錳脅迫下鹽膚木錳富集及生理響應特征

王悟敏，胡佳瑤，劉文勝，曾文斌

(中南林業(yè)科技大學 生命科學與技術學院，長沙 410004)

錳礦的無序開采導致生態(tài)環(huán)境惡化，土壤錳(Mn)污染愈來愈嚴重，錳甚至會通過食物鏈危害人類的健康。如何有效修復大面積重金屬污染土壤已成為當前急需解決的關鍵問題。植物修復具有高效、環(huán)保和廉價等優(yōu)點，是重金屬污染土壤治理的有效方法之一，具有廣闊的應用前景[1]。篩選出優(yōu)良的修復植物并揭示其耐受機制是采用該技術修復重金屬污染土壤的關鍵。

錳作為植物必需的元素，參與植物的多種代謝過程，主要包括光合作用、葉綠素合成以及作為酶的輔因子，少量的錳可促進植物的生長[2]。然而，過量的錳元素會對植物造成脅迫。錳脅迫環(huán)境下植物體內會積累大量活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，使膜結構受到破壞，嚴重時會引起植株的死亡。植物錳毒性主要表現(xiàn)為生物量和光合作用減少，葉綠體的結構造成破壞以及生理生化機制紊亂[3]。而對于錳耐受性強的植物，植物體內會發(fā)生一系列生理生化反應來應對錳脅迫環(huán)境，如植物體內滲透調節(jié)物質含量、抗氧化酶活性以及丙二醛含量等均發(fā)生不同程度的變化[4-6]。植物對于重金屬錳具有一定的吸收累積能力，通常以Mn2+的離子態(tài)吸收。不同植物對重金屬錳的富集與轉運能力不一樣。一般植物體內錳含量為30～500 mg·kg-1，而錳耐受性植物對錳的積累遠遠超過這一值[7]。例如，美洲商陸(Phytolaccaamericana)[5]、短毛蓼(Polygonumpubescens)[8]和木賊(Equisetumhyemale)[9]等對錳均有較強的富集作用。但不同的植物積累錳的部位有所不同，錳被貯存在根系細胞或是被轉運到地上部分，由此耐錳性植物對錳的積累類型主要分為地上部富集型、根部囤積型和規(guī)避型3種[9]。

鹽膚木(Rhuschinensis)是漆樹科鹽膚木屬落葉小喬木或灌木，高可達10 m。該植物在中國境內分布廣泛，資源豐富，是中國主要經(jīng)濟樹種。鹽膚木適應能力強，耐干旱、耐貧瘠，抗逆性強。之前的研究表明該植物在重金屬鉻、銅、鉛脅迫下均表現(xiàn)出良好的耐受性，是廢棄地恢復的先鋒植物[10-12]。研究顯示該植物對銅、鉛、鎘、鉻均具有一定的富集與轉運能力[11-13]。Zhou等[14]研究發(fā)現(xiàn)鹽膚木可通過生理生化機制來減輕鉛的毒害作用。我們的前期研究表明，鹽膚木在錳礦區(qū)有較好的錳耐受性，同時該植物相比與草本植物具有生物量高、根系發(fā)達等特點，在重金屬污染土壤修復中具有較高的應用潛力。然而，目前對鹽膚木在錳脅迫下的耐性機制、對錳的富集與轉運能力以及錳積累類型尚未開展系統(tǒng)研究，這限制了該植物在錳污染土壤修復中的應用前景。

本試驗以鹽膚木作為研究對象，研究不同濃度錳脅迫下鹽膚木的生長、生理響應與重金屬積累特征的變化規(guī)律，旨在揭示鹽膚木對錳脅迫的耐受性機制和累積特征，為利用鹽膚木進行重金屬錳污染土壤的植物修復提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

