基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的不同年限陳皮入血成分分析

吳 蓓，申夢園，王 福，陳鴻平，劉友平，陳 林

成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院 西南特色中藥資源國家重點實驗室，成都 611137

陳皮為蕓香科植物橘CitrusreticulataBlanco及其栽培變種的干燥成熟果皮[1]，自古認為產(chǎn)自廣東新會的陳皮質(zhì)量較優(yōu)。傳統(tǒng)上認為其有理氣健脾、燥濕化痰之功，用于治療脘腹脹滿、食少吐瀉、咳嗽痰多等癥[1]。陳皮主要含有黃酮、揮發(fā)油、生物堿、檸檬苦素等類化學(xué)成分[2]，現(xiàn)代藥理表明，其有降血脂[3]、抗氧化[4]等作用，并廣泛應(yīng)用于臨床。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥理論認為陳皮應(yīng)陳化后使用。但是，對于陳皮具體陳化時間，歷代本草書籍說法不一，《藥鑒》載有“陳皮須用隔年陳”，又稱“陳皮必須年久者為美”[5]；《本草要略》云“陳皮隔年者方可用”；《日用本草》載：“陳皮多年者更妙”。即使是同一古籍，對于陳皮陳化時間尚未明確?，F(xiàn)代對陳皮陳化年限的研究多從化學(xué)成分和藥效作用比較方面，且多從體外對不同陳化時間廣陳皮的化學(xué)成分進行研究。課題組前期已通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對不同陳化時間的廣陳皮中黃酮類成分進行分析。大多數(shù)中藥仍通過口服給藥方式應(yīng)用，通過分析口服給藥后血清中化學(xué)成分，確定中藥的體內(nèi)直接作用物質(zhì)，成為快速、準確研究及確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)的有效途徑[6]。目前，對廣陳皮體內(nèi)成分鮮有報道。

本研究首次采用具有高分離度、高分辨率以及高靈敏度的超高效液相色譜-四極桿-靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜(UHPLC-Q-Orbitrap HRMS)技術(shù)，對不同年份廣陳皮進行入血成分比較研究，為廣陳皮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥效學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器

Q-Exactive型超高效液相色譜聯(lián)用儀(美國Thermo公司)；Agilent Extend-C18色譜柱(3.0 mm × 100 mm，1.8 μm)，十八烷基鍵合硅膠為填充劑(美國Agilent公司)；電子天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；ST18型臺式離心機(美國Thermo公司)；V76025型真空減壓干燥器(美國Thermo公司)。

1.2 材料

1.2.1 藥材及試劑

于廣東省江門市新會區(qū)三江鎮(zhèn)新馬單村，收集陳化2、4、8年(分別于2019、2017、2013年采集)的廣陳皮樣品(同一環(huán)境下貯存)各1批，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院嚴鑄云教授鑒定為蕓香科植物陳皮Citrusreticulate‘Chachi’的干燥果皮。經(jīng)檢驗，藥材質(zhì)量符合《中華人民共和國藥典》2020年版一部中對陳皮的質(zhì)量要求。對照品橙皮苷(批號為MUST-20031701，純度為98.46%)、川陳皮素(MUST-20041210，98.86%)、橘皮素(MUST-20072310，99.61%)購于成都曼思特生物科技有限公司；對羥基苯甲酸乙酯(批號為2020052601)購于成都市科隆化學(xué)品有限公司；水為超純水，甲醇、乙腈、乙酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

1.2.2 動物

健康雄性SD大鼠，40只，SPF級，體質(zhì)量(180±20)g，由四川成都達碩實驗動物有限公司提供，動物許可證號為SCXK(川)2020-030。實驗方案經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗倫理委員會審批同意，倫理審查批準號為2021-11。

1.3 方法

1.3.1 廣陳皮提取液的制備

分別稱取2、4、8年廣陳皮樣品各250 g，打碎置鍋中，加入10倍量水浸泡1 h，文火微沸煎煮30 min，濾過，藥渣加入8倍量水，文火微沸繼續(xù)煎煮30 min，再次濾過，合并兩次濾液，濃縮至0.4 g/mL，供灌胃用。

1.3.2 對照品溶液的制備

分別精密稱取對照品橙皮苷、橘皮素、川陳皮素適量，加甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度為0.159、0.126、0.147 g/L的混合對照品溶液。

