2-甲氧雌二醇對胎兒生長受限胎盤血管內(nèi)皮功能的影響

花玉蓉，朱 怡，吳金婷，金彥琪

(南通大學(xué)附屬婦幼保健院婦產(chǎn)科，江蘇 南通 226001)

胎兒生長受限(fetal growth restriction，F(xiàn)GR)是新生兒圍產(chǎn)期重要疾病類型，不僅會導(dǎo)致新生兒病亡率增加，還會誘使患兒在成年后心血管疾病及耐糖量異常發(fā)生風(fēng)險增加[1-2]。目前已經(jīng)明確FGR的發(fā)生與胎盤血管重塑及滋養(yǎng)層細胞生物學(xué)行為異常有關(guān)，滋養(yǎng)層細胞與血管內(nèi)皮細胞之間增殖、分化存在輕微協(xié)調(diào)機制，而這一機制需要胎盤組織分泌細胞因子參與。血管緊張素-2(angiotensin 2，Ang-2)為典型的血管生成激活因子，胎盤組織中Ang-2水平減少，一方面會抑制滋養(yǎng)細胞分化增殖，導(dǎo)致胎盤血管發(fā)育被抑制，胎盤血氧缺乏；另一方面其又可以經(jīng)由抑制凋亡及促進遷移影響血管內(nèi)皮細胞功能，進而導(dǎo)致FGR發(fā)病[3]。2-甲氧雌二醇(2-methoxyestradiol，2-ME)為17β-雌二醇2號位被細胞色素P450羥化，經(jīng)由兒茶酚氧位甲基轉(zhuǎn)移酶(catechol O-methyltransferase，COMT)催化作用形成代謝產(chǎn)物[4]。已有研究顯示，在氧氣缺乏情況下，2-ME可以經(jīng)由促進滋養(yǎng)細胞的遷移、增殖作用誘導(dǎo)滋養(yǎng)層細胞分化為高侵襲性滋養(yǎng)細胞，進而促進滋養(yǎng)細胞侵入細胞外基質(zhì)，保證正常妊娠[5]。目前已經(jīng)了解到FGR的發(fā)生與胎盤發(fā)育有關(guān)，且2-ME在滋養(yǎng)細胞分化中發(fā)揮重要作用，而2-ME在FGR中的作用及其在胎盤血管形成中的作用尚未完全明確。因此，本研究對FGR孕婦外周血、臍血及胎盤組織的2-ME水平變化進行探討，并應(yīng)用體外細胞實驗分析2-ME對胎盤血管形成的影響，為后期從代謝方面分析FGR發(fā)病機制提供參考意見。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2019年5月至2020年12月期間南通大學(xué)附屬婦幼保健院收治的FGR孕婦66例及正常產(chǎn)檢孕婦50例為研究對象，將其分為研究組和健康組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①依據(jù)有關(guān)文獻[6]中對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)判定孕婦是否存在FGR；②均為單胎妊娠，且為孕晚期；③應(yīng)用剖宮產(chǎn)進行分娩；④孕婦及其家屬同意參與本研究，本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在心臟疾病、慢性高血壓、甲狀腺功能異常、肝腎疾病或者糖尿病；②存在產(chǎn)科合并癥或者其他內(nèi)科合并癥；③多胎妊娠孕婦；④存在感染性疾病或者免疫異常疾病。

研究組的年齡為21～32歲，平均(26.59±4.19)歲；分娩孕周為36～40周，平均(38.29±0.94)周；孕次1～3次，平均(2.13±0.53)次；產(chǎn)次1～3次，平均(2.15±0.43)次。健康組的年齡為20～33歲，平均(26.79±4.53)歲；分娩孕周為36～40周，平均(38.59±0.81)周；孕次1～3次，平均(2.43±0.46)次；產(chǎn)次1～3次，平均(2.34±0.34)次。兩組一般資料比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，存在可比性。

