碳[13C]-尿素中基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源分析與去除方法

魏翠雯，陳 凱，陳堅(jiān)明，張旭杰

（深圳市中核海得威生物科技有限公司，廣東深圳 518000）

碳[13C]-尿素的制劑用于呼氣試驗(yàn)診斷幽門螺桿菌感染，幽門螺桿菌是一種可以在胃中生長(zhǎng)的細(xì)菌，可導(dǎo)致胃炎、消化性潰瘍，并與胃癌密切相關(guān)。碳[13C]-尿素生產(chǎn)工藝的一大難點(diǎn)是基因毒性雜質(zhì)的控制，分析碳[13C]-尿素生產(chǎn)過(guò)程中基因毒性雜質(zhì)的來(lái)源和有效去除，對(duì)提升藥品質(zhì)量具有重要意義。

碳[13C]-尿素生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的基因毒性雜質(zhì)包括氨基甲酸甲酯和氨基甲酸乙酯，氨基甲酸甲酯（MC）、氨基甲酸乙酯（EC）分別被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）歸類為3類和2A類致癌物[1]。1943年Nettleship等[2]發(fā)現(xiàn)了氨基甲酸乙酯致癌以來(lái)，人們對(duì)于其致癌機(jī)理和致癌作用不斷地研究和探討[3]，發(fā)現(xiàn)氨基甲酸乙酯在嚙齒類動(dòng)物，如大鼠、小鼠、倉(cāng)鼠、猴子等體內(nèi)均具有致癌性。在人體內(nèi)，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的代謝與嚙齒類動(dòng)物中的代謝途徑是類似的，是一種潛在的致癌物。在生物體內(nèi)，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯能迅速、幾乎完全被腸道、皮膚吸收，會(huì)導(dǎo)致體內(nèi)多位點(diǎn)致癌。

1 碳[13C]-尿素的生產(chǎn)工藝

基于Franz R.A.和Applegath F.的基本原理（有機(jī)化學(xué)（1961），第26卷，第2604-2605頁(yè)），設(shè)計(jì)生產(chǎn)工藝如圖1所示：

圖1 設(shè)計(jì)生產(chǎn)工藝圖

2 碳[13C]-尿素中基因毒性雜質(zhì)產(chǎn)生的機(jī)理分析

Ough[4]在1976年的研究中，發(fā)現(xiàn)尿素與乙醇在室溫條件下反應(yīng)72h會(huì)產(chǎn)生氨基甲酸乙酯，氨基甲酸乙酯的形成不僅與尿素、乙醇的濃度有關(guān)，還與貯藏溫度有較大關(guān)系，也有研究報(bào)道，氨基甲酸乙酯的形成速度與溫度呈線性關(guān)系[5]。

碳[13C]-尿素生產(chǎn)過(guò)程中，在加熱條件下脫出一分子的氨氣轉(zhuǎn)化為中間體A，中間體A化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，在反應(yīng)體系中可能發(fā)生以下副反應(yīng)，如圖2所示：

圖2 碳[13C]-尿素中氨基甲酸酯的形成機(jī)理

（1）在合成反應(yīng)和干燥除硫階段，與甲醇發(fā)生加成反應(yīng)會(huì)生成氨基甲酸甲酯。

（2）在重結(jié)晶階段，與乙醇發(fā)生加成反應(yīng)會(huì)生成氨基甲酸乙酯。

對(duì)碳[13C]-尿素各個(gè)工藝環(huán)節(jié)的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯進(jìn)行研究，結(jié)果表明，氨基甲酸甲酯產(chǎn)生于合成反應(yīng)步驟，在干燥和重結(jié)晶步驟中去除；氨基甲酸乙酯產(chǎn)生于重結(jié)晶步驟，養(yǎng)晶結(jié)束后通過(guò)減壓抽濾進(jìn)入碳[13C]-尿素母液。說(shuō)明干燥工藝對(duì)氨基甲酸甲酯有很好的去除效果，重結(jié)晶工藝對(duì)于氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯有很好的去除效果，去除的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯被富集于母液中，須進(jìn)一步研究干燥工藝和母液蒸干工藝。

3 碳[13C]-尿素生產(chǎn)中基因毒性雜質(zhì)的去除方法

3.1 減少基因毒性雜質(zhì)的產(chǎn)生

3.1.1 優(yōu)化合成反應(yīng)時(shí)間

氨基甲酸甲酯主要產(chǎn)生于合成反應(yīng)過(guò)程，尿素在加熱條件下，脫去一分子氨后，與甲醇發(fā)生加成反應(yīng)，生成副產(chǎn)物氨基甲酸甲酯。按合成反應(yīng)方程式CO、NH3投料比例應(yīng)為1∶2，但因13CO價(jià)格昂貴，按同位素尿素合成一般采用非同位素原料過(guò)量投料，確定13CO、NH3投料比例為1∶5，可獲得較高收率。根據(jù)實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果，尿素合成的較佳溫度為120℃，反應(yīng)釜內(nèi)的壓力經(jīng)8～24h后，合成反應(yīng)基本完成，綜合考慮提高13CO的反應(yīng)率和控制雜質(zhì)的產(chǎn)生，規(guī)定壓力穩(wěn)定1h后，結(jié)束合成反應(yīng)。繼續(xù)延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間，13CO的反應(yīng)率提升程度很有限，同時(shí)還會(huì)增加氨基甲酸甲酯、縮二脲等合成副產(chǎn)物的產(chǎn)生。

