葛鑫禹,張朵朵,朱 麗,姜慶偉,劉永峰*
(1 陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院 西安 710062 2 陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 西安 710062)
中國是世界肉鴨生產(chǎn)和消費(fèi)大國,其中肉鴨養(yǎng)殖量占全球的74.3%,是世界上肉鴨出欄最多的國家[1]。鴨肉因高不飽和脂肪酸和低膽固醇含量而受到消費(fèi)者青睞,現(xiàn)如今鴨肉的消費(fèi)量僅次于豬肉、雞肉,成為我國第三大肉類消費(fèi)品[2-3]。北京鴨(本試驗(yàn)研究材料)作為我國著名的肉鴨品種,具有生長速度快,生長周期短,飼料轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn),其產(chǎn)銷量也在不斷擴(kuò)大[4]。鴨肉在實(shí)際生產(chǎn)、流通和貯藏過程中容易受到環(huán)境和微生物等因素的影響而發(fā)生腐敗變質(zhì),甚至產(chǎn)生有毒有害物質(zhì),使鴨肉品質(zhì)大幅下降[5]。
隨著消費(fèi)者消費(fèi)習(xí)慣的改變和對食品安全問題的重視,肉品新鮮度的檢測顯得尤為重要。目前,肉品新鮮度的評價主要采用感官檢測、理化檢測或微生物檢測等方法。揮發(fā)性鹽基氮(Total volatile basic nitrogen,TVB-N)和生物胺作為肉類新鮮度檢測的重要理化指標(biāo),其含量與肉中微生物的生長繁殖及肉品腐敗密切相關(guān)[6]。其中,揮發(fā)性鹽基氮含量是《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》(GB 2707-2016)中規(guī)定的唯一理化指標(biāo)[7],可直接判斷肉品是否符合食用標(biāo)準(zhǔn)。生物胺是游離氨基酸在微生物氨基酸脫羧酶催化下脫羧反應(yīng)的產(chǎn)物,是引起肉品安全性下降和產(chǎn)生異味的主要因素,近年來也常被用于評估肉類的新鮮度[8]。王真真等[9]測定了真空包裝冷卻豬肉的生物胺含量,并與TVB-N 值、微生物數(shù)量等腐敗指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)腐胺、尸胺和酪胺與冷卻豬肉的微生物數(shù)量、TVB-N 值等指標(biāo)顯著相關(guān),可作為判斷豬肉新鮮度的重要指標(biāo)。楊春婷[10]通過測定冷鮮豬肉中的生物胺含量,并結(jié)合pH 值、TVB-N值和感官評分等指標(biāo)對新鮮度進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)尸胺、腐胺和酪胺與冷鮮豬肉的腐敗變質(zhì)關(guān)系密切,可作為冷鮮豬肉新鮮度的評價指標(biāo)。然而,由于上述肉品新鮮度的檢測方法通常需要經(jīng)過復(fù)雜的樣品前處理,存在過程繁瑣,耗時長等缺點(diǎn),因此,在肉品新鮮度檢測方面亟需開發(fā)一種快速、準(zhǔn)確的檢測方法。
熒光傳感器是一種利用高性能傳感薄膜對揮發(fā)性生物胺類進(jìn)行高靈敏性檢測的光學(xué)傳感器[8,11]。熒光傳感器應(yīng)用于肉品新鮮度檢測中,能夠很好地彌補(bǔ)傳統(tǒng)肉品新鮮度檢測方法的不足,對原樣本進(jìn)行實(shí)時檢測,并且操作簡單,便于攜帶,可以達(dá)到快速、無損檢測肉品新鮮度的目的。