鹽膚木果實于2019年11月中旬采自湖南省湘潭市錳礦廢棄地(27°58′N，112°51′E，海拔26 m)，該區(qū)土壤錳含量達52 319.25 mg·kg-1，鹽膚木種群平均高度約5 m。將采回的果實進行風干，待其呈褐色時去除果皮及其他雜質，將得到的種子裝入種子袋中于室溫保存。

1.2 盆栽試驗

2020年10月，參照徐莉清等[15]的方法將預處理后的鹽膚木種子放入人工培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)。2021年4月初，選取高度為10 cm、5～6片真葉、長勢一致的半年生鹽膚木幼苗為試驗材料。將這些幼苗轉移至直徑20 cm、高14 cm的花盆中，每盆3株鹽膚木幼苗。盆中培養(yǎng)基質由純沙和珍珠巖按照2∶1混合而成，幼苗適應生長2周，待其生長穩(wěn)定后加入錳溶液進行脅迫。錳濃度梯度設置為0(CK)、1、5、10和20 mmol·L-1，用Hoagland營養(yǎng)液溶解MnCl2·4H2O進行脅迫處理，對照組(CK)施以等量Hoagland營養(yǎng)液，每個濃度處理12盆。在脅迫20 d后測定幼苗的生物量、生理指標以及錳含量。脅迫期間使用去離子水保持培養(yǎng)基質濕潤，每3 d添加1次Hoagland營養(yǎng)液。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 生物量將脅迫后植株收獲，分成地上部分和地下部分。用去離子水充分洗凈，地下部分用0.2% EDTA浸泡2 h去除表面吸附錳離子，經(jīng)105 ℃殺青5 min，75 ℃烘干3 d至恒重，稱取地上部分和地下部分干重，并計算根冠比。 根冠比=地下部分生物量/地上部分生物量

1.3.2 光合色素含量取新鮮葉片用80%丙酮研磨提取，在紫外分光光度計下測646、663和470 nm處的吸光值，按Chavoushi等[16]的方法計算葉綠素含量[mg·g-1(鮮重)]和類胡蘿卜素含量。

1.3.3 滲透調節(jié)物質含量參照Pan等[17]的方法，用蒽酮比色法測定鹽膚木葉片中可溶性糖含量；考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量，以牛血清白蛋白(BSA)為標準；酸性茚三酮顯色法測定游離脯氨酸含量。

1.3.4 抗氧化物酶活性參照Gao等[18]的方法，取新鮮葉片于預冷的研缽中，用5 mL磷酸鹽緩沖液(0.05 mol·L-1，pH 7.8)將葉子研磨至勻漿，4 ℃下8 000 r·min-1離心15 min，取上清液待測。超氧化物歧化酶(SOD)活性用氮藍四唑(NBT)法測定，以抑制NBT光還原的50%為一個酶活性單位(U·g-1)；過氧化物酶(POD)活性用愈創(chuàng)木酚法測定，以每分鐘內OD470升高0.01為一個酶活性單位(U·g-1·min-1)；過氧化氫酶(CAT)活性用紫外吸收法測定，以每分鐘內OD240減少0.01為一個酶活性單位(U·g-1·min-1)。

1.3.5 丙二醛含量參照Gao等[18]的方法，取新鮮葉片用5%三氯乙酸磨成勻漿狀，3 000 r·min-1下離心10 min，獲得提取液。用硫代巴比妥酸法測定丙二醛(MDA)含量。

1.3.6 錳含量、生物富集系數(shù)和轉運系數(shù)將植株分成地上部分與地下部分烘干至恒重，用粉碎機打碎過篩(20目)后稱重。在馬福爐中300 ℃開爐門1 h，再500 ℃關爐門5 h，呈灰白色。冷卻后加2 mL 50% HCl，用水過濾至25 mL容量瓶，用原子吸收分光光度計(AA-70000，Shimadzu，Japan)測定錳含量[17]。并據(jù)此計算生物富集系數(shù)和轉運系數(shù)。生物富集系數(shù)為植物體內錳含量與基質錳含量的比值；轉運系數(shù)為地上部分錳含量與地下部分錳含量的比值。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 22.0對測量數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(ANOVA)，不同濃度之間用LSD法進行多重比較(P<0.05)，使用SigmaPlot 12.5繪圖。

