硅對稈銹菌侵染燕麥葉片病程相關(guān)蛋白活性及酚類物質(zhì)代謝的影響

李英浩，劉景輝*，呂 品，米俊珍，趙寶平，Allen Xue

(1 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2 加拿大農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品部渥太華研發(fā)中心，加拿大 渥太華 KIA0C6)

燕麥(AvenasativaL.)是世界上公認的營養(yǎng)保健谷物，其籽粒富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸和β-葡聚糖，同時富含燕麥特有抗氧化物質(zhì)及多種微量元素等[1]，可以降脂控糖、降低心血管疾病風(fēng)險[2-3]。燕麥具有抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄、適應(yīng)性強等特點，是中國北方、西北干旱冷涼等生態(tài)脆弱區(qū)主要的糧飼兼用及優(yōu)勢特色作物[4]。燕麥稈銹病(Pucciniagraminisf. sp.avenae)作為典型的真菌病害[5]，發(fā)病初期為圓形暗紅色小點，后病斑逐漸擴展出現(xiàn)稍隆起的小瘡胞，即夏孢子堆[6]。稈銹病害在燕麥種植的地區(qū)和國家都有發(fā)生，曾分別于20世紀初和20世紀40年代在北美地區(qū)和加拿大西部地區(qū)大爆發(fā)[7]。稈銹病也是中國燕麥主產(chǎn)區(qū)主要病害之一，周期性發(fā)生，大幅度降低籽粒產(chǎn)量和質(zhì)量，嚴重制約燕麥產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。調(diào)查結(jié)果顯示，2008-2009年在吉林白城、2012-2013年在河北張家口，燕麥稈銹病大面積爆發(fā)，產(chǎn)量降低10%～15%[8]。因此，如何提高燕麥稈銹病抗性成為中國燕麥生產(chǎn)亟待研究的課題，對中國燕麥主產(chǎn)區(qū)發(fā)展具有重要意義。

硅是地殼中第二大元素，可以提高某些作物對真菌病害的抵抗力[9]，雖然該元素不是植物生長的必要元素，但在提高植物抗病性上有重要作用。例如對水稻白葉枯病[10]、番茄根腐病[11]、黃瓜炭疽病[12]、小麥銹病[13]等病害均有一定的防治效果。誘導(dǎo)抗病性就是利用物理的、化學(xué)的以及生物的方法處理植株，改變植物對病害的反應(yīng)產(chǎn)生局部的或系統(tǒng)抗性的現(xiàn)象[14-16]，其抗病效果取決于誘導(dǎo)抗性的強弱和速度。研究表明病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins, PR)活性的顯著提高，酚類物質(zhì)的積累以及木質(zhì)化作用的加強都是誘導(dǎo)抗性的重要機制[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，水稻侵染稻瘟病菌后，施硅能顯著提高葉片病程相關(guān)蛋白酶中幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶的活性以及可溶性總酚及木質(zhì)素含量[18]。Chérif等[19]發(fā)現(xiàn)，施硅后黃瓜植株中被侵染的細胞通過積累酚類物質(zhì)對真菌侵染的反應(yīng)更迅速，積累的酚類物質(zhì)具有強烈的抗菌活性，抑制真菌侵入活性維管束系統(tǒng)。在黃瓜和水稻中也發(fā)現(xiàn)受硅調(diào)控的植保素的積累[20-21]。Rémus-Borel等[22]在研究硅增強小麥白粉病抗性的過程中，在施硅植株中提取到具有很強抗菌能力的化合物。

所有這些發(fā)現(xiàn)清晰地表明，硅在感病的植株體內(nèi)誘導(dǎo)引發(fā)了一種生化防衛(wèi)反應(yīng)，但迄今為止有關(guān)硅增強植物抗病性的作用機理尚不完全清楚，并且關(guān)于硅在感染稈銹病的燕麥體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗病的機制尚未見報道?；谏鲜鲅芯勘尘埃狙芯恳砸赘卸掍P病的燕麥品種‘壩莜1號’為材料，考察硅對燕麥葉片酚類物質(zhì)含量和病程相關(guān)蛋白活性的影響及其與燕麥稈銹病抗性的關(guān)系，以期揭示硅抗燕麥稈銹病的生理機制，為研發(fā)新型稈銹病害防治措施提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材 料

