豬毛蒿醇提物最佳提取工藝條件研究

郭晨陽，劉嘉琳，鐘華晨，王麗芳

［1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室（呼和浩特），內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031］

豬毛蒿（Artemisia scoparia）是菊科蒿屬多年 生草本植物，主要分布在我國東部、南部的中、低海拔地區(qū)的山坡、曠野和路兩旁，以及西北省份的中、低海拔至2 800 m 的地區(qū)［1］。豬毛蒿不僅分布廣泛而且產(chǎn)量高， 單個(gè)樣地覆蓋度可達(dá)50%以上［2］。其味苦、辛，微寒，有濃烈的香氣。隨著對豬毛蒿化學(xué)成分、理化性質(zhì)和生物學(xué)功能研究的逐漸深入，發(fā)現(xiàn)豬毛蒿全株含揮發(fā)油、綠原酸、對-羥基苯乙酮和大黃素等活性成分。 文獻(xiàn)報(bào)道， 具有廣泛抗菌、 抑菌作用的綠原酸對多種致病菌和病毒有較強(qiáng)的抑制和殺滅作用［3-5］，藥用價(jià)值極高，可鎮(zhèn)靜、消炎、清熱利濕、利膽退黃、升高白細(xì)胞及促進(jìn)胃液分泌，臨床用于治療頭暈、頭痛及高血壓，是降血壓的特效中草藥［6］，對急性咽喉炎癥及皮膚病也有明顯療效［7］。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部發(fā)布的194 號公告指出：“自2020 年1 月1 日起，退出除中藥外的所有促生長類藥物飼料添加劑品種； 自2020 年7 月1 日起，飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑（中藥類除外）的商品飼料。 ”194 號公告的發(fā)布， 旨在減少畜牧業(yè)生產(chǎn)中濫用抗生素對畜產(chǎn)品安全和公共衛(wèi)生安全造成的危害， 進(jìn)一步提高動(dòng)物營養(yǎng)水平，調(diào)整飼料營養(yǎng)設(shè)計(jì)，選用新型綠色添加劑產(chǎn)品，因此，尋找抗生素的替代品成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。 綠色天然的植物提取物作為一種新型飼料添加劑，具有適口性好，有效成分明確，含量可檢測，安全性、穩(wěn)定性和利用率高，無殘留及無毒副作用的特點(diǎn)， 且通過對植物提取物中豐富的生物活性成分進(jìn)行組合，制備復(fù)方制劑，可發(fā)揮更確切、 更高效的作用， 是抗生素的理想替代品之一，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)［8］。

植物提取物富含黃酮、多酚、生物堿、皂苷等多種生物活性物質(zhì)，具有抑制病原微生物、增強(qiáng)免疫功能、提高抗氧化能力、改善機(jī)體健康、提升生產(chǎn)性能和畜產(chǎn)品品質(zhì)等作用［9］。 黃酮是普遍存在于植物中的一種天然抗氧化劑，多具有藥物活性，如抗氧化［10］、抑菌［11］和抗炎［12］等作用。生物堿類為藥用植物有效成分，具有抗腫瘤［13］、抗菌［14］、鎮(zhèn)痛［15］、抗炎［16-17］等功效。多酚具有多個(gè)酚基團(tuán)，有抗氧化［18］、抗菌［19］、促進(jìn)腸胃消化、降低血脂以及提高身體抵抗力等多種生物活性作用。 皂苷是苷元為三萜或螺旋甾烷類化合物的一類糖苷，具有解熱、鎮(zhèn)靜、抗癌及抗菌等有價(jià)值的生物活性［20］。 植物提取物的提取工藝在較大程度上決定了提取物產(chǎn)品生物活性成分的占比及作用。 提取植物有效成分常用的方法有索式抽提法、回流提取法、搖床振蕩醇提法、超聲提取法、滲漉法等［21］。

該研究選用生物活性物質(zhì)含量豐富、藥用價(jià)值高、提取方法多樣且在內(nèi)蒙古地區(qū)生長茂盛的一年生菊科植物——豬毛蒿為試驗(yàn)材料， 采用冷凝管回流提取法，以乙醇為萃取溶劑，通過單因素篩選及正交試驗(yàn)優(yōu)化，以提取物得率為評價(jià)指標(biāo)，確定豬毛蒿生物活性物質(zhì)醇提最佳提取工藝條件，以期為開展豬毛蒿有效成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 全株豬毛蒿樣本

在系統(tǒng)動(dòng)物營養(yǎng)學(xué)——營養(yǎng)活性物質(zhì)組學(xué)［22］的指導(dǎo)下，選擇菊科植物豬毛蒿作為試驗(yàn)材料。全株豬毛蒿樣本于2020 年8 月采自內(nèi)蒙古自治區(qū)鄂爾多斯市鄂托克前旗。