2 結果與分析

2.1 錳脅迫對鹽膚木生長的影響

脅迫處理20 d后，鹽膚木在Mn2+濃度為0、1、5和10 mmol·L-1條件下生長發(fā)育狀況良好，地上部分沒有出現(xiàn)明顯的重金屬中毒現(xiàn)象，而且鹽膚木在5 mmol·L-1Mn2+條件下葉片舒展，葉片顏色較深；而在20 mmol·L-1Mn2+條件下鹽膚木部分葉片出現(xiàn)褐色斑點、萎蔫卷邊的現(xiàn)象(圖1)。

圖1 錳脅迫下鹽膚木葉片形態(tài)的變化Fig.1 Morphology changes of R. chinensis leaves under Mn2+ stress

表1顯示，鹽膚木生物量隨Mn2+濃度升高呈先增加后下降的趨勢。其中，鹽膚木地上部分干重在不同Mn2+濃度之間差異不顯著；地下部分干重和總干重在Mn2+濃度為5 mmol·L-1時最高，分別比CK顯著增加42.72%和31.73%，其余處理均與CK無顯著差異；根冠比在Mn2+濃度為1 mmol·L-1時最高，此時比CK增加13.32%，但各濃度脅迫處理與CK之間均無顯著差異(P>0.05)。這說明錳脅迫下鹽膚木生物量有下降的趨勢但沒有表現(xiàn)出明顯的毒害效應，表明其對高濃度錳具有一定的耐性。

表1 錳脅迫下鹽膚木單株生物量的變化

2.2 錳脅迫對鹽膚木葉片生理響應的影響

2.2.1 光合色素含量鹽膚木葉中葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均隨Mn2+濃度升高呈先升后降的變化趨勢，并均在Mn2+濃度為5 mmol·L-1時最高，此時分別比CK增加15.38%、7.33%和27.04%，且均在20 mmol·L-1Mn2+時最低，分別比CK降低12.19%、13.33%和10.24%，但各濃度脅迫處理大多與CK無顯著性差異(圖2，Ⅰ)。同時，鹽膚木葉中葉綠素a/b也在不同Mn2+濃度處理下無顯著變化(圖2，Ⅱ)。這說明各濃度錳脅迫對鹽膚木葉中光合色素含量無顯著影響，光合作用仍然能夠正常進行。

小寫字母表示不同濃度間差異顯著(0.05)，下同圖2 錳脅迫下鹽膚木幼苗葉中光合色素含量及葉綠素a/b的變化Different normal letters indicate significant differene among trecuments at 0.05 level, the same as belowFig.2 Changes of photosynthetic pigment content and chlorophyll a/b in leaves of R. chinensis seedling under Mn2+ stress

2.2.2 滲透調節(jié)物含量圖3顯示，鹽膚木葉中可溶性糖含量在Mn2+濃度為1 mmol·L-1時顯著低于CK，在5、10、20 mmol·L-1時均顯著高于CK，分別是CK的1.98、2.32和1.75倍(P<0.05)；其可溶性蛋白含量在各濃度下均不同程度高于CK，并在10、20 mmol·L-1時差異達到顯著水平，分別是CK的2.80、2.49倍；其游離脯氨酸含量在1、5 mmol·L-1時均稍低于CK，在10、20 mmol·L-1時顯著高于CK，分別是CK的1.85、1.18倍。其中，各滲透調節(jié)物含量均在10和20 mmol·L-1Mn2+時比CK顯著增加，并在10 mmol·L-1時達到最高。說明鹽膚木能夠在1～5 mmol·L-1Mn2+條件下正常生長，在10～20 mmol·L-1Mn2+脅迫條件下能夠通過積累可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸來有效緩解錳脅迫的傷害，但在濃度為20 mmol·L-1時各滲透調節(jié)物含量有降低趨勢。