試驗選用易感稈銹病的燕麥品種‘壩莜1號’為材料(由張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院提供)，供試的燕麥稈銹菌從張家口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院燕麥生產(chǎn)試驗田采集，試驗所用的硅酸鹽(K2SiO3)及其他化學(xué)試劑均為分析純，所用營養(yǎng)液參照Hoagland經(jīng)典配方進行配置[23]。

1.2 燕麥幼苗培養(yǎng)

試驗采用盆栽方法，供試土壤為蛭石與泥炭土按質(zhì)量比為1∶1的比例混合而成。泥炭土中 N+P+K含量>10 g·kg-1，有機質(zhì)含量>50 g·kg-1，pH 7.0～8.0。塑料盆高12 cm，直徑15 cm，每盆裝混合土1 kg。選擇大小均勻一致的燕麥種子，使用3%氯酸鈉消毒10 min，蒸餾水沖洗3次并晾干后播種在花盆中，每盆20粒。燕麥出苗后將花盆置于日光溫室中進行培養(yǎng)。

1.3 接種方法

待燕麥幼苗第一葉充分展開即一葉一心時期，參照李天亞等[24]的方法進行稈銹病菌接種。具體方法為：將分離純化后的稈銹病菌株置于培養(yǎng)皿內(nèi)，首先用前端削成扁平的牙簽挑取稈銹菌株均勻涂抹于葉片背面，接種時各葉片涂抹菌要定量且保持一致。接種后的葉片用0.05%吐溫-20水溶液噴霧形成保濕膜，植株放置在16～18 ℃的黑暗環(huán)境中保濕16～20 h后，移入人工溫室內(nèi)進行培養(yǎng)，溫度控制在20～25 ℃，14 h(光)/10 h(暗)。

1.4 試驗設(shè)計

試驗共設(shè)4個處理，分別為CK(不施硅不接種)、+Si-P(施硅不接種)、-Si+P(不施硅接種)以及+Si+P(施硅接種)，每個處理重復(fù)3次。從燕麥出苗開始每隔3 d選用含1.5 mmol·L-1K2SiO3(前期的研究結(jié)果已證明該濃度防疫效果最佳)的1/2 Hoagland營養(yǎng)液進行澆灌，每盆200 mL，不加硅處理則加入同樣濃度的KNO3溶液，以補充由于施硅量不同帶來的鉀含量的差異。待幼苗長至一葉一心時期進行稈銹病菌接種，分別在接種前(0 d)和接種后(1、3、5、7、9和11 d)采集各個處理下的燕麥葉片樣品(第一片葉)，用液氮冷凍，在-80 ℃下保存，用于后期指標的測定。

1.5 測試指標及方法

1.5.1 稈銹侵染型分級標準及觀察參照Stewart等[25]的方法，燕麥葉片稈銹侵染型具體分為0(免疫)、0;(近免疫)、1(高抗)、2(中抗)、3(中感)、4(高感)和x(混合型)。接種6 d后開始每天觀察病斑(夏孢子堆)發(fā)展情況，待接種11 d后記載侵染型并拍照。

1.5.2 幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶活性取葉片0.5 g，加入液氮研磨至粉末，再加入7 mL濃度為50 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH5.0)勻漿。混合物在4 ℃、15 000×g離心15 min，上清液即為提取的粗酶液，用作幾丁質(zhì)內(nèi)切酶和外切酶活性的分析。幾丁質(zhì)酶活性測定參照Boller等[26]的方法，β-1,3-葡聚糖酶活性測定參照Joosten等[27]的方法。以每秒催化產(chǎn)生1 mol N-乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)所需的酶量定義為1 katal(kat), 酶活性表示為nkat/mg。

1.5.3 多酚氧化酶活性(PPO)活性稱取鮮樣葉片0.5 g左右，放入提前預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末，加入0.1 mol/L磷酸鈉緩沖液(pH 6.4，含1% PVP)4 mL，充分勻漿后，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中。將混合物在4 ℃條件下，15 000×g高速離心30 min上清液用于酶活性測定。參照Qin等[28]的方法進行酶活性測定。