Hu 等[12]利用對生物胺敏感的手性不對稱苝二酰亞胺分子對熒光納米管進(jìn)行修飾和組裝,發(fā)現(xiàn)熒光納米管傳感器對氨、二甲胺、三甲胺、腐胺及尸胺具有非常高的靈敏度,將其應(yīng)用于豬肉、雞肉、魚和蝦的新鮮度檢測時發(fā)現(xiàn):納米管傳感器對肉類腐敗產(chǎn)生的胺蒸汽高度敏感,可用于肉類新鮮度的實(shí)時監(jiān)測。本課題組前期設(shè)計(jì)合成了一種全新的構(gòu)象可調(diào)的苝二酰亞胺衍生物,具有對有機(jī)胺類物質(zhì)的高敏感性、高熒光量子產(chǎn)率及良好的光化學(xué)穩(wěn)定性等特點(diǎn)[13],并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)建立一套能夠高靈敏、高選擇和快速可逆檢測有機(jī)胺的薄膜熒光傳感器設(shè)備。
鑒于此,本研究采用該薄膜熒光傳感器測定新鮮鴨肉在冷藏過程中的胺類響應(yīng)值,將檢測數(shù)據(jù)與pH 值、TVB-N 值、生物胺含量進(jìn)行相關(guān)性分析和回歸方程的建立,探討薄膜熒光傳感器響應(yīng)值與鴨肉新鮮度的關(guān)系,評估并開發(fā)一種實(shí)時、快速、無損的鴨肉新鮮度檢測及判定方法,為鴨肉新鮮度的無損化、快速檢測提供理論依據(jù)。
新鮮鴨肉,陜西富強(qiáng)宏圖牧業(yè)有限公司,將鴨肉隨機(jī)分成3 組,用自封袋包裝后置于冰箱(4±1)℃中冷藏。鴨肉分別冷藏0,0.5,1,2,3,5,7 d 后取樣、測定,每組肉樣30 g。
生物胺標(biāo)準(zhǔn)溶液 (9 種生物胺類的混標(biāo))、丹磺酰、氧化鎂、硼酸、甲基紅、溴甲酚綠等均為分析純級,西安晶博有限公司。
薄膜熒光傳感器,陜西師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院提供;U3000 高效液相色譜(UV),美國熱電公司;FE28 pH 計(jì),上海梅特勒-托利多儀器有限公司;美菱冰箱,合肥美菱股份有限公司。
1.3.1 pH 值的測定 參考鄭曉等[14]的方法取10 g 剪碎鴨肉置于燒杯中,加入90 mL 蒸餾水,勻漿后在4 ℃下靜置30 min,抽濾,用pH 計(jì)測定濾液pH 值。
1.3.2 TVB-N 的測定 TVB-N 的測定參照《食品中揮發(fā)性鹽基氮的測定》(GB 5009.228-2016)[15]中的半微量定氮法進(jìn)行測定。
1.3.3 生物胺的測定 生物胺的測定參照《食品中生物胺含量的測定》(GB/T 5009.208-2016)[16]方法進(jìn)行測定。
樣品制備:取10 g 剪碎鴨肉,加20 mL 5%三氯乙酸振蕩30 min 后5 000 r/min 離心10 min,移出上清液后,殘?jiān)屑?0 mL 5%三氯乙酸,重復(fù)上述步驟,合并上清液定容至50 mL。取10 mL 提取液,加入0.5 g 氯化鈉振蕩至完全溶解后加入10 mL 正己烷,渦旋振蕩5 min,靜置后除去上層有機(jī)相。取5 mL 提取液調(diào)pH 值至12.0 左右,加5 mL 正丁醇/三氯甲烷混合溶液(體積比為1∶1),渦旋振蕩5 min,除去上層水相,定容至5 mL,加入200 μL 鹽酸(1 mol/L),混勻后40 ℃氮吹干,加入1 mL 鹽酸(0.1 mol/L)溶解殘留物。加入1 mL飽和碳酸氫鈉,100 μL 氫氧化鈉 (1 mol/L),1 mL丹磺酰氯衍生試劑,混勻后60 ℃水浴15 min,加100 μL 谷氨酸鈉溶液(50 mg/mL)混勻后60 ℃水浴15 min;取出冷卻至室溫后加1 mL 水,加入0.5 g 氯化鈉混勻后加入5 mL 乙醚,渦旋振蕩2 min,靜置分層后,上層有機(jī)相60 ℃氮吹干。冷卻后加入1 mL 乙腈,用0.22 μm 有機(jī)濾膜過濾,待測。