圖3 錳脅迫下鹽膚木幼苗葉中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量的變化Fig.3 Changes of soluble sugar, soluble protein and free proline contents in leaves of R. chinensis seedling under Mn2+ stress

圖4 錳脅迫下鹽膚木幼苗葉中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)和過氧化氫酶(CAT)活性變化Fig.4 Changes of the superoxide dismutase (SOD), peroxidase(POD) and catalase(CAT) activities in leaves of R. chinensis seedling under Mn2+ stress

2.2.3 抗氧化物酶活性鹽膚木幼苗葉中SOD、POD和CAT活性均隨Mn2+濃度升高呈先增加后下降的趨勢(圖4)。其中，葉片SOD活性在Mn2+濃度為1～20 mmol·L-1時均顯著高于CK，是CK的1.27～1.44倍，并在10 mmol·L-1時最高；葉片POD和CAT活性均在5～20 mmol·L-1時顯著高于CK，分別是CK的2.12～3.15倍和1.81～3.40倍，并分別在5和10 mmol·L-1時達到最高。說明在1～10 mmol·L-1Mn2+脅迫下鹽膚木能夠通過提高抗氧化物酶活性來抵抗逆境，但當Mn2+濃度達到20 mmol·L-1時部分抗氧化物酶活性有降低趨勢。

2.2.4 丙二醛含量鹽膚木葉中MDA含量隨Mn2+濃度升高呈增加的趨勢(圖5)。其中，葉片MDA含量在Mn2+濃度為1～5 mmol·L-1時均與CK無顯著差異，在20 mmol·L-1時則比CK顯著增加(P<0.05)；在Mn2+濃度為5、10和20 mmol·L-1時，MDA含量分別是CK的1.45、1.89和2.30倍。說明當Mn2+濃度達到10 mmol·L-1后，鹽膚木受到一定程度的損傷，葉片細胞膜脂過氧化，導致鹽膚木體內的MDA含量增加。

圖5 錳脅迫下鹽膚木幼苗葉中MDA含量變化Fig.5 Changes of MDA content in leaves of R. chinensis seedling under Mn2+ stress

2.3 錳脅迫對鹽膚木富集特征的影響

2.3.1 錳含量鹽膚木幼苗地上部分、地下部分錳含量以及總錳含量均隨Mn2+濃度升高呈逐漸增加的趨勢，且各濃度錳脅迫處理均顯著高于CK，分別為CK的12.93～60.30倍、9.20～24.65倍和11.10～40.51倍(圖6)。其中，Mn2+濃度為20 mmol·L-1時，鹽膚木幼苗地上部分、地下部分以及總錳含量分別為3 116.88、3 709.97和3 316.01 mg·kg-1。

圖6 錳脅迫下鹽膚木各部位錳含量的變化Fig.6 Changes of Mn content in parts of R. chinensis plant under Mn2+ stress

2.3.2 生物富集系數(shù)和轉運系數(shù)鹽膚木幼苗錳生物富集系數(shù)隨Mn2+濃度升高呈逐漸大幅下降的趨勢，且各脅迫處理均顯著低于CK；Mn2+濃度為20 mmol·L-1處理下時，富集系數(shù)最低為4.02；同時，錳轉運系數(shù)隨Mn2+濃度升高呈逐漸增加的趨勢，除1 mmol·L-1濃度處理外均與CK差異顯著，但各Mn2+濃度處理的轉運系數(shù)總體上小于1(表2)。這說明鹽膚木在高濃度錳脅迫下對于Mn2+具有較強的富集與轉運能力，其錳積累部位主要為地下部分。

表2 錳脅迫下鹽膚木富集系數(shù)和轉運系數(shù)