1.5.4 苯丙氨酸解氨酶活性(PAL)活性稱取鮮樣葉片0.3 g左右，放入提前預(yù)冷的研缽中，加入液氮研磨至粉末，用50 mmol/L硼酸鈉緩沖液(pH 8.8，含5 mmol/L巰基乙醇和1% PVP) 4 mL (分2次加入)，充分勻漿后，轉(zhuǎn)入10 mL離心管中。混合物在4 ℃條件下，15 000×g 高速離心 30 min，上清液用于酶活性測定。參照Qin等[28]的方法進行酶活性測定。以O(shè)D290變化0.01為一個酶活力單位(U)。

1.5.5 總可溶性酚(TSP)和木質(zhì)素含量參照Rodrigues等[29]的方法。取0.1 g冷凍粉末葉片樣品至Ependorf管中，加入1.5 mL 80%的甲醇，用鋁箔紙將Ependorf管完全包裹，以防止光氧化，于轉(zhuǎn)速150 r/min、室溫25 ℃的搖床上振蕩過夜。將得到的提取物在離心力為12 000×g下高速離心5 min，之后將上清液轉(zhuǎn)移到新的塑料管中，在-20 ℃低溫冰箱中保存，用以測定總可溶性酚的含量。將沉淀也保存在-20 ℃的低溫冰箱中，用以測定木質(zhì)素的含量。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件進行處理和作圖，利用SPSS 22.0軟件進行方差分析，并運用Duncan’s檢驗法對顯著性差異進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 施硅對燕麥稈銹病抗病性的影響

在接種稈銹病菌的情況下，外源施硅可以明顯減少燕麥幼苗葉片的稈銹病菌孢子量，減少病斑大小(圖1)。同時，燕麥幼苗葉片的稈銹最高病級由4(高感)轉(zhuǎn)變?yōu)?(中抗)，且與不施硅相比(表1)，施硅處理下稈銹病發(fā)生嚴重度顯著降低了35.61%(P<0.05)。

2.2 施硅對接種后燕麥葉片病程相關(guān)蛋白酶活性的影響

2.2.1 幾丁質(zhì)酶活性在不接種稈銹病的情況下，施硅與否對燕麥葉片幾丁質(zhì)內(nèi)切酶和外切酶活性并未產(chǎn)生明顯影響(圖2)，并隨接種后天數(shù)的延長基本維持平穩(wěn)狀態(tài)。在接種稈銹病菌后，燕麥葉片的幾丁質(zhì)外切酶和幾丁質(zhì)內(nèi)切酶活性在施硅和不施硅處理下均表現(xiàn)出相同的先升后降的變化趨勢。其中，兩種酶活性在接種初期有一個快速上升階段，施硅和不施硅處理分別在接種第3天和第1天達到峰值后開始快速下降，在第11天低于不接種時的正常水平；與不施硅處理峰值相比，施硅后葉片幾丁質(zhì)內(nèi)切酶和外切酶活性的峰值分別提高26.15%和16.67%，且差異均達到顯著水平(P<0.05)。以上結(jié)果表明施硅能使受稈銹病菌侵染的燕麥葉片中幾丁質(zhì)酶活性維持更持久更高水平，這有助于提高燕麥對稈銹病的抗性。

表1 不同處理對燕麥稈銹病的防效

2.2.2 β-1,3-葡聚糖酶活性從圖3中可以看出，在不接種稈銹病菌時，外源施用硅對燕麥葉片β-1,3-葡聚糖酶活性并未產(chǎn)生影響，并基本維持平穩(wěn)狀態(tài)。在稈銹病菌侵染的初期，施硅和不施硅處理燕麥葉片β-1,3-葡聚糖酶活性均迅速同步升高，均在接種第3天達到最高值，之后均開始快速降低，而均在第9天再次出現(xiàn)小幅度提升。與不施硅處理相比，在稈銹病菌接種后第1～7天內(nèi)，施硅處理明顯提高葉片β-1,3-葡聚糖酶活性，并且峰值顯著提升了18.31%(P<0.05)。說明施硅能誘導(dǎo)受稈銹病菌侵染的燕麥葉片β-1,3-葡聚糖酶活性明顯提升，致使燕麥稈銹病抗性增強。

