皂素與十二烷基硫酸鈉對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶直接質(zhì)譜鑒定處理效果的影響

韋國(guó)文，黃麗月

廣西河池市人民醫(yī)院 （廣西 河池 547000）

血流感染是敗血癥和菌血癥的統(tǒng)稱，是由各種病原微生物（細(xì)菌或真菌）及病毒等侵入血液所引起的一類臨床綜合征。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約發(fā)生20萬(wàn)例血流感染，病死率為20%～50%[1]。有研究報(bào)道，血流感染患者抗菌藥物治療每延遲1 h，平均生存率將下降7.6%[2]。近年來(lái)，隨著臨床抗菌藥物、免疫抑制劑、抗腫瘤類藥物及各類創(chuàng)傷性診療手段的應(yīng)用，血流感染的發(fā)病率不斷增高，因其致死率高，危害嚴(yán)重，準(zhǔn)確快速地檢測(cè)血流感染越來(lái)越受到人們的關(guān)注[3-5]。

血培養(yǎng)是通過(guò)采集患者血液標(biāo)本并將其接種到培養(yǎng)瓶中，用以發(fā)現(xiàn)、識(shí)別引起菌血癥或真菌血癥的病原微生物，是診斷菌血癥或真菌血癥的基本且重要的方法[6-7]。近年來(lái)，質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)已被成功用于臨床微生物的鑒定中，且其在細(xì)菌、酵母菌等鑒定方面均具有良好的應(yīng)用價(jià)值[8-9]。由于其在微生物鑒定領(lǐng)域的優(yōu)勢(shì)極大，眾多研究人員開(kāi)始著手進(jìn)行其在血培養(yǎng)病原菌方面的鑒定研究。陽(yáng)性血培養(yǎng)液的組分復(fù)雜，含有多種干擾微生物鑒定的化合物及病原菌生長(zhǎng)代謝物[10]，直接質(zhì)譜鑒定整體準(zhǔn)確率普遍不高[11]，研究人員多采用常規(guī)差速離心法以及加入針對(duì)血培養(yǎng)液的表面活性劑[如皂素[12]、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）[13]等]法進(jìn)行研究。本研究通過(guò)分析對(duì)比皂素、SDS 這兩種實(shí)驗(yàn)室常用表面活性劑對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶直接質(zhì)譜鑒定準(zhǔn)確率的影響，并以傳統(tǒng)鑒定方法為參考，期望找到一種快速而準(zhǔn)確的直接質(zhì)譜鑒定血培養(yǎng)目標(biāo)菌的表面活性劑應(yīng)用方案，以期為感染性疾病的診斷、治療和預(yù)后提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

材料：模擬臨床血培養(yǎng)陽(yáng)性菌出現(xiàn)頻次搜集血培養(yǎng)陽(yáng)性分離菌株共9種56株，菌株詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 菌株信息

試劑：皂素（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），SDS[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]，上機(jī)血培養(yǎng)瓶（安圖生物工程股份有限公司），質(zhì)譜樣品處理基質(zhì)溶液（安圖生物工程股份有限公司），甲酸（上海阿拉丁生化科技股份有限公司），乙腈[西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司]。

1.2 儀器與設(shè)備

BC120自動(dòng)化血培養(yǎng)系統(tǒng)[安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司]，Autof ms1000全自動(dòng)微生物質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)[安圖實(shí)驗(yàn)儀器（鄭州）有限公司]，Sartorius 1-14離心機(jī)（Sigma 公司），微量移液器（Eppendorf 公司）。

1.3 方法

1.3.1 模擬血培養(yǎng)瓶方法

培養(yǎng)活化轉(zhuǎn)接臨床菌株24～72 h，刮取單菌落并使用0.9%氯化鈉注射液制備100 cfu/ml 濃度菌懸液，吸取100 μl 注入血培養(yǎng)瓶，并注入4～5 ml 新鮮羊血，放入全自動(dòng)血培養(yǎng)儀內(nèi)，培養(yǎng)至報(bào)陽(yáng)。

1.3.2 傳統(tǒng)鑒定方法

血培養(yǎng)報(bào)陽(yáng)后，根據(jù)革蘭染色結(jié)果將血培養(yǎng)液轉(zhuǎn)接至血瓊脂平板或沙保羅培養(yǎng)平板上，37 ℃培養(yǎng)12～48 h，待菌落生長(zhǎng)完成挑取1～2個(gè)單菌落均勻涂抹靶板，并覆蓋1 μl 基質(zhì)溶液，采集指紋圖譜并與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行匹配，記錄鑒定結(jié)果與得分[14]。