色譜條件:柱溫35 ℃;流速0.8 mL/min;進(jìn)樣紫外檢測波長254 nm,進(jìn)樣量20 μL;流動相:A液90%乙腈/10%含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液,B 液10%乙腈/90%含0.1%乙酸的0.01 mol/L 乙酸銨溶液。梯度洗脫程序見表1。
表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program
將前期處理好的鴨肉準(zhǔn)確稱取10.0 g,放置于集氣瓶中蓋好蓋子與傳感器設(shè)備連接,所有傳感測試均采用靜態(tài)測試方法完成。在測試過程中,采樣蒸汽通過氣管泵入傳感器,并由帶脈沖注入的電磁閥控制。蒸汽在1 s 內(nèi)以約3 mL/s 的流速泵入采樣室,然后產(chǎn)生感應(yīng)信號。每次測試時間間隔為60 s。為保證數(shù)據(jù)可靠,對每個樣品重復(fù)至少4次傳感測試。
采用Microsoft Excel 2013 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析。采用SPSS 24.0 進(jìn)行方差分析和相關(guān)性分析。通過Origin Pro 2015 軟件對收集的傳感器信號響應(yīng)值進(jìn)行分析。
在冷藏條件下,鴨肉pH 值的測定結(jié)果如圖1所示。隨貯藏時間的延長鴨肉pH 值呈先降低后升高的趨勢,從第0 天的5.97 降低到第1 天的5.95,在貯藏第7 天升高到6.07(P<0.05),其中第1 天pH 值的降低可能由于貯藏過程中產(chǎn)生乳酸所致。在整個貯藏過程中,鴨肉的pH 值變化較小,在5.90~6.10 之間波動,說明鴨肉在冷藏條件下pH 值變化不明顯。
圖1 冷藏期間鴨肉pH 值的變化Fig.1 Changes in pH value of duck meat during cold storage
鴨肉冷藏期間TVB-N 值變化如圖2所示,TVB-N 值隨貯藏時間的延長而增加,TVB-N 值在0.5,1,2,3 d 變化緩慢,其增長速率分別為1.33,0.44,0.22。1,2,3 d 的TVB-N 值間無顯著差異(P>0.05),3 d 后TVB-N 值顯著增加 (P<0.05),貯藏5 d 后,TVB-N 值迅速增加,其增長速率達(dá)到5.10;在貯藏結(jié)束時,第7 天的TVB-N 值達(dá)到17.51 mg/100 g 是第5 天的2.39 倍,已超過《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)鮮(凍)畜、禽產(chǎn)品》(GB 2707-2016)[17]中規(guī)定的新鮮肉限值(15 mg/100 g)。可見,隨著貯藏時間的延長,鴨肉的TVB-N 值逐漸增加,在貯藏3 d 后TVB-N 值的上升更為明顯。
圖2 冷藏期間鴨肉TVB-N 值的變化Fig.2 Changes in TVB-N value of duck meat during cold storage
鴨肉冷藏過程中9 種生物胺的含量測定結(jié)果如圖3所示。貯藏初期,鴨肉中尸胺含量最低,而亞精胺(0.847 mg/kg)和精胺(0.879 mg/kg)含量均高于其它生物胺。在貯藏過程中,色胺、苯乙胺、腐胺、尸胺、章魚胺和酪胺的含量隨貯藏時間的延長逐漸增加,從貯藏3 d 直至貯藏結(jié)束,色胺、腐胺、章魚胺的增長速率加快,分別為0.10,0.10,0.12。苯乙胺含量隨著貯藏時間的延長均顯著增加(P<0.05),直至貯藏7 d 時苯乙胺含量達(dá)到最高1.429 mg/kg,是第0 天的6.44 倍。尸胺變化最為明顯,由最初的0.017 mg/kg 增加到7 d 的0.984 mg/kg。當(dāng)貯藏結(jié)束后,精胺(1.804 mg/kg)含量達(dá)到最高,其次為苯乙胺(1.429 mg/kg)、尸胺(0.984 mg/kg),組胺(0.535 mg/kg)含量最低??梢?,隨著貯藏時間的延長,鴨肉中蛋白質(zhì)被微生物分解成生物胺等堿性含氮物,而每種生物按的變化趨勢不同,色胺、腐胺、尸胺、章魚胺和酪胺呈上升趨勢。