1.2 方法

1.2.1 收集臍血和胎盤組織樣本及人胎盤微血管內(nèi)皮細胞

采集研究組和健康組孕婦晨起空腹靜脈血2mL，待其分娩后立即收集臍血3mL，同時選取1塊(1cm×1cm×0.2cm)靠近臍帶附著位置全層的胎盤組織，將其置于液氮中凍存。

將人胎盤微血管內(nèi)皮細胞(human placental microvascular endothelial cells，hPMEC)在達爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)(含有10%胎牛血清)中培養(yǎng)，hPMEC細胞置于5%CO2及37℃環(huán)境下細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至hPMEC細胞生長到80%～90%融合時需應(yīng)用胰蛋白酶進行傳代，獲得處于對數(shù)生長期進行后續(xù)細胞增殖、遷移及小管形成實驗。

1.2.2 實驗材料

2-ME、COMT、Ang-2酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，組織裂解液購自北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白試劑盒購自上海睿時生物科技有限公司，一抗與二抗購自Bioss公司，增強型化學(xué)發(fā)光試劑(enhanced chemiluminescence，ECL)顯影劑購自上海李記生物科技有限公司，hPMEC購自中國科學(xué)院上海細胞庫，DMEM培養(yǎng)基購自廣州市超博科技有限公司，噻唑藍(thiazolyl blue tetrazolium bromide，MTT)試劑盒購自北京索萊寶公司，Transwell細胞小室購自康寧醫(yī)療器械有限公司，Matrigel基質(zhì)膠購自上海浩然生物技術(shù)有限公司。

1.2.3 外周血和臍血及胎盤組織指標(biāo)的測定

1.2.3.1 外周血和臍血2-ME水平的測定 以1 000r/min離心10min處理標(biāo)本，獲得上清液，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定其水平，對應(yīng)測定均按照試劑盒說明書中步驟進行操作。

1.2.3.2 胎盤組織COMT水平的測定 采用蛋白印跡法進行測定，取合適的胎盤組織，應(yīng)用組織裂解液充分降解，以12 000r/min離心5min，獲得上清液，抽提胎盤組織蛋白，應(yīng)用BCA蛋白試劑盒測定抽提蛋白濃度，隨后應(yīng)用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)，測定目的蛋白及對應(yīng)內(nèi)參蛋白(GAPDH)表達情況，完成SDS-PAGE后蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidenedifluoride，PVDF)上，轉(zhuǎn)移完成后進行洗膜處理，應(yīng)用5%脫脂奶粉進行封閉。添加一抗后，在4℃環(huán)境下進行過夜孵育，第2d洗膜后，添加二抗置于37℃環(huán)境下孵育1h。孵育完成再次洗膜，添加ECL顯影劑置于暗室曝光顯影。目的蛋白相對表達量為目的蛋白與內(nèi)參蛋白條帶灰度值之比。

1.2.4 細胞實驗

1.2.4.1 細胞的處理 取處于對數(shù)期hPMEC，采用胰酶進行消化，選擇存在10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液調(diào)成1×105/mL細胞懸液，接種至96孔板中，應(yīng)用無胎牛血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，應(yīng)用5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L濃度的2-ME處理培養(yǎng)細胞，作為2-ME處理組，而空白對照組則采用等量培養(yǎng)基處理，各組均設(shè)定5個復(fù)孔。

1.2.4.2 細胞增殖的測定 對培養(yǎng)細胞應(yīng)用2-ME處理后，繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h，各孔均添加為5mg/mL濃度、20μL體積MTT繼續(xù)處理6h，6h后將孔內(nèi)液體吸去，應(yīng)用酶標(biāo)儀測定570nm位置吸光度值，最后相對抑制率=(1-2-ME處理組/空白對照組)×100%，最終結(jié)果為3次測定的均值。