1.3.3 內(nèi)標溶液的制備

準確稱取對羥基苯甲酸乙酯25 mg，加甲醇溶解，定容至25 mL容量瓶中。

1.3.4 供試品溶液的制備

取1.3.1項下廣陳皮提取液1 mL，至EP管中，稀釋十倍，在13 000 r/min離心10 min，取上清液，供LC-MS分析用。

1.3.5 動物給藥與血漿樣品采集

雄性SD大鼠飼養(yǎng)于成都中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗房，室溫控制在20～25 ℃，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，自由進食及飲水。連續(xù)灌胃3天，每天早晚各一次。末次給藥前禁食12 h，自由飲水。空白組給予生理鹽水。給藥組按0.4 g/mL劑量廣陳皮提取物灌胃給予大鼠，為盡可能多地檢測到含藥血漿中的成分，選取0.5、1、1.5、2、3、4 h總共6個時間點進行眼眶靜脈叢取血(左、右眼交叉取血約0.3 mL)，將血樣收集至裝有肝素鈉的EP管中，室溫靜置30 min，在3 000 r/min離心10 min，取上層血漿，儲存在-20 ℃冰箱中，備用。

1.3.6 血漿樣品處理

取給藥后各時間點血漿樣品等體積混合，得到600 μL血漿樣本，加入3倍量甲醇，并加入100 μL內(nèi)標溶液渦旋5 min后，在4℃、13 000 r/min離心10 min，取上清液至干凈EP管中，真空干燥至干，固體殘渣加100 μL甲醇復(fù)溶，渦旋5 min，在13 000 r/min離心10 min后，取上清液供LC-MS分析用。

1.3.7 色譜條件

Agilent Extend C18色譜柱(3.0 mm × 100 mm，1.8 μm)，流動相為0.5%乙酸水溶液(A)-0.5%乙酸乙腈溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，8%→15%B；10～20 min，15→20%B；20～30 min，20%→24%B；30～45 min，24%→64%B；45～60 min，64%→100%B)，流速為0.3 mL/min，柱溫為30 ℃。進樣量為5 μL。

1.3.8 質(zhì)譜條件

采用電噴霧離子源(ESI)，正、負離子切換模式掃描，掃描范圍為m/z100～1 500，F(xiàn)ull MS一級分辨率為35 000，二級分辨率為17 500；正、負離子噴霧電壓分別為3.5和-3.0 kV；離子源溫度為350 ℃，鞘氣流速為35 arb，輔助氣流速為10 arb，離子傳輸管溫度為320 ℃。S狀透鏡電壓(S-Lens)為50 V，碰撞能量梯度為20、40、60 eV。

2 結(jié)果與分析

依據(jù)“1.3.7”項色譜條件及“1.3.8”項質(zhì)譜條件進行分析，在正、負離子模式下采集給藥后血漿的色譜圖(見圖1～6)。

圖1 負離子模式下2年廣陳皮血漿 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖

利用Compound Discover 3.0軟件，將實驗所得數(shù)據(jù)的分子式和分子質(zhì)量與mzcloud和mzvault數(shù)據(jù)庫進行匹配，設(shè)置一級及二級質(zhì)量偏差5 ppm，匹配度分值大于80。分析大鼠灌胃廣陳皮藥液后的給藥血漿與空白血漿、廣陳皮提取液的差異，獲得入血成分。對于有對照品的化合物，通過與對照品比對保留時間、特征碎片離子來確定其結(jié)構(gòu)及分子式，對于沒有對照品的化合物，根據(jù)文獻及碎片離子信息進行成分推測鑒定。結(jié)果，鑒定出2年陳皮入血原型成分和代謝產(chǎn)物分別為16個和18個；4年陳皮入血原型成分和代謝產(chǎn)物各為12個；8年廣陳皮入血原型成分和代謝產(chǎn)物分別為7個和8個(見表1)。

表1 2、4、8年廣陳皮入血成分

續(xù)表1(Continued Tab.1)

續(xù)表1(Continued Tab.1)

圖2 負離子模式下4年廣陳皮血漿 UHPLC-Q-Orbitrap HRMS的總離子流圖

圖3 負離子模式下8年廣陳皮血漿UHPLC-Q-Orbitrap HRMS 的總離子流圖

圖4 正離子模式下2年廣陳皮血漿(a)、空白血漿樣品(b)及2年廣陳皮提取液(c)的總離子流圖

圖5 正離子模式下4年廣陳皮血漿(d)、空白血漿樣品(b)及4年廣陳皮提取液(e)的總離子流圖

2.1 黃酮苷元化合物鑒定

從大鼠的血漿中共鑒定出7個黃酮苷元，其中以川陳皮素為例做裂解規(guī)律分析。通過MS1圖譜確定其準分子離子峰為m/z403.138 9 [M+H]+，預(yù)測分子式為C20H20O8；MS2圖譜中，碎片離子為m/z313.960 2，主要是由母離子脫掉6個甲氧基團(C6H18，90)形成，碎片離子為m/z163.989 9和240.060 0，主要是由母離子斷裂1，2位和3，4位之間的共價鍵形成，碎片離子為m/z196.017 0，是由m/z240.060 0碎片離子脫去一個二氧化碳(CO2，44)形成，經(jīng)過與文獻[8]比對，其質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫與川陳皮素一致，因此鑒定化合物31為川陳皮素，裂解規(guī)律如圖7所示。