圖3 冷藏期間鴨肉9 種生物胺含量的變化Fig.3 Changes in 9 biogenic amines content of duck meat during cold storage
鴨肉冷藏期間傳感器響應(yīng)值變化如圖4所示。響應(yīng)值的負(fù)號表示薄膜熒光傳感器的猝滅響應(yīng)。在貯藏期間,響應(yīng)值隨貯藏時間的延長而增加。貯藏初期(0~0.5 d),響應(yīng)值迅速增加,其速率達(dá)到112。響應(yīng)值在0.5,1,2 d 時變化緩慢,增長速率分別為6.0,7.5。且0.5 d 和1 d 的響應(yīng)值無顯著差異(P>0.05),1 d 后響應(yīng)值顯著升高(P<0.05),第7 天的響應(yīng)值是第5 天的1.21 倍,除0.5 d 和1 d 外其余貯藏時間下的響應(yīng)值都存在顯著差異(P<0.05)??梢?,傳感器能夠很好的檢測出鴨肉在貯藏過程中產(chǎn)生的胺類物質(zhì),其響應(yīng)值隨著貯藏時間的延長而增加。
圖4 冷藏期間鴨肉響應(yīng)值的變化Fig.4 Changes in response value of duck meat during cold storage
傳感器響應(yīng)值、TVB-N 值、pH 值及9 種生物胺含量的相關(guān)性分析如圖5所示。圖中圓的不同顏色代表各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)從-1 到1,圓的大小代表相關(guān)系數(shù)的絕對值大小,圓越大相關(guān)系數(shù)的絕對值越大,即越接近1,代表各指標(biāo)間相關(guān)性越大,每個圓上的數(shù)字表示兩個指標(biāo)間的相關(guān)系數(shù)。對鴨肉的新鮮度指標(biāo)做相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)TVB-N值與生物胺總量的相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.98,其中TVBN 值與除精胺、亞精胺、組胺外的其余指標(biāo)都有明顯的正相關(guān)性,與色胺、苯乙胺、腐胺、章魚胺和酪胺的相關(guān)系數(shù)均大于0.9,說明鴨肉在4 ℃貯藏過程中,TVB-N 值能較好表示色胺、苯乙胺、腐胺、章魚胺和酪胺這5 種生物胺的含量,而與精胺、亞精胺及組胺的相關(guān)性較差;pH 值與除組胺、精胺、亞精胺外的其余指標(biāo)均呈明顯的正相關(guān)性,與苯乙胺、腐胺、尸胺和章魚胺的相關(guān)性較大,其相關(guān)系數(shù)均大于0.8,與苯乙胺的相關(guān)性最大,其相關(guān)系數(shù)可達(dá)0.94。
圖5 冷藏期間鴨肉各指標(biāo)間相關(guān)系數(shù)矩陣圖Fig.5 Correlation coefficient matrix of indexes during cold storage
