寧夏地區(qū)牛支原體藥物敏感性分析

李 勇，孔陽(yáng)陽(yáng)，郭亞男

（1.寧夏職業(yè)技術(shù)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2.寧夏農(nóng)林科學(xué)院，寧夏 銀川 750002）

牛支原體（Mycoplasma bovis，M.bovis）能引起牛的肺炎、乳房炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎和生殖系統(tǒng)障礙， 也是牛呼吸系統(tǒng)疾病（bovine respiratory disease，BRD）的主要病原之一［1］。 該病在世界范圍內(nèi)流行，我國(guó)于2008 年首次報(bào)道了肉牛的支原體肺炎，發(fā)病率50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失［2］。 M.bovis 通常與其他病毒或細(xì)菌發(fā)生混合型感染， 能在被感染組織的黏膜表面定殖， 并有效抑制機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)其產(chǎn)生作用［3］。 當(dāng)前對(duì)于M.bovis 尚無(wú)有效疫苗，主要控制措施是抗生素治療［4］。 M.bovis 無(wú)細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，不能合成葉酸，對(duì)內(nèi)酰胺酶類和磺胺類藥物不敏感［5］。 研究顯示，M.bovis 易受到干擾自身蛋白質(zhì)或DNA 合成的藥物影響，臨床上常用如喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類、氨基糖苷類抗生素進(jìn)行治療，但是這些藥物普遍存在治療周期長(zhǎng)、療效差、耐藥性產(chǎn)生快等缺點(diǎn)［6］。

體外藥物敏感性分析不但能為臨床治療篩選敏感藥物，提高治療效果，還可用于監(jiān)測(cè)M.bovis耐藥性產(chǎn)生的趨勢(shì)。因此，該研究收集了寧夏地區(qū)規(guī)模化牛場(chǎng)發(fā)生的肺炎、關(guān)節(jié)炎、臨床型乳房炎病例中分離鑒定的74 株M.bovis，采用微量肉湯稀釋法對(duì)慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素、恩諾沙星進(jìn)行體外藥物敏感性分析，以期為臨床治療M.bovis提供科學(xué)合理的用藥參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株來(lái)源

74 株M.bovis 分離自寧夏銀川、石嘴山、吳忠和固原地區(qū)規(guī)?；?chǎng)患有肺炎（n=35）、臨床型乳腺炎（n=18）、關(guān)節(jié)炎（n=21）病牛的肺組織、乳汁、關(guān)節(jié)液。所有菌株由寧夏農(nóng)林科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基與藥品

PPLO 培養(yǎng)基，北京索萊寶公司產(chǎn)品；恩諾沙星、慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素可溶性粉針劑，金克?。ū本┥锛夹g(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 M.bovis 的復(fù)蘇與鑒定

將存于-20 ℃含20%甘油的M.bovis 菌液，吸取100 μL 接種于PPLO 液體培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48～72 h。 再取出20 μL 復(fù)蘇菌液接種至60 mm PPLO 瓊脂平板上。 隨后置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h， 顯微鏡下標(biāo)記出典型的M.bovis 單菌落（荷包蛋樣菌落），將其再接種于PPLO 液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。 取培養(yǎng)物進(jìn)行16S rDNA 通用PCR 和uvrC 特異性PCR 檢測(cè)［7］。

1.2.2 M.bovis 顏色變化單位的測(cè)定

將復(fù)蘇鑒定后的M.bovis 用PPLO 液體培養(yǎng)基作10 倍遞增稀釋， 置于37 ℃CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，觀察培養(yǎng)液顏色，當(dāng)顏色由紅色變?yōu)辄S色表示有M.bovis 生長(zhǎng)。 以出現(xiàn)顏色變化的最后1 管對(duì)應(yīng)的M.bovis 稀釋倍數(shù)作為顏色變化單位，表示為CCU/mL。

1.2.3 抗菌藥液的配制

根據(jù)慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素、恩諾沙星的藥物特性，用相應(yīng)溶劑將其溶解（恩諾沙星先用0.1 mol/L 氫氧化鈉溶解）， 然后用去離子水將藥液稀釋為1 mg/mL 儲(chǔ)存液。 抗菌藥液定容前，將pH 值調(diào)至7.0， 以避免導(dǎo)致M.bovis 培養(yǎng)物出現(xiàn)非特異性顏色變化。 所有抗菌藥液配成貯存濃度后，再經(jīng)0.2 μm 的微孔濾器過(guò)濾除菌，避免光照，將貯存液保存于-80 ℃?zhèn)溆茫褂们皩?chǔ)存液用去離子水稀釋至所需工作液濃度，工作液保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測(cè)定