CK.不加硅不接種；+Si-P.加硅不接種；-Si+P.不加硅接種；+Si+P.加硅接種；下同圖2 不同處理下燕麥葉片幾丁質(zhì)內(nèi)切酶和外切酶活性隨接種時間的變化CK. No silicon no inoculation; +Si-P. Silicon application no inoculation; -Si+P. No silicon inoculation;+Si+P. Silicon and inoculation; The same as belowFig.2 The activities of chitin endonuclease and chitin exonuclease in oat leaves under different treatments after inoculation

圖3 不同處理下燕麥葉片β-1,3-葡聚糖酶活性隨接種時間的變化Fig.3 The β-1, 3-glucanase activity in oat leaves under different treatments after inoculation

2.3 施硅對接種后燕麥葉片酚類物質(zhì)代謝的影響

2.3.1 多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性在不接種稈銹病菌條件下，燕麥葉片多酚氧化酶(PPO)和苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性基本保持恒定，并且施硅與否對二者無明顯影響(圖4)。在接種稈銹病菌后，施硅和不施硅處理葉片PPO活性和PAL活性隨接種后時間延長均表現(xiàn)為先上升后下降的變化趨勢，并均于接種后第3天達到峰值。在整個稈銹病菌侵染過程中，硅處理燕麥葉片的 PPO和PAL活性均始終明顯高于同期不加硅處理，其PPO和PAL活性的峰值分別比不施硅處理峰值顯著提高了13.04%和9.33%(P<0.05)?？梢?，受到稈銹病菌侵染后，施硅能促使燕麥葉片中多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性明顯提高，有助于增強燕麥對稈銹病的抗性。

圖4 不同處理下燕麥葉片多酚氧化酶和苯丙氨酸解氨酶活性的變化Fig.4 The activities of polyphenol oxidase and phenylalanine ammonia lyase in oat leaves under different treatments

2.3.2 總可溶性酚和木質(zhì)素含量如圖5所示，在不接種稈銹病條件下，施硅處理對燕麥葉片的總可溶性酚(TSP)和木質(zhì)素含量影響均較小，含量水平基本保持穩(wěn)定。在接種稈銹病菌后，施硅處理和不施硅處理燕麥葉片中的TSP和木質(zhì)素含量均快速大幅上升，并均在接種后第3天達到峰值，之后開始緩慢下降；在接種后第1～11天內(nèi)，施硅處理的燕麥葉片TSP和木質(zhì)素含量均明顯高于同期不施硅處理，且施硅處理后二者的峰值分別顯著提高了5.10%和27.81%(P<0.05)。這說明燕麥幼苗接種稈銹病菌后，施硅處理能有效提高燕麥葉片中總可溶性酚和木質(zhì)素的含量，從而增強燕麥對稈銹病的抗性。

圖5 不同處理下燕麥葉片總可溶性酚和木質(zhì)素含量的變化Fig.5 The contents of total soluble phenol and lignin in oat leaves under different treatments

3 討 論

當植物受病原物侵染后均能產(chǎn)生誘導(dǎo)抗性，并且在感病初期就能立即啟動誘導(dǎo)抗性機制,但其對病原物侵染起到抑制作用并能夠殺死病原物[30]。在本研究中，燕麥葉片在接種稈銹病菌后能夠快速反應(yīng)，在侵染初期(0～3 d)葉片內(nèi)病程相關(guān)蛋白活性和酚類物質(zhì)含量均快速升高達到峰值，以起到抵抗稈銹菌侵染葉片細胞結(jié)構(gòu)的作用。