1.1.2 儀器與耗材

粉碎機(jī)（Retsch SM100）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（EYELA OSB-2100）、凍干機(jī)（LGJ-10FD 松源凍干）、電子天平（METTLER TOLEDO）、圓底蒸餾瓶（1 000 mL）、燒杯（500 mL）、冷凝管、蝴蝶夾、紗布（400 目）、玻璃培養(yǎng)皿、錫紙、自封袋等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 提取方法

采用冷凝管回流提取法，以易揮發(fā)的乙醇作為提取溶劑，將浸出液水浴加熱蒸餾，乙醇溶劑餾出后又被冷卻， 重復(fù)流回圓底燒瓶浸提原料，直至有效成分回流提取完全［23］。 按中醫(yī)藥學(xué)處理中藥藥材的方法，將全株豬毛蒿置于陰涼通風(fēng)處干燥后切成10～15 mm 長的小段進(jìn)行粉碎。 稱取豬毛蒿粉末10 g 裝入1 000 mL 圓底蒸餾瓶，加入不同濃度乙醇，設(shè)定不同料液比、提取溫度和提取時(shí)間進(jìn)行回流提取。 提取液用400 目紗布進(jìn)行初步過濾。每次試驗(yàn)回流提取3 次，將3 次提取液混合后的濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行濃縮， 再將濃縮液進(jìn)行冷凍干燥，對得到的提取物進(jìn)行稱重，計(jì)算得率。

1.2.2 單因素試驗(yàn)

假定該研究中各單因素沒有交互作用，對其中的一個(gè)因素進(jìn)行試驗(yàn)，將其他因素固定。 在篩選料液比因素時(shí)，固定乙醇濃度65%，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2.5 h；在篩選不同乙醇濃度時(shí)，固定料液比1∶8，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間2.5 h；在篩選不同提取溫度時(shí)，固定乙醇濃度65%，料液比1∶8，提取時(shí)間2.5 h；在篩選不同提取時(shí)間時(shí)，固定乙醇濃度65%，料液比1∶8，提取溫度75℃。

1.2.3 正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上， 以提取物得率為指標(biāo)，開展以乙醇濃度、料液比、提取溫度和提取時(shí)間為四因素三水平的L9（34）正交試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)見表1。提取物得率=所得提取物質(zhì)量/所用植物粉末質(zhì)量×100%。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 軟件進(jìn)行原始數(shù)據(jù)處理， 利用SPSS 25.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，通過方差分析比較不同數(shù)據(jù)組間的差異，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著，P＞0.05 為差異不顯著，應(yīng)用GraphPad 8.0 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取工藝條件對豬毛蒿提取物得率的影響

從圖1 乙醇濃度對豬毛蒿提取物得率的影響、圖2 料液比對豬毛蒿提取物得率的影響、圖3提取時(shí)間對豬毛蒿提取物得率的影響、 圖4 提取溫度對豬毛蒿提取物得率的影響， 以及表2 不同提取工藝條件對提取物得率的影響可以看出，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度等不同影響因素對豬毛蒿提取物得率的影響均較大。 單因素乙醇濃度為50%時(shí)提取物得率最高，1、2、3 組得率分別為19.6%、19.8%、15.0%， 平均值18.13%；單因素料液比1∶7 時(shí)得率最高，1、5、8 組得率分別為19.6%、21.0%、11.0%，平均值17.2%；單因素提取時(shí)間3.0 h 時(shí)得率最高，3、5、9 組得率分別為15.0%、21.0%、17.5%，平均值17.83%；單因素提取溫 度75 ℃時(shí) 得 率 最 高，2、5、7 組 得 率 分 別 為19.8%、21.0%、18.1%，平均值19.63%。

表2 不同提取工藝條件對提取物得率的影響

2.2 不同工藝條件對極差R 值的影響

從表3 可以看出，比較各因素極差R 值，影響豬毛蒿醇提物得率的主要因素是乙醇濃度； 提取溫度、提取時(shí)間和料液比是次要影響因素；它們的主次順序是：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。 由表3 可知，由正交試驗(yàn)優(yōu)化的最優(yōu)組合為A2B1C3D2，即豬毛蒿醇提物有效成分最佳提取工藝條件是：乙醇濃度65%，料液比1∶7，提取時(shí)間3.0 h，提取溫度75 ℃，在該條件下豬毛蒿醇提物的得率最高。

表3 不同工藝條件對極差R 值的影響

2.3不同工藝條件的方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果表明（見表4），提取溫度對豬毛蒿醇提物得率影響差異極顯著（P＜0.01），乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3 個(gè)因素對提取物得率影響差異不顯著（P＞0.05）。