進(jìn)一步的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),傳感器響應(yīng)值與TVB-N 值、pH 值及生物胺總量之間均存在較好的相關(guān)性,其相關(guān)系數(shù)的絕對值均大于0.8。傳感器響應(yīng)值與除亞精胺以外的其余10 個指標(biāo)都呈明顯的負(fù)相關(guān),與TVB-N 值、pH 值、苯乙胺、尸胺及章魚胺的相關(guān)性較強(qiáng),相關(guān)系數(shù)分別為-0.84,-0.86,-0.96,-0.81 和-0.81,其相關(guān)系數(shù)的絕對值均大于0.8。響應(yīng)值與苯乙胺的相關(guān)性最大,其相關(guān)系數(shù)的絕對值可達(dá)0.96(P<0.01)。綜上,鴨肉在4 ℃貯藏過程中傳感器響應(yīng)值、TVB-N 值、pH值及生物胺總量任意兩者間都存在較好的相關(guān)性,說明響應(yīng)值在一定程度上能夠反映TVB-N值、pH 值及生物胺總量的變化趨勢。
將不同貯藏時間測定的傳感器響應(yīng)值和揮發(fā)性鹽基氮進(jìn)行回歸分析,結(jié)果如圖6a 所示。以揮發(fā)性鹽基氮(y)為因變量,傳感器響應(yīng)值(x)為自變量,得到響應(yīng)值與揮發(fā)性鹽基氮的回歸方程為y=0.154e-0.021x(決定系數(shù)R2=0.971)。R2大于0.9,說明傳感器的響應(yīng)值與鴨肉揮發(fā)性鹽基氮為高度負(fù)相關(guān),可以利用此方程預(yù)測一定范圍內(nèi)的鴨肉揮發(fā)性鹽基氮含量變化,從而對鴨肉新鮮度進(jìn)行判斷。圖6b 是響應(yīng)值與苯乙胺的回歸分析結(jié)果,由于響應(yīng)值與苯乙胺的相關(guān)性系數(shù)最大(-0.96),相關(guān)關(guān)系檢驗(yàn)表現(xiàn)為極顯著(P<0.01),因此將傳感器響應(yīng)值和苯乙胺含量進(jìn)行回歸分析,以苯乙胺含量(y)為因變量,傳感器響應(yīng)值(x)為自變量,所擬合的回歸方程為y=0.0664e-0.015x(決定系數(shù)R2=0.936),其回歸方程R2大于0.9,說明傳感器響應(yīng)值可以較準(zhǔn)確的預(yù)測鴨肉貯藏過程中苯乙胺的含量,即隨著鴨肉貯藏過程中傳感器響應(yīng)值增大,苯乙胺含量增加。
圖6 傳感器響應(yīng)值與鴨肉新鮮度的回歸分析Fig.6 Regression analysis of sensor response value and freshness index
pH 值在一定程度上能夠反映肉類腐敗程度[18]。本研究中,pH 值在鴨肉貯藏過程中呈先降低后升高的變化趨勢。這可能是由于鴨宰后由于氧氣的供應(yīng)中斷,無氧糖酵解成為能量代謝的方式,產(chǎn)生大量乳酸,乳酸積累使得鴨肉pH 值下降,在貯藏第1 天下降到最低[19-20]。之后鴨肉的pH值上升,并在第7 天時達(dá)到最大值,原因可能是酸性蛋白酶被激活,蛋白質(zhì)被分解成多肽、生物胺、游離氨基酸等物質(zhì),這些物質(zhì)大多呈兩性或堿性,從而使得鴨肉的pH 值上升[21]。此外,貯藏過程中微生物的影響也不可忽略,微生物大量繁殖并將蛋白質(zhì)分解成胺類等堿性物質(zhì),最終導(dǎo)致pH 值上升。
TVB-N 值是肉品中蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的氨及胺類等堿性含氮物質(zhì),主要包括氨、二甲胺、三甲胺、尸胺和腐胺等物質(zhì)[22-23]。在本研究中,隨著貯藏時間的延長,鴨肉中的TVB-N 值顯著增加,TVBN 值的增長速率不斷加快。這表明在貯藏后期鴨肉的腐敗速度也在加快,可能是因?yàn)轼喨庠谫A藏過程中,微生物生長速率及內(nèi)源酶的降解速率不斷上升,蛋白質(zhì)被分解,導(dǎo)致大量揮發(fā)性鹽基氮的生成[24]。