病程相關(guān)蛋白(pathogenesis-related proteins)是由植物寄主基因編碼，在病程相關(guān)情況下誘導(dǎo)生成的一類蛋白質(zhì)。植物病原細菌、真菌、病毒和類病毒都可以誘導(dǎo)病程相關(guān)蛋白生成。幾丁質(zhì)酶是廣泛存在于微生物和植物體內(nèi)的一類蛋白質(zhì)，是植物體中與防御有關(guān)的一種次生水解酶，幾丁質(zhì)是很多植物病原真菌細胞壁的主要成分，植物受病原真菌侵染后，幾丁質(zhì)酶在植物體內(nèi)快速積累，從而抑制真菌的生長[31]。β-1,3-葡聚糖酶是一類能夠水解以β-1,3-葡萄糖鍵連接的葡聚糖酶系，它廣泛存在于真菌、細菌、藻類、軟體動物和高等植物體內(nèi)。幾丁質(zhì)酶與β-1,3-葡聚糖酶在植物防衛(wèi)反應(yīng)中常協(xié)同表達，從而增強了植物的抗病性[17]。本研究結(jié)果表明，在不接種燕麥稈銹病原菌時，施硅對感病燕麥品種葉片的幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶活性影響不顯著，但在有病原菌侵染條件下，外源硅可以顯著地提高燕麥麥葉片幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶活性。這表明硅參與燕麥的生理代謝調(diào)節(jié)過程，誘導(dǎo)了幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶活性的激發(fā)，從而促進燕麥對稈銹病的抗病性。楊艷芳報道了類似的研究結(jié)果，即外源硅誘導(dǎo)了小麥葉片中幾丁質(zhì)酶和β-1,3葡聚糖酶活性的提升，從而增強小麥對白粉病的抗病性[32]。另外，本研究結(jié)果顯示，施硅后會推遲稈銹菌侵染下葉片幾丁質(zhì)酶活性峰值到達的時間，并且峰值顯著提高，使得葉片幾丁質(zhì)酶提高抗病性的作用更強，時間更持久。

同時，酚類物質(zhì)具有殺菌活性，能加強植物木質(zhì)化作用[33]。多酚氧化酶(PPO)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)及總可溶性酚(TSP)都是酚類物質(zhì)代謝過程中的關(guān)鍵酶，對酚類物質(zhì)的形成、氧化以及木質(zhì)素的合成具有重要作用[34]。植物體內(nèi)酚類物質(zhì)的來源有兩個主要的途徑，一是植物原始酚類物質(zhì)的積累，二是在受病原菌侵染后，宿主細胞作出反應(yīng)，酚類物質(zhì)迅速積累。特別是抗病品種在受侵染時，會積累從莽草酸或乙酸途徑合成的大量酚類物質(zhì)。梁永超等研究硅和黃瓜炭疽病的關(guān)系后發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)接種能使加硅處理葉片的酚類物質(zhì)含量明顯提高，植株能被成功誘導(dǎo)出系統(tǒng)抗病性蛋白，說明病原物侵染植物后，寄主體內(nèi)酚類物質(zhì)變化與寄主抗病性有重要關(guān)系[12]。本試驗結(jié)果表明，施硅能使受稈銹病菌侵染的燕麥葉片中多酚氧化酶活性和酚類物質(zhì)含量提高，有助于增強燕麥對稈銹病的抗性。但相關(guān)研究結(jié)果表明，小麥葉片中酚類物質(zhì)含量均在接種黑胚病菌后第2天達到峰值，然后開始下降[35]，而本研究中在接種稈銹病菌后，施硅處理和不施硅處理的燕麥葉片中的酚類物質(zhì)含量均快速上升，并在接種后第3天才達到峰值，接著開始下降，與前人研究結(jié)果不盡相同。這可能是因為植株受到不同病原菌侵染時，處理間植株生長差異較大，結(jié)構(gòu)抗性或物理屏障作用較明顯，導(dǎo)致處理間的植株對病原菌的敏感性不一致而造成的。但也有研究指出，施硅對感病植株葉片的酚類物質(zhì)代謝不會造成影響，這可能因為硅在不同病原物-寄主中作用機理存在差異[12]，如黃瓜白粉病和小麥白粉病都是病原物的活體寄生，而黃瓜炭疽病菌乃腐生型，但具體作用機制尚待進一步研究。

結(jié)合本試驗結(jié)果和已發(fā)表的研究結(jié)果表明，外源硅可通過調(diào)節(jié)植株體內(nèi)的生化代謝反應(yīng)，影響植物抗病相關(guān)酶活性，并在侵染位點沉積硅元素從而構(gòu)建了防病原菌侵入的“物理或機械屏障”，以達到增強植株的系統(tǒng)抗病性，從而抑制植物病害發(fā)展。本試驗研究了燕麥感染稈銹病初期，葉片內(nèi)酚類物質(zhì)代謝能力和病程相關(guān)蛋白酶活性的變化，并探討它們和稈銹病抗性之間的關(guān)系，隨著病情的進一步擴展和發(fā)病級別的升高，各指標變化規(guī)律需要進一步研究。