1.2.4.3 細胞遷移的測定 應(yīng)用無血清培養(yǎng)基將消化后細胞配置成1×105/mL懸液，以100μL/孔接種到Transwell細胞上室中，下室則需要添加存在10%胎牛血清培養(yǎng)基500μL，培養(yǎng)12h后將其中培養(yǎng)液棄去，補充10%胎牛血清培養(yǎng)基，在37℃環(huán)境下培養(yǎng)48h，用棉簽將上層沒有遷移細胞輕輕擦去，應(yīng)用4%多聚甲醛固定，出現(xiàn)結(jié)晶紫顏色后置于100倍鏡下隨機選擇5個視野，計算遷移細胞數(shù)目，最終結(jié)果為3次測定的均值。

1.2.4.4 小管形成的測定 在培養(yǎng)板底部添加0.3mL的Matrigel基質(zhì)膠，將其鋪平后，在37℃環(huán)境下靜置處理10h，對消化后細胞采用無血清培養(yǎng)基配置成1×105/mL懸液，隨后以100μL/孔密度進行接種，培養(yǎng)12h后將其中培養(yǎng)液棄去，添加存在10%胎牛血清培養(yǎng)基再次培養(yǎng)24h，在倒置顯微鏡下觀察小管的形成。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察研究組和健康組孕婦外周血和臍血2-ME、胎盤組織COMT水平，分析外周血和臍血2-ME、胎盤組織COMT水平的相關(guān)性；分析不同濃度2-ME處理對hPMEC細胞增殖、遷移、小管新形成的影響。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 研究組與健康組孕婦外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT水平情況

研究組外周血2-ME水平顯著低于健康組(P<0.05)，研究組與健康組臍血2-ME水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；研究組胎盤組織中COMT水平顯著低于健康組(P<0.05)，見表1、圖1。

表1 研究組與健康組外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT水平的比較Table 1 The comparison of 2-ME levels in peripheral blood and cord blood and COMT levels in placental tissue between the two

2.2 外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT間相關(guān)性的分析

經(jīng)Pearson相關(guān)性分析顯示，外周血2-ME與臍血2-ME、胎盤組織COMT均呈正相關(guān)(P<0.05)，臍血2-ME與胎盤組織COMT呈正相關(guān)(P<0.05)，見表2。

表2 外周血2-ME和臍血2-ME及胎盤組織COMT間的相關(guān)性Table 2 The correlation among peripheral blood 2-ME,cord blood 2-ME and COMT in placental tissue

2.3 不同濃度2-ME處理組對hPMEC增殖影響的分析

不同濃度2-ME處理組(5、10、15μmol/L)的hPMEC在24h和48h的細胞抑制率均顯著低于空白對照組(F值分別為18.907、18.593，P<0.05)，且隨著2-ME處理濃度的增加，24h和48h的細胞抑制率均逐漸下降(P<0.05)，見表3。

表3 不同濃度2-ME處理組對hPMEC增殖的影響Table 3 The effect of different concentrations of 2-ME on the proliferation of

2.4 不同濃度2-ME處理組對hPMEC遷移和血管內(nèi)皮細胞小管形成度影響的分析

不同濃度2-ME處理組(5、10、15μmol/L)的hPMEC遷移細胞數(shù)目和血管內(nèi)皮細胞小管形成度均顯著高于空白對照組(F值分別為25.751、42.215，P<0.05)，且隨著2-ME處理濃度的增加，遷移細胞數(shù)目和血管內(nèi)皮細胞小管形成度均逐漸增加(P<0.05)，見表4。

表4 不同濃度2-ME處理組對hPMEC遷移和血管內(nèi)皮細胞小管形成度的影響Table 4 The effect of different concentrations of 2-ME on hPMEC migration and endothelial cell tubule