此外,生物胺也是判斷肉的新鮮度或腐敗程度和衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)[25]。在本研究中,色胺、腐胺、尸胺、章魚胺和酪胺隨貯藏時間的延長均呈上升趨勢,其中尸胺變化最為明顯。這與Vinci 等[26]的研究結(jié)果一致,在(4±1)℃貯藏條件下,對牛肉和雞肉不同貯藏時間的生物胺含量進(jìn)行測定,發(fā)現(xiàn)雞肉中尸胺含量增長速率較快。這可能與肉中賴氨酸含量有關(guān),賴氨酸是尸胺形成的最主要前體物質(zhì)[27]。在整個貯藏過程中,亞精胺并未隨貯藏時間延長而增加,這可能是由于亞精胺是肉中天然存在的生物胺,它是經(jīng)過動物新陳代謝自然產(chǎn)生的,與肉品的腐敗變質(zhì)無關(guān)[10,28]。對TVB-N 和生物胺進(jìn)行相關(guān)性分析,發(fā)現(xiàn)TVB-N 與生物胺總量具有極顯著相關(guān)性,其中色胺、苯乙胺、腐胺、章魚胺、酪胺和尸胺與鴨肉的TVB-N 值均具有良好的相關(guān)性,這可能是由于貯藏過程中微生物將蛋白質(zhì)、氨基酸等物質(zhì)分解成鹽基氮類化合物,與此同時,微生物產(chǎn)生的氨基酸脫羧酶將游離氨基酸分解生成生物胺,導(dǎo)致TVB-N 與生物胺總量之間具有極顯著相關(guān)性[29]。
為了更準(zhǔn)確的判斷薄膜熒光傳感器對冷藏鴨肉新鮮度測定的可靠性,對傳感器響應(yīng)值與鴨肉新鮮度指標(biāo)、生物胺含量的相關(guān)性分析結(jié)果進(jìn)行綜合。結(jié)果表明,傳感器響應(yīng)值與生物胺含量之間具有極顯著相關(guān)性,與TVB-N 值、pH 值之間具有顯著相關(guān)性。生物胺中苯乙胺、尸胺和章魚胺與傳感器響應(yīng)值之間具有良好的相關(guān)性。Hu 等[12]的研究中也證實(shí),利用苝二酰亞胺分子組裝的熒光納米管傳感器對肉產(chǎn)生的胺蒸汽表現(xiàn)出非常高的靈敏度,可以用于肉新鮮度的檢測。將響應(yīng)值分別與TVB-N 值和苯乙胺建立回歸方程,響應(yīng)值與苯乙胺之間的回歸方程R2大于0.9,說明兩者之間具有極顯著相關(guān)性,這與Zhang 等[30]的研究結(jié)果相似,在利用苝二酰亞胺功能化共聚物熒光膜傳感器檢測有機(jī)胺蒸汽的研究中,發(fā)現(xiàn)其對苯胺表現(xiàn)出極高的靈敏度、高選擇性和完全可逆性。綜上所述,薄膜熒光傳感器所測響應(yīng)值與鴨肉新鮮度指標(biāo)具有顯著相關(guān)性,對響應(yīng)值與TVB-N 值、苯乙胺進(jìn)行回歸分析,建立回歸方程R2分別為0.971和0.936,能夠較準(zhǔn)確的預(yù)測肉品新鮮度,應(yīng)進(jìn)一步研究薄膜熒光傳感器對其它肉品種類以及在不同貯藏溫度下的肉類新鮮度的檢測,建立更加完善的薄膜熒光傳感器檢測模型和評判標(biāo)準(zhǔn),用于肉類新鮮度的無損、快速檢測。
本研究采用薄膜熒光傳感器對冷藏鴨肉進(jìn)行胺類響應(yīng)值測定,并結(jié)合pH 值、TVB-N 值和生物胺含量分析。隨著貯藏時間的延長,薄膜熒光傳感器的響應(yīng)值逐漸增大,鴨肉的pH 值、TVB-N 值也明顯增加,生物胺中色胺、腐胺、尸胺、章魚胺和酪胺隨著貯藏時間的延長而增加。響應(yīng)值與鴨肉新鮮度指標(biāo)呈良好相關(guān)性,響應(yīng)值與TVB-N 值、苯乙胺之間呈現(xiàn)指數(shù)相關(guān)關(guān)系,建立的回歸方程分別為y=0.154e-0.021x(R2=0.971)和y=0.0664e-0.015x(R2=0.936),說明利用薄膜熒光傳感器能夠靈敏檢測氨及胺類物質(zhì),并應(yīng)用于肉類新鮮度判斷。本研究將為肉類在生產(chǎn)、銷售與運(yùn)輸過程中的無損、快速檢測技術(shù)提供理論參考和技術(shù)支撐。