圖6 正離子模式下8年廣陳皮血漿(f)、空白血漿樣品(b)及8年廣陳皮提取液(g)的總離子流圖

圖7 川陳皮素的裂解途徑

2.2 黃酮醇類化合物

黃酮醇化合物的裂解主要是特征的丟失CHO。通過MS1圖譜確定其準分子離子峰為m/z389.123 2 [M+H]+，預(yù)測分子式為C20H20O8；MS2圖譜中，碎片離子為m/z345.097 0，主要是由母離子脫去(CH3CHO，44)形成；碎片離子為m/z317.119 1，主要由碎片離子m/z345.097 0脫去一分子CO形成；碎片離子為m/z197.020 4和193.122 8主要由1，2位和3，4位共價鍵斷裂形成；碎片離子為m/z197.020 4也可能由碎片離子m/z345.097 0脫去碎片(C9H9O2149)形成。與文獻[18]數(shù)據(jù)對比，化合物25與艾黃素質(zhì)譜數(shù)據(jù)一致，因此鑒定化合物25為艾黃素，裂解規(guī)律如圖8所示。

圖8 艾黃素的裂解途徑

2.3 不同陳化時間廣陳皮中黃酮類入血成分的相對含量比較

依據(jù)內(nèi)標品峰面積，計算2、4、8年廣陳皮黃酮類入血成分相對含量，發(fā)現(xiàn)陳化2年廣陳皮黃酮類入血成分相對含量較陳化4、8年廣陳皮高(見表2)。

表2 不同陳化時間廣陳皮黃酮類入血成分的相對含量比較(n=3)

3 討論與結(jié)論

中藥陳用歷史悠久，陳皮為“六陳”之首，結(jié)合歷代本草著作和現(xiàn)代研究，陳皮的具體陳化時間問題尚未解決。課題組前期通過UHPLC-Q-Orbitrap HRMS技術(shù)對不同陳化時間的廣陳皮中黃酮類成分進行分析，從體外角度已證明“陳皮須用隔年陳”具有一定合理性。

本實驗基于UHPLC-Q-Orbitrap HRMS快速、精確的特點，固定采收時間、采樣地點、貯藏環(huán)境等條件，首次對不同年限廣陳皮進行入血成分比較分析，鑒定出陳化2年、4年和8年廣陳皮入血成分分別為34、24和15個。實驗發(fā)現(xiàn)，3個年份廣陳皮入血成分種類大致相同，依據(jù)峰面積比較相對含量，2年廣陳皮較其他兩個年份高，與前期體外實驗結(jié)果較一致，證明廣陳皮化學(xué)成分含量的差異會導(dǎo)致其入血成分含量的差異，可為“陳皮須用隔年陳”[18]的闡釋提供進一步依據(jù)。

陳皮主要成分為黃酮類化合物，陳皮中黃酮類化合物具有保護肝損傷[23,24]，降低血脂[25]等作用。川陳皮素是神經(jīng)保護的代表性成分，可通過激活p-Akt、p-CREB、BDNF和Bcl-2通路及改善大鼠BBB通透性保護腦缺血[26]。橘皮素可以通過線粒體JNK/Baxpathway對心肌細胞產(chǎn)生抗凋亡作用[27]。異橙黃酮對HL-60、A549、HO8910和MCF-7四種癌癥細胞顯示出明顯的抗增殖作用[28]。艾黃素具有抗氧化、抗炎及抗病毒的作用[29]。結(jié)合陳皮傳統(tǒng)功效和現(xiàn)代藥理研究，初步推斷，川陳皮素、橘皮素等7個黃酮類成分可能是廣陳皮潛在的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，后期仍需進行生物活性測定和藥效評價，并從中篩選能夠表達與中藥傳統(tǒng)臨床療效相關(guān)活性的成分作為藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。本實驗為陳皮的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究提供了一個新的有效的方法，后期可對不同年限廣陳皮入血成分進行比較研究，且結(jié)合藥效共同闡釋陳皮“陳久者良”科學(xué)內(nèi)涵。

對于一些同分異構(gòu)體，Compound Discoverer 3.0軟件只能從其碎片信息中提取到一些母核離子的具體信息進行結(jié)構(gòu)上的推測，并不能對同分異構(gòu)體進行區(qū)分，還需結(jié)合核磁共振技術(shù)對這些同分異構(gòu)體進行結(jié)構(gòu)鑒定[30]。