (A) and 96h (B) after exposure to 0.4 mol/L NaCl

2.3 光合電子傳遞和呼吸活性的分析

進一步檢測鹽脅迫對突變株光合放氧速率的影響, 結果發(fā)現(xiàn)野生型和突變株總體都呈下降趨勢,但2個突變株下降得更快, 96h后分別是野生型的41%和51%(圖 5)。

圖5 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中光合放氧速率Fig. 5 Oxygen evolution rates of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

同時測定突變株與野生型的呼吸速率, 發(fā)現(xiàn)在24h內呼吸耗氧都明顯升高, 隨后野生型逐步降低,而突變株在48h后降低, 至96h仍維持較高水平(圖 6)。

圖6 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中呼吸耗氧速率Fig. 6 Respiratory rates of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

為進一步闡釋鹽脅迫對光合活性的影響, 本研究測量了光系統(tǒng)(PS)Ⅰ和Ⅱ的電子傳遞速率。在鹽脅迫96h后, 野生型PSⅡ電子傳遞反應速率下降了52%, 而ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187分別下降了77%和82%(圖 7); 野生型PSⅠ電子傳遞速率下降了32%, 而ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187分別下降了50%和47%(圖 8)。

圖7 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中PSⅡ電子傳遞反應速率Fig. 7 Rates of PSⅡ electron transfer reactions of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

圖8 聚球藻PCC 7942及突變株在添加0.4 mol/L NaCl的BG11培養(yǎng)基中PSI電子傳遞鏈反應速率Fig. 8 Rates of PSI electron transfer reactions of Synechococcus elongatus PCC 7942 and mutants in BG11 supplemented with 0.4 mol/L NaCl

3 討論

聚球藻PCC 7942有望發(fā)展成為燃料與高價值化學品的生產平臺[8], 其基因組中的必需基因與非必需基因已有系統(tǒng)的鑒定[9]。針對非必需基因區(qū)域開展基因組簡化可以使其遺傳背景簡單化, 提升合成生物學操作的可預測性和可控制性。本實驗室對其大片段非必需區(qū)域開展系統(tǒng)刪除, 并在不同溫度、光強和鹽脅迫等條件下檢查突變株適應能力的變化, 發(fā)現(xiàn)少數區(qū)域的刪除導致耐鹽脅迫能力的降低。

鹽脅迫是最常見的非生物脅迫之一, 通過離子脅迫和滲透脅迫改變代謝過程和光合作用[10]。此外, 鹽脅迫會增加細胞內活性氧(ROS)的含量[11]。在鹽脅迫下細胞產生的ROS抑制轉錄因子活性[12],抑制D1蛋白以及其他光系統(tǒng)相關蛋白的合成, 甚至破壞類囊體膜結構, 使光合作用受阻[13]。聚球藻PCC 7942維持穩(wěn)定生長能耐受NaCl的最高濃度約為0.4 mol/L[14], 而在此濃度的NaCl脅迫下, Synpcc 7942_0233-0253和Synpcc7942_2169-2187區(qū)域刪除突變株的生長被嚴重抑制。整細胞掃描吸收光譜還顯示, 突變株在鹽脅迫下各種色素吸收峰比野生型降低, 可能與光合復合體、藻膽體等結構的破壞有關。在鹽脅迫下, 2個突變株的光合放氧活性均比野生型下降得更快; 進一步測定野生型和突變株PSⅡ和PSⅠ的電子傳遞速率, 觀察到突變株的PSⅡ和PSⅠ都受到更顯著的損害, 尤以PSⅡ更加敏感。實際上, 在更高濃度的NaCl脅迫下(0.5 mol/L), 聚球藻的PSⅡ和PSⅠ均失活[15], 這與本研究觀察到的情況相映證。與光合作用相反, 在鹽脅迫下突變株的呼吸活性比野生型維持在更高水平。這種情況尚未在文獻中有類似報道, 值得進一步研究。光合作用活性比野生型降低, 而呼吸活性比野生型高, 兩相疊加導致突變株在鹽脅迫下合成少、消耗多, 生長受到嚴重抑制。

聚球藻PCC 7942耐受NaCl脅迫主要依賴于蔗糖合成和Na+泵出維持胞內滲透壓平衡。蔗糖的合成涉及基因Synpcc7942_0808, 其產物具有蔗糖磷酸合成酶(SPS)和蔗糖磷酸酶(SPP)結構域[16]。Na+的泵出主要是借助于Na+/H+反向轉運蛋白(Antiporter)和Na+/K+反向轉運蛋白[17], 其中涉及編碼Na+/H+泵的有6個基因, 即napA、nha4、nha1、nha2、nha3和nha6。在突變株ΔSynpcc7942_0233-0253和ΔSynpcc7942_2169-2187缺失的區(qū)域中并沒有這些基因, 但有預測編碼Na+/Ca2+交換轉運蛋白的基因Synpcc7942_0242, 還有預測為Na+/H+交換轉運蛋白的基因nha7(Synpcc7942_2186)[18,19]。這些基因是否參與耐鹽生理效應, 有待實驗證據支持。

基因組簡化既可能提高合成生物學底盤生物的生理和生產性狀, 也可能帶來某些不利影響。因此, 在藍藻基因組簡化的過程中需要保持對生長特性、生理適應性和遺傳穩(wěn)定性的監(jiān)測。本研究報道了兩個非必需基因區(qū)域的刪除導致耐鹽能力降低, 但并不妨礙在非脅迫條件下的生長。這些信息的掌握對于底盤生物基因組的設計和未來生產條件的控制都是需要的。