3.1.2 重結(jié)晶采用梯度升溫設(shè)計(jì)

氨基甲酸乙酯主要產(chǎn)生于重結(jié)晶階段，碳[13C]-尿素在加熱條件下，脫去一分子氨后，與乙醇發(fā)生加成反應(yīng)，生成副產(chǎn)物氨基甲酸乙酯。在與重結(jié)晶工藝相同條件下，使用1.1kg普通尿素進(jìn)行模擬，分別采用直線升溫和梯度升溫兩種方案進(jìn)行對(duì)比。結(jié)果表明，采用直線升溫工藝，重結(jié)晶階段產(chǎn)生氨基甲酸乙酯為0.09%；采用梯度升溫工藝，分別在50℃、60℃、70℃、80℃、90℃保持20min，重結(jié)晶階段產(chǎn)生氨基甲酸乙酯為0.04%。說(shuō)明采用梯度升溫設(shè)計(jì)，可有效減少氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生。

因此，重結(jié)晶工藝采用梯度升溫的設(shè)計(jì)，可有效減少氨基甲酸乙酯的生成。

3.2 去除基因毒性雜質(zhì)

3.2.1 優(yōu)化干燥2工藝

使用1.1kg普通尿素添加0.5%氨基甲酸甲酯的方式進(jìn)行模擬，考察干燥時(shí)間對(duì)氨基甲酸甲酯的影響，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，氨基甲酸甲酯隨著干燥時(shí)間的延長(zhǎng)迅速下降，干燥時(shí)間6h后，到達(dá)平臺(tái)期，為了充分保證去除效果，干燥2時(shí)間應(yīng)控制在不少于8h。

圖3 干燥2過(guò)程中氨基甲酸甲酯的變化圖

3.2.2 優(yōu)化母液干燥工藝

在母液干燥過(guò)程的不同時(shí)間點(diǎn)取樣檢測(cè)，氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量隨母液干燥時(shí)間的變化情況見圖4。結(jié)果表明，延長(zhǎng)母液干燥時(shí)間，可顯著降低母液中氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量，在干燥至6h后，降低至平臺(tái)期，因此，應(yīng)控制母液干燥時(shí)間不少于6h。

圖4 母液干燥過(guò)程中氨基甲酸酯的變化圖

3.2.3 控制母液干燥品的加入比例

母液干燥品中碳[13C]-尿素的含量占90%以上，以1kg/批為例，產(chǎn)生的母液干燥品約250g，即每個(gè)批次約有25%的活性成分進(jìn)入了母液，有必要對(duì)母液進(jìn)行回收。但為了避免基因毒性雜質(zhì)隨著母液套用次數(shù)的增加而產(chǎn)生富集，應(yīng)嚴(yán)格控制母液干燥品中的基因毒性雜質(zhì)含量，當(dāng)母液干燥品中基因毒性雜質(zhì)含量明顯高于終產(chǎn)品限度時(shí)，應(yīng)按照工藝去除能力折算，嚴(yán)格控制母液干燥品的套用比例。

4 結(jié)論

氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯作為碳[13C]-尿素中一種潛在致癌的副產(chǎn)物，嚴(yán)重影響產(chǎn)品的質(zhì)量和用藥安全性，對(duì)患者的健康存在不利影響。研究如何在碳[13C]-尿素生產(chǎn)過(guò)程中嚴(yán)格控制氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的含量有著重要意義。

1）碳[13C]-尿素生產(chǎn)過(guò)程中，氨基甲酸甲酯產(chǎn)生于合成反應(yīng)步驟，反應(yīng)壓力穩(wěn)1h后，結(jié)束合成反應(yīng)，可有效減少氨基甲酸甲酯的產(chǎn)生；氨基甲酸乙酯產(chǎn)生于重結(jié)晶步驟，采用梯度升溫的方式溶解，可有效減少氨基甲酸乙酯的產(chǎn)生。

2）延長(zhǎng)干燥2步驟的時(shí)間，對(duì)去除氨基甲酸甲酯有明顯效果，控制干燥2時(shí)間不少于6h，可有效控制碳[13C]-尿素成品中的氨基甲酸甲酯含量。

3）為避免母液干燥工藝產(chǎn)生氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯的富集，應(yīng)控制母液干燥品中的氨基甲酸甲酯、氨基甲酸乙酯不得過(guò)0.1%。母液干燥時(shí)間不少于6h。