3 討 論

3.1 錳脅迫條件下鹽膚木幼苗生長情況

植物葉片能夠表現(xiàn)出對錳毒性響應最直觀的變化。在本研究高濃度錳脅迫下，鹽膚木葉片出現(xiàn)褐色斑點、葉邊緣卷曲萎蔫的現(xiàn)象。Blamey等發(fā)現(xiàn)在施加30 mmol·L-1錳脅迫時，白羽扇豆(Lupinusalbus)、窄葉羽扇豆(Lupinusangustifolius)等4種植物葉柄和葉片上有明顯的黑棕色斑點，葉片數(shù)量減少，在葉片壞死區(qū)有大量的錳積累[19]。Führs等同樣發(fā)現(xiàn)植物大量積累錳會導致其葉片出現(xiàn)褐色斑點、幼葉變形等中毒癥狀[20]。植物錳中毒的典型表現(xiàn)是在植物老葉上出現(xiàn)褐色斑點，隨后是黃化、壞死和葉片脫落，褐色斑點是植物細胞壁中氧化錳和氧化酚的局部積累，尤其是表皮[21]。這種壞死的褐斑被作為植物受到錳毒害作用的標志[22]。

植物生長狀況能夠綜合反映出植物對錳脅迫環(huán)境的適應能力。本研究中，鹽膚木干重、根冠比在1、5 mmol·L-1Mn2+處理下比CK增加，而當Mn2+濃度為20 mmol·L-1時生物量比CK有所降低，說明在一定程度Mn2+有利于鹽膚木的生長。余軻等在對青葙(Celosiaargentea)[23]的錳耐性和富集特征研究中同樣也發(fā)現(xiàn)低濃度錳會促進青葙生長以及生物量增加的現(xiàn)象；酸模葉蓼(Polygonumlapathifolium)[24]總生物量和株高也隨著Mn2+濃度的增加而增加。這是由于錳作為植物生長的必需元素，參與多個代謝過程，適量的錳能促進植物的生長，提高生物量。但由于多種金屬轉運蛋白分子在植物細胞中具有轉運Mn2+的能力，Mn2+具有較強的結合能力，過量的錳使得植物吸收Ca2+、Mg2+、Fe2+等其他營養(yǎng)元素的能力受到影響[25-26]。這導致高濃度錳脅迫下植物生長受到抑制，表現(xiàn)出生物量減少、生長遲緩、植株矮小等現(xiàn)象[27]。

3.2 錳脅迫條件下鹽膚木幼苗的生理生化特征

錳在光合作用和葉綠素合成中起著重要作用[28]。本研究結果表明，在1、5 mmol·L-1Mn2+處理下鹽膚木葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量有增加的趨勢。在本研究最高Mn2+濃度(20 mmol·L-1)處理下，鹽膚木葉綠素含量有所下降，但與CK之間沒有顯著差異，各處理的葉綠素a/b則均沒有顯著變化。有研究表明，在錳脅迫條件下，柚(Citrusgrandis)[29]葉片中的葉綠素含量沒有受較大的影響；各錳濃度下水稻(Oryzasativa)[30]葉片葉綠素a/b沒有顯著的變化；耐性較強的菠菜(Spinaciaoleracea)品種在海水脅迫下光合含量變化幅度較小[31]。綜上所述，高濃度的錳脅迫會阻礙對錳敏感型植物的葉綠素合成，從而影響植物光合作用[32]，但對于具有一定錳耐受性植物的葉綠素含量則沒有明顯的抑制作用。本研究表明，鹽膚木幼苗在較高的錳脅迫下葉綠素含量下降幅度較小，說明其具有較高的錳耐受性，從而能夠保持其相對正常的光合能力。

