硫黃素T與側(cè)翼連接雙鏈DNA的G-四鏈體高特異性作用

周蔚，李運(yùn)超，范樓珍，李曉宏

北京師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，北京 100875

1 引言

G-四鏈體(G4)是由離子誘導(dǎo)富G堿基的DNA序列形成的DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，包括平行的G4，反平行的G4以及混合結(jié)構(gòu)的G41，因而呈現(xiàn)了多型性。人體中有大量的富G序列，主要分布于端粒和原癌基因啟動(dòng)子區(qū)域，這些序列與細(xì)胞調(diào)控過程緊密相關(guān)2。另外，目前已有許多人工合成的富G序列用于設(shè)計(jì)發(fā)展納米材料和分子器件3-14。G4的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)直接影響到其在體內(nèi)的生物功能和體外的生化應(yīng)用15,16。其中，G4結(jié)構(gòu)與熒光小分子的結(jié)合強(qiáng)度，直接決定了體內(nèi)生物功能的性能和體外檢測的可靠性和可行性17-21。因此，熒光小分子與G4的高效相互作用廣受關(guān)注，也是研究熱點(diǎn)22,23。

在研究熒光小分子與G4結(jié)構(gòu)相互作用時(shí)，存在兩方面的問題。熒光小分子(如：結(jié)晶紫，原卟啉，鋅卟啉和硫黃素T等)僅僅與特定的G4結(jié)構(gòu)結(jié)合。例如：結(jié)晶紫與反平行的G4有效結(jié)合24，原卟啉和鋅卟啉與平行的G4有效結(jié)合25，硫黃素T與混合結(jié)構(gòu)G4有效結(jié)合26。此外，為了實(shí)現(xiàn)與特定G4結(jié)構(gòu)的高效結(jié)合，需要設(shè)計(jì)合成特異性的熒光小分子27。同時(shí)，結(jié)合體系中共存的離子以及離子的濃度，極大地影響熒光小分子與G4結(jié)構(gòu)有效相互作用，這也是基于G4的光電傳感器在實(shí)際體系中難于推廣的主要原因28。例如：Na+會(huì)極大地影響K+穩(wěn)定G4結(jié)構(gòu)與熒光小分子的有效結(jié)合26。因此，如何實(shí)現(xiàn)熒光小分子對G4結(jié)構(gòu)的普適性有效結(jié)合，并且不受體系中共存Na+的干擾，依然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

在本文中，以凝血酶適體鏈TBA(thrombin binding aptamer)為例，通過在TBA的3’端和5’端設(shè)計(jì)兩條可互補(bǔ)的，含有10個(gè)堿基的單鏈DNA(TBA-10 bp)，由K+誘導(dǎo)TBA-10 bp形成K+穩(wěn)定TBA結(jié)構(gòu)(K+-TBA，G4)并銜接含有10對互補(bǔ)堿基的雙鏈DNA(K+-TBA-10 bp)。相較于K+-TBA，熒光小分子硫磺素T與K+-TBA-10 bp結(jié)合后，產(chǎn)生了100倍的熒光增強(qiáng)，親和強(qiáng)度增加了1000倍，重要的是不受結(jié)合體系中Na+(5-140 mmol·L-1)的影響。結(jié)合紫外-可見光譜，熒光光譜和圓二色光譜解析熒光增強(qiáng)機(jī)制，發(fā)現(xiàn)硫磺素T有效地嵌入K+-TBA與雙鏈DNA銜接的空腔里。隨后，將這一特殊的結(jié)合模式推廣到其他的G4結(jié)構(gòu)。這一工作，為實(shí)現(xiàn)熒光小分子與G4結(jié)構(gòu)的有效相互作用，提供了新視角。

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

三羥甲基氨基甲烷(Tris)(純度≥ 99.5%)，硫黃素T(純度≥ 95.0%)，醋酸鈉(純度≥ 99.0%)，醋酸鉀(純度≥ 99.0%)。實(shí)驗(yàn)中使用的DNA由上海生工生物有限公司合成，具體序列如表1所示。

表1 本文中用到的DNA序列Table 1 Oligonucleotides used in this work.