1.3.3 皂素法直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶

使用超純水配制1%、2%、3%、4%、5%濃度梯度皂素溶液，按皂素溶液濃度梯度設(shè)置5組驗(yàn)證，每組分別于1.5 ml 離心管中先加入1 ml 陽(yáng)性血培養(yǎng)液，然后加入200 μl 不同濃度皂素溶液；充分混勻靜置3～5 min，以500×g 離心10 min，去除上清液，使用1 ml 0.9%氯化鈉注射液重懸沉淀2次，以11 000×g 離心1 min，充分去除上清液并收集沉淀，先加入50 μl 70%甲酸溶液混勻，然后加入50 μl 乙腈混勻，以11 000×g 離心1 min，吸取1 μl 上清液點(diǎn)靶，晾干后覆蓋1 μl 基質(zhì)溶液行質(zhì)譜鑒定。

1.3.4 SDS 法直接鑒定陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶

使用超純水配制1%、2%、3%、4%、5%濃度梯度SDS溶液，按SDS溶液濃度梯度設(shè)置5組驗(yàn)證，每組分別于1.5 ml 離心管中先加入1 ml 陽(yáng)性血培養(yǎng)液，然后加入200 μl 不同濃度SDS 溶液；充分混勻后靜置（10±5）s，以11 000×g 離心2 min，去除上清液，使用1 ml 0.9%氯化鈉注射液重懸沉淀，再次以11 000×g 離心2 min，充分去除上清液，先加入50 μl 70%甲酸溶液混勻，然后加入50 μl 乙腈混勻，以11 000×g 離心1 min，吸取1 μl 上清液點(diǎn)靶，晾干后覆蓋1 μl 基質(zhì)溶液行質(zhì)譜鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 皂素法與傳統(tǒng)鑒定方法的鑒定準(zhǔn)確率比較

本研究共設(shè)置5組實(shí)驗(yàn)組，每組共56份報(bào)陽(yáng)血培養(yǎng)標(biāo)本，包含57%革蘭陽(yáng)性菌、34%革蘭陰性菌及9%酵母類真菌，分別行鑒定準(zhǔn)確率測(cè)定并將其與傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1可知，傳統(tǒng)鑒定方法在血培養(yǎng)的質(zhì)譜鑒定方面有較大的優(yōu)勢(shì)，經(jīng)過(guò)處理的56株模擬陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶成功鑒定52株，準(zhǔn)確率達(dá)92.9%，鑒定時(shí)長(zhǎng)13～49 h（從血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)計(jì)）；皂素溶液的濃度對(duì)鑒定準(zhǔn)確率有顯著的影響，隨著皂素溶液濃度增加，鑒定準(zhǔn)確率增高，到達(dá)4%濃度時(shí)達(dá)到最優(yōu)的鑒定準(zhǔn)確率[82.1%（46/56）]，鑒定耗時(shí)＜1 h（從血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)計(jì)），較傳統(tǒng)鑒定方法節(jié)省了90%以上的時(shí)間，繼續(xù)提高皂素溶液濃度，鑒定準(zhǔn)確率未出現(xiàn)顯著提升，可能是由于皂素中含有的多種植物成分干擾了質(zhì)譜峰的鑒定，以金黃色葡萄球菌為例，通過(guò)對(duì)使用不同濃度皂素溶液進(jìn)行處理后獲取的質(zhì)譜峰圖進(jìn)行對(duì)比（圖2），發(fā)現(xiàn)對(duì)比結(jié)果與鑒定成功率結(jié)果吻合，經(jīng)4%皂素溶液處理后的質(zhì)譜峰圖在基線平穩(wěn)度、峰強(qiáng)度、峰數(shù)量方面均優(yōu)于其他處理方案，因此，4%皂素溶液為較優(yōu)的配比方案。

2.2 SDS 法與皂素法及傳統(tǒng)鑒定方法的鑒定準(zhǔn)確率比較

采用不同濃度的SDS 溶液對(duì)模擬血培養(yǎng)陽(yáng)性的培養(yǎng)液進(jìn)行鑒定處理，并將鑒定結(jié)果與皂素法及傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)圖3。