3 討論

3.1 2-ME在FGR發(fā)生中的作用

FGR是重要的妊娠并發(fā)癥之一，在我國FGR發(fā)病率為3%～7%，F(xiàn)GR新生兒病死率高于正常新生兒的3～5倍，同時FGR新生兒近期與遠期并發(fā)癥發(fā)生風(fēng)險也顯著上升[7]。目前研究認(rèn)為胎盤血管形成異常所致胎盤血氧缺乏為FGR發(fā)生的重要原因，2-ME作為雌二醇重要代謝產(chǎn)物之一，主要通過胎盤COMT甲基化而誘導(dǎo)形成，在促進血管形成、抑制細胞增殖及促進細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用[8]。本研究中，研究組外周血2-ME水平顯著低于健康組，研究組與健康組臍血2-ME水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，研究組胎盤組織中COMT水平顯著低于健康組，這些均顯示2-ME及COMT在FGR中發(fā)揮重要作用，分析原因認(rèn)為2-ME在缺氧情況下通過促進血管形成、誘導(dǎo)絨毛滋養(yǎng)細胞增殖等過程改善胎盤血液循環(huán)，進而影響胎兒生長[9]。COMT是誘導(dǎo)雌二醇轉(zhuǎn)化為2-ME的重要降解酶，經(jīng)由影響錳超氧化物歧化酶水平而使機體缺氧誘導(dǎo)因子1α水平保持穩(wěn)定，使血管內(nèi)皮細胞功能損傷，進而誘導(dǎo)FGR發(fā)生[10]。本研究中，研究組與健康組臍血2-ME水平差異不大，可能是因為母體2-ME不能有效地穿過胎盤屏障所致。本研究中對外周血和臍血2-ME及胎盤組織COMT間的關(guān)系探究顯示，各指標(biāo)均存在明顯正相關(guān)關(guān)系，提示三指標(biāo)可能共同介導(dǎo)了FGR發(fā)病，但其具體機制尚需進一步研究證實。

3.2 2-ME在胎盤組織血管內(nèi)皮功能中的作用

研究顯示雌二醇可以抑制Ang-2所致心血管不良反應(yīng)，而2-ME作為雌二醇重要代謝產(chǎn)物，在影響心血管病變中發(fā)揮著重要作用[11]。另一項體外研究顯示，2-ME通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶和核轉(zhuǎn)錄因子-κB信號通路抑制血管細胞粘附蛋白-1表達，從而阻止單核細胞與血管內(nèi)皮細胞的粘附，顯示2-ME可以有效改善內(nèi)皮功能[12]。Zou等[13]應(yīng)用顱內(nèi)靜脈高壓大鼠模型及缺氧人臍靜脈內(nèi)皮細胞進行了體內(nèi)與體外血管形成誘導(dǎo)實驗，發(fā)現(xiàn)經(jīng)2-ME處理可以有效抑制缺氧導(dǎo)致血管形成，其主要經(jīng)p53表達上調(diào)及ID-1表達下調(diào)發(fā)揮作用。國外一項對大鼠的動物實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)2-ME處理可以有效抑制慢性間歇缺氧大鼠肺血管形成，其主要經(jīng)影響肺動脈平滑肌增殖、活性氧及細胞遷移等過程發(fā)揮抑制肺血管形成作用[14]。有研究表明，2-ME可以抑制多種腫瘤細胞增殖，且這種作用顯示為濃度與時間依賴性[15]。多項研究顯示，2-ME對于血管作用具有一定雙面性，其在不同類型疾病中經(jīng)由不同信號通路影響疾病發(fā)生與進展[16-17]。為進一步明確2-ME在胎盤血管形成中的作用，本研究選擇hPMEC進行體外細胞實驗，其結(jié)果顯示，經(jīng)2-ME處理可以有效地促進hPMEC增殖、遷移及血管內(nèi)皮細胞小管形成，并上調(diào)Ang-2分泌，且這一趨勢還會隨著2-ME濃度的增加而加重，表明2-ME可以有效地促進hPMEC血管重塑，其可能經(jīng)上調(diào)Ang-2水平發(fā)揮作用，分析原因可能為2-ME通過上調(diào)Ang-2水平促進滋養(yǎng)細胞增殖分化，進而促進胎盤血管形成。

綜上所述，F(xiàn)GR患者體內(nèi)2-ME水平異常，且與胎盤COMT水平變化有關(guān)，2-ME可能影響胎盤組織血管內(nèi)皮功能及血管形成，進而介導(dǎo)FGR發(fā)生，其中是否存在其他因素影響尚需進一步研究證實。