表4 方差分析結(jié)果

3 討論

由不同影響因素組合成的不同提取工藝會(huì)提取出植物中不同的活性成分。 而在最佳提取工藝條件的確定中，由于同一因素在不同條件下會(huì)影響植物提取物得率，同時(shí)，不同因素在各自不同條件下會(huì)對提取物得率產(chǎn)生交互作用［24］。 在單因素試驗(yàn)中，只能逐步對每個(gè)因素進(jìn)行考查，而將其他因素設(shè)為固定。該研究在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以提取物得率為評價(jià)指標(biāo)，通過回流工藝提取豬毛蒿提取物并對工藝條件進(jìn)行優(yōu)化。

該研究中，在乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間、提取溫度4 個(gè)因素中， 提取溫度對豬毛蒿提取物得率影響差異極顯著， 是影響豬毛蒿乙醇提取效果的主要因素。研究表明，以不同濃度的乙醇作為萃取溶劑， 對活性成分的溶解能力及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響程度不同［23］。一般來說，乙醇作為萃取溶劑提取出的植物主要生物活性成分有黃酮類［25-27］、多酚類［28］、生物堿類［29］、三萜類化合物［30］等次生代謝產(chǎn)物，包含酮、萜、醚、酚和炔等基團(tuán)化學(xué)結(jié)構(gòu)，較為穩(wěn)定。而這些有機(jī)官能團(tuán)雖然化學(xué)性質(zhì)不同，但可通過相互作用維持生物體機(jī)能［22］。在該研究中，隨著乙醇濃度的升高，豬毛蒿提取物得率顯著降低，可能的原因是隨著乙醇濃度升高，水的比例減少，所得提取物中脂溶性成分多，分子量小，得率低；而65%乙醇濃度可促進(jìn)乙醇分子和水分子在細(xì)胞內(nèi)外的流動(dòng)［31］，即此時(shí)可將脂溶性成分和水溶性成分都提取出來，且提取物相對分子量較大［32］，提取物得率較高。該研究顯示，提取溫度對得率的影響是隨著溫度的上升，得率先增后減，在75 ℃達(dá)到最大值，此后大幅下降。可能的原因是隨著溫度的升高，活性成分的分子擴(kuò)散速度不斷加快，多數(shù)物質(zhì)的溶解度不斷增加，得率增大。而乙醇的沸點(diǎn)為78.3 ℃，當(dāng)提取溫度高于此溫度時(shí)，一些熱敏性成分遭到破壞而造成得率下降， 且乙醇會(huì)大量揮發(fā)，提取成本也大大增加［33］。用乙醇作為萃取溶劑的溫度一般為55～60 ℃， 以防止有效成分溶解度降低或失去活性，而若提取溫度過高（>90 ℃）就會(huì)破壞活性成分的結(jié)構(gòu)［34，2］。在提取豬毛蒿有效成分時(shí)，料液比為1∶7 時(shí)得率最高，說明此時(shí)提取物活性成分已接近全部溶出。 雖然此時(shí)得率與料液比為1∶9 時(shí)幾乎持平， 但出于對節(jié)省乙醇溶劑和保護(hù)環(huán)境的目的選擇料液比為1∶7 效果更佳， 這與徐燕燕等［2］對荷葉總黃酮提取工藝優(yōu)化研究中得到的結(jié)果相符。因此，綜合考慮生產(chǎn)成本及提取效果，該研究選取較優(yōu)的提取料液比為1∶7。 隨著提取時(shí)間的增加，提取物得率增加，在2.5 h 后增加速度加快，在3.0 h 時(shí)得率達(dá)最大值。 可能的原因是隨著提取溶劑和溶質(zhì)在提取裝置中不斷回流，增強(qiáng)了提取物分子間的碰撞， 有助于增加提取物得率； 但也有研究表明提取時(shí)間過長產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)不僅會(huì)被破壞， 有些類別的化合物也會(huì)隨著溶劑的不斷蒸發(fā)有所損失或降解［35］，從而引起提取量降低。如果提取時(shí)間不夠，就無法使豬毛蒿中的有效成分充分溶出，造成提取不完全。而提取時(shí)間越長，溫度越高，得率相對越大［36］。因此，最佳提取時(shí)間為3.0 h。

4 結(jié)論

在實(shí)驗(yàn)室條件下，以乙醇為萃取溶劑，提取物得率為主要指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，確定豬毛蒿有效成分的最佳提取工藝條件是： 乙醇濃度65%，料液比1∶7，提取溫度75 ℃，提取時(shí)間3.0 h。 提取溫度為主要影響因素，乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間是次要影響因素；影響提取物得率的主次順序是：提取溫度＞乙醇濃度＞提取時(shí)間＞料液比。