由圖3可知，低濃度或高濃度的SDS 溶液均不能達(dá)到較好的鑒定效果，在3%濃度時(shí)的鑒定準(zhǔn)確率最高，達(dá)76.8%（43/56），但仍顯著低于皂素溶液最高82.1%的鑒定準(zhǔn)確率，此外，皂素溶液（4%）及SDS 溶液（3%）的鑒定效果與傳統(tǒng)鑒定方法仍存在一定的差距。3種方法的具體鑒定結(jié)果見(jiàn)表2，所選標(biāo)本可分為革蘭陽(yáng)性球菌、革蘭陽(yáng)性桿菌、革蘭陰性桿菌及酵母類真菌，根據(jù)平均鑒定準(zhǔn)確率可分析3種方法在菌株類型方面鑒定的差異（均值越小，差異越大），由表2可知，3種方法在鑒定酵母類真菌時(shí)的差異最大，其次是革蘭陽(yáng)性桿菌及球菌，革蘭陰性桿菌的差異最小，表明SDS 法、皂素法及傳統(tǒng)鑒定方法均能夠很好地鑒定此類菌。

表2 SDS 法與皂素法及傳統(tǒng)鑒定方法的鑒定結(jié)果

大量驗(yàn)證表明，在行陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶直接質(zhì)譜鑒定時(shí)，可將多數(shù)鑒定分值為屬水平的鑒定直接確定為種水平，鑒定得分低的原因可能是血培養(yǎng)液中成分比較復(fù)雜，鑒定結(jié)果受代謝物、雜質(zhì)等的影響。為進(jìn)一步提高鑒定準(zhǔn)確率，我們對(duì)皂素表面活性劑直接用于質(zhì)譜鑒定的評(píng)分規(guī)則進(jìn)行了調(diào)整，按照經(jīng)典評(píng)分規(guī)則，得分＞9.0分為種水平可信，介于6.0～9.0分為屬水平可信，＜6.0分為不可信；評(píng)分規(guī)則優(yōu)化后，對(duì)每個(gè)樣品設(shè)置4個(gè)樣品點(diǎn)，有不少于2個(gè)樣品點(diǎn)鑒定結(jié)果一致且得分≥6.0分即為可信鑒定，優(yōu)化后的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到89.3%（50/56，表2），與傳統(tǒng)鑒定方法的鑒定準(zhǔn)確率比較無(wú)顯著差異，表明經(jīng)過(guò)評(píng)分優(yōu)化后的4%皂素溶液可用于陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的直接質(zhì)譜鑒定，并且可節(jié)省90%以上的鑒定耗時(shí)。

3 討論

血流感染病原菌確診困難及預(yù)后較差等情況一直是困擾臨床醫(yī)患的一大難題，傳統(tǒng)鑒定方法在血培養(yǎng)瓶報(bào)陽(yáng)后一般需經(jīng)過(guò)12～48 h 的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)獲得純菌落后方能進(jìn)一步對(duì)病原菌進(jìn)行分析鑒定[15]，而快速而準(zhǔn)確地鑒定血流感染病原菌可以極大地降低患者病死率，微生物質(zhì)譜技術(shù)——基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption / ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）在臨床上的應(yīng)用為這一難題提供了新的思路[16]。

皂素、SDS 是臨床常見(jiàn)可直接用于陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶質(zhì)譜鑒定前處理的表面活性劑，其作用主要在于裂解血細(xì)胞，釋放微生物菌體，便于后續(xù)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定[17]。由于不同科室及實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境存在差異，使用效果參差不齊，因此，本研究驗(yàn)證了不同濃度的SDS 溶液及皂素溶液的應(yīng)用效果并將其與傳統(tǒng)鑒定方法進(jìn)行了對(duì)比評(píng)估，發(fā)現(xiàn)濃度為3%的SDS溶液對(duì)陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶直接進(jìn)行質(zhì)譜鑒定可獲得較好的鑒定效果，鑒定準(zhǔn)確率達(dá)76.8%，但低于4%皂素溶液的鑒定效果82.1%，表明4%皂素溶液相對(duì)于SDS 溶液擁有更好的病原菌提純效果。為進(jìn)一步提高鑒定準(zhǔn)確率，對(duì)質(zhì)譜評(píng)分規(guī)則進(jìn)行了調(diào)整，定義有不少于2個(gè)樣品點(diǎn)鑒定結(jié)果一致且得分≥6.0分即為可信鑒定，優(yōu)化后4%皂素溶液的鑒定準(zhǔn)確率達(dá)到89.3%，與傳統(tǒng)鑒定方法的鑒定準(zhǔn)確率92.9%比較無(wú)顯著差異，并且整個(gè)前處理過(guò)程耗時(shí)＜1 h，節(jié)省了90%以上的鑒定耗時(shí)，表明經(jīng)過(guò)評(píng)分優(yōu)化后的4%皂素溶液在陽(yáng)性血培養(yǎng)瓶的直接質(zhì)譜鑒定處理方面擁有較好的應(yīng)用前景。