滲透調節(jié)是植物應對逆境的一種重要機制。在植物遭受逆境脅迫時都會直接或者間接地造成水分缺失，此時為了對抗外界的不利環(huán)境，植物會迅速產(chǎn)生并積累大量的可溶性糖、可溶性蛋白、游離脯氨酸等滲透調節(jié)物質，來保持細胞內水分平衡，從而減輕滲透失水而造成的脅迫損害，以維持細胞正常生命代謝活動[4]。隨著Mn2+濃度的升高，本研究中鹽膚木葉片中可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸大量積累，當Mn2+濃度為20 mmol·L-1時，可溶性糖、可溶性蛋白和游離脯氨酸含量與10 mmol·L-1處理下相比雖顯著下降但仍顯著高于1、5 mmol·L-1處理。這與錳脅迫下黃花草(Cleomeviscosa)[33]、小飛蓬(Conyzacanadensis)、杠板歸(Polygonumperfoliatum)、美洲商陸[34]葉片滲透調節(jié)物質含量變化趨勢相同，也與構樹(Broussonetiapapyrifera)[35]滲透調節(jié)物質含量的變化趨勢一致。其原因是低濃度的錳脅迫能夠促進滲透調節(jié)物質的合成，從而通過提高其含量來增強鹽膚木在逆境下的耐受性；而過高濃度的錳脅迫會破壞葉片細胞結構，阻礙了滲透調節(jié)物質的合成，使?jié)B透調節(jié)失衡，對鹽膚木產(chǎn)生危害。

3.3 錳脅迫條件下鹽膚木幼苗的富集特征

除本身的生長、生理狀況外，植物對重金屬的富集特征是決定其是否適用于植物修復技術的另一主要因素。隨著Mn2+濃度的升高，本研究中鹽膚木地上部分、地下部分錳含量顯著增加。同樣，在錳脅迫條件下，垂序商陸[40]各器官中錳含量、冬青(Ilexparaguariensis)[41]葉片中錳含量也隨Mn2+濃度的增加而增加。這是因為植物對于錳的吸收與其他營養(yǎng)元素不同，錳轉運蛋白基因的表達通常不受外部錳濃度的影響而下調，這使得植物能在高錳濃度下積累大量的錳[42]。因此，鹽膚木對錳具有一定的富集能力。

在本研究中，鹽膚木錳生物富集系數(shù)隨Mn2+濃度升高呈下降的趨勢，且其值均大于1。這與錳脅迫下短毛蓼[8]、青葙[23]富集系數(shù)變化規(guī)律一致。同時，鹽膚木錳轉運系數(shù)則隨Mn2+濃度升高呈現(xiàn)出增加的趨勢。這說明Mn2+濃度的增加促進了鹽膚木體內錳的遷移，錳被轉運至地上部分。但是，整體上轉運系數(shù)小于1，又表明鹽膚木根部錳含量高于地上部分錳含量，錳主要積累于鹽膚木根部。同樣，重金屬耐性植物木賊[9]根部鉛含量明顯高于地上部分鉛含量，芒(Miscanthussinensis)和烏蕨(Stenolomachusanum)[43]根部對錳的吸收能力大于地上部分。這類植物在根部囤積重金屬，以此來減輕重金屬脅迫對地上部分的傷害?？梢?，鹽膚木屬于錳根部囤積型植物。

4 結 論

隨著環(huán)境中Mn2+濃度升高，鹽膚木幼苗生物量、葉綠素含量、滲透調節(jié)物質含量以及抗氧化物酶活性均呈先增加后下降的趨勢，MDA含量則顯著增加。同時，隨著環(huán)境中Mn2+濃度的升高，鹽膚木地上部分、地下部分錳含量增加。鹽膚木生物富集系數(shù)隨Mn2+濃度的升高而降低，且在各種Mn2+濃度脅迫處理下均大于1；其轉運系數(shù)隨Mn2+濃度升高卻呈增加的趨勢，且總體小于1，該植物屬于錳根部囤積型耐重金屬植物。鹽膚木具有一定的錳富集能力和耐受性，其主要通過合成大量滲透調節(jié)物質、增強抗氧化物酶活性以及在根部囤積錳的方式來減輕錳的毒害作用。