采用微量肉湯稀釋法測(cè)定M. bovis 的MIC值。取96 孔板，在1～9 列各孔中加入pH 值7.6 的100 CCU PPLO 液體培養(yǎng)基，然后在第1 列中加入工作濃度的抗菌藥液， 充分混勻后從各孔中取100 μL 加至第2 列各孔， 照此倍比稀釋至第9 列后，棄去100 μL，使各孔體積相同。在第10 列各孔中加100 μL PPLO 培養(yǎng)基作為M.bovis 生長(zhǎng)的陽(yáng)性對(duì)照； 第11 列各孔中加入200 μL pH 值6.8 的呈黃色PPLO 培養(yǎng)基作對(duì)照；第12 列各孔中加入200 μL 培養(yǎng)基作為無(wú)菌陰性對(duì)照呈紅色。

將復(fù)蘇鑒定后的M. bovis 菌液按1∶10 的比例接種至PPLO 液體培養(yǎng)基，置37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h， 菌量達(dá)到108～109CCU/mL 后，再將菌液稀釋至104CCU/mL 后備用。 在1～9 列各孔中加100 μL 預(yù)先稀釋好的菌液；第10 列各孔中加100 μL 菌液；第11、12 列不加菌液。 為確保結(jié)果的準(zhǔn)確性，每株菌可做2～3 次重復(fù)。 將以上96 孔板用封口膜密封，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h， 依次觀察每列各孔內(nèi)顏色并做記錄，分別與陽(yáng)性對(duì)照第10 列和陰性對(duì)照第12 列進(jìn)行比較，以不發(fā)生顏色變化的最低藥物濃度為MIC值。 根據(jù)4 種抗生素對(duì)不同菌株MIC 值的范圍，分別計(jì)算出各自能抑制50%分離菌株的最低濃度MIC50值和能抑制90% 分離株的最低濃度MIC90值。

1.2.5 M.bovis 對(duì)藥物敏感性判斷標(biāo)準(zhǔn)

判定結(jié)果參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)（CLSI）的指導(dǎo)方案評(píng)估對(duì)抗菌藥物的耐藥性或敏感性［8］，根據(jù)MIC 值將M. bovis 對(duì)所測(cè)藥物的敏感性分為敏感（susceptible，S）、中度敏感（intermediate，I）和耐藥（resistant，R），M.bovis 藥物敏感性判定折點(diǎn)見(jiàn)表1。

表1 M.bovis 對(duì)部分抗菌藥物敏感性判定折點(diǎn)單位：μg/mL

2 結(jié)果與分析

2.1 最低抑菌濃度的測(cè)定結(jié)果

4 種抗生素最低抑菌濃度分布見(jiàn)圖1～圖4。通過(guò)對(duì)74 株M. bovis 藥物敏感性分析， 結(jié)果顯示，4 種抗生素呈不同程度的耐藥性。 慶大霉素的MIC 值分布在＜4～512 μg/mL，MIC 呈U 形分布，MIC504 μg/mL，MIC90512 μg/mL，其中有34%的菌株敏感，30%的菌株中度敏感，36%的菌株產(chǎn)生耐藥性。 大觀霉素的MIC 值分布在＜4～512 μg/mL，MIC 也呈U 形分布，MIC50與MIC90分別為4 μg/mL 和256 μg/mL，有66%的菌株敏感，22%的菌株中度敏感，12%的菌株產(chǎn)生耐藥性。 卡那霉素的MIC 值 分 布 在＜4 ～512 μg/mL， MIC508 μg/mL，MIC90512 μg/mL，有34%的菌株敏感，30%的菌株呈中度敏感，36%的菌株產(chǎn)生耐藥性。 恩諾沙星的MIC 值 分 布 在＜4 ～128 μg/mL， MIC50＜4 μg/mL，MIC9016 μg/mL，61%的菌株MIC 值＜4 μg/mL，22%的菌株對(duì)其產(chǎn)生了耐藥性。 恩諾沙星的MIC 分布范圍最小，MIC50與MIC90值也最小，其次是大觀霉素、慶大霉素和卡那霉素；試驗(yàn)菌株對(duì)大觀霉素的耐藥率最低（12%），其次為恩諾沙星（22%），對(duì)慶大霉素和卡那霉素的耐藥率最高且相同（36%）。

圖1 慶大霉素最低抑菌濃度分布

圖2 大觀霉素最低抑菌濃度分布

圖4 恩諾沙星最低抑菌濃度分布

2.2 不同樣本分離株最低抑菌濃度測(cè)定結(jié)果

4 種抗生素對(duì)不同樣本分離的M.bovis 最低抑菌濃度結(jié)果見(jiàn)表2。 通過(guò)對(duì)肺組織（n=35）、乳汁（n=18）、關(guān)節(jié)液（n=21）分離株的藥物敏感性分析和卡方檢驗(yàn)對(duì)比，結(jié)果顯示，各組間的MIC 差異不顯著。 肺和關(guān)節(jié)液分離株的MIC 分布范圍接近，且MIC50基本相同， 乳汁分離株的MIC 分布范圍最小，MIC50和MIC90也最小。

表2 不同樣本分離株最低抑菌濃度MIC50 和MIC90 的測(cè)定結(jié)果 單位：μg/mL

3 討論

近年來(lái)，隨著我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的迅速發(fā)展，異地運(yùn)輸已成為牛生產(chǎn)必不可少的環(huán)節(jié)， 雖然可以提高生產(chǎn)效率， 但也給動(dòng)物疫病的擴(kuò)散與傳播埋下隱患［8］。由于國(guó)內(nèi)外均無(wú)有效的M.bovis 商用疫苗或其他相關(guān)疫苗預(yù)防該病， 只能通過(guò)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和抗生素治療進(jìn)行有效防控。 但由于抗菌藥物的不合理應(yīng)用， 不同國(guó)家和地區(qū)的M.bovis 分離株已對(duì)臨床常用藥物呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，給該病原引發(fā)疾病的治療造成了困擾［9］。

該研究針對(duì)寧夏地區(qū)分離鑒定的74 株M.bovis 進(jìn)行常用藥物敏感性檢測(cè)，以期優(yōu)化臨床治療和用藥方案。試驗(yàn)結(jié)果表明，分離株的耐藥譜相同，74 株M.bovis 均對(duì)慶大霉素、 大觀霉素、卡那霉素、恩諾沙星呈現(xiàn)出不同程度的耐藥性，尤其對(duì)慶大霉素、卡那霉素的耐藥性最強(qiáng)，兩類藥物的MIC 值呈U 形分布， 有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)， 這與Soehnlen 等［10］和Sulyok 等［11］的 檢 測(cè) 結(jié) 果 基 本 一致。 值得注意的是， 盡管分離株對(duì)恩諾沙星最敏感，但對(duì)其耐藥率也達(dá)到了22%，該結(jié)果介于有些研究人員在以色列和日本的檢測(cè)結(jié)果（M.bovis 耐藥率分別為26%和12%）［12-13］。 在肺、乳汁、關(guān)節(jié)液分離株的藥物敏感試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)， 分離株均表現(xiàn)出相似的敏感性。 關(guān)節(jié)液分離株和肺分離株間的MIC50和MIC90十分接近，這也與Soehnlen 等［10］發(fā)現(xiàn)關(guān)節(jié)液分離株和肺部分離株在恩諾沙星的敏感性水平上沒(méi)有顯著差異是一致的。 乳汁分離株的MIC 值范圍最小，MIC 值也最小， 說(shuō)明其對(duì)4 種抗生素均相對(duì)敏感，耐藥性相對(duì)最低。 肺分離株的MIC 值最大， 說(shuō)明可能與呼吸道感染M.bovis概率大且頻繁使用抗生素有關(guān)。 綜上所述，在恩諾沙星、慶大霉素、大觀霉素、卡那霉素中，體外抑菌效果最好的是氟喹諾酮類藥物恩諾沙星，其次是氨基糖苷類藥物大觀霉素，但恩諾沙星較大觀霉素更易產(chǎn)生耐藥性，在使用時(shí)應(yīng)注意用藥劑量和時(shí)長(zhǎng)， 而M.bovis 對(duì)另外2 種氨基糖苷類藥物慶大霉素和卡那霉素的敏感性一般且耐藥性更強(qiáng)。