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 熒光光譜分析

室溫下，使用FS5熒光光譜儀(Edinburgh instruments，UK)測試DNA溶液的熒光光譜圖。比色皿光路長度為1 mm，體積為800 μL。對于硫黃素T激發(fā)波長是425 nm，記錄440至580 nm的熒光光譜，讀取495 nm的發(fā)射峰值。熒光測試中，所有溶液溶于pH=7.4的緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAc和10 mmol·L-1KAc)中，DNA與硫黃素T混合后，最終DNA濃度均為1 μmol·L-1，硫黃素T濃度為1 μmol·L-1。

2.2.2 熒光光譜滴定分析

為了測定硫黃素T和不同DNA的親和性，用DNA對硫黃素T進(jìn)行熒光滴定，計(jì)算兩者的解離常數(shù)。200 nmol·L-1硫黃素T和不同濃度的DNA(0.05，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1，2，3，4，5，6，8，10 μmol·L-1)相混合；室溫下3 min后，測定硫黃素T在495 nm處的熒光譜值。

熒光滴定數(shù)據(jù)的分析，通過公式29：

其中，Q=Fmax/F0，A=KD/CThT，X=n × CDNA/CThT，F(xiàn)0為無DNA條件下硫黃素T的背景熒光強(qiáng)度，F(xiàn)max為硫黃素T飽和熒光強(qiáng)度，n為硫黃素T的結(jié)合比例，KD為解離常數(shù)。

2.2.3 紫外光譜分析

室溫下，使用UV-2450紫外-可見分光光度計(jì)(日本島津)記錄在500至350 nm波長范圍內(nèi)硫黃素T的吸收光譜。紫外測試中，所有溶液溶于pH=7.4的緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAC和10 mmol·L-1KAC)中，DNA與硫黃素T混合后，最終DNA濃度均為10 μmol·L-1，硫黃素T濃度為5 μmol·L-1。

2.2.4 圓二色譜圖(CD)測量

室溫下，用Chirascan型圓二色譜儀(Applied Photophysics Ltd.)測量2 μmol·L-1DNA溶液的圓二色譜圖。比色皿光路長度為1 mm，體積為800 μL。測試過程中通入高純氮，掃描范圍為220至360 nm，每個(gè)測試波長的停留時(shí)間為0.5 s，每個(gè)樣品重復(fù)測試兩次，最終譜圖需扣除測試緩沖液的背景。

2.2.5 熔解曲線測量

使用Chirascan型圓二色譜儀對4 μmol·L-1TBA-10 bp進(jìn)行圓二色譜熔解曲線測試。設(shè)定測試溫度范圍為20-90 °C，變溫速率為0.5 °C·min-1，每0.5 °C測試一個(gè)點(diǎn)，獲得在20-90 °C范圍內(nèi)，TBA-10 bp特征峰值(290 nm處的值)隨溫度變化曲線，即圓二色譜熔解曲線。

3 結(jié)果與討論

3.1 硫磺素T與K+-TBA-10 bp的作用

在pH=7.4的緩沖溶液(10 mmol·L-1Tris-Ac，20 mmol·L-1NaAC 和 10 mmol·L-1KAC)中 ， 1 μmol·L-1的硫磺素T在495 nm處呈現(xiàn)出極弱的熒光，如圖1所示。當(dāng)加入1 μmol·L-1的凝血酶適體鏈(thrombin binding aptamer，TBA)時(shí)，K+誘導(dǎo)TBA形成K+穩(wěn)定TBA(K+-TBA，G4)30。硫磺素T通過與K+-TBA作用，在495 nm處的熒光發(fā)射峰略有增強(qiáng)，表明硫磺素T能與K+-TBA弱結(jié)合30,31。同樣地，當(dāng)加入1 μmol·L-1DNA(1)與DNA(2)雜化后形成的雙鏈DNA(1+2)，硫磺素T在495 nm處的發(fā)射熒光幾乎不變，這表明硫磺素T與雙鏈DNA(1+2)的相互作用依然很弱。當(dāng)加入1 μmol·L-1的TBA-10 bp(TBA的3’端和5’端分別連接DNA(1)和DNA(2))，硫磺素T的發(fā)射熒光顯著增加，相較于K+-TBA，增加了100倍。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，硫磺素的發(fā)射熒光增強(qiáng)源于硫磺素T分子的平面性增加16。由此我們推測，硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合很大程度上增加了硫磺素T分子的平面化。

圖1 硫黃素T以及分別在TBA，DNA(1+2)或TBA-10 bp存在時(shí)的熒光光譜Fig.1 Fluorescent spectra of ThT in absence and presence of TBA,DNA(1+2)or TBA-10 bp.

3.2 硫磺素T與K+-TBA-10 bp的作用位點(diǎn)

為了說明硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合模式，首先考察了硫磺素T與DNA作用后的平面性，如圖2a所示。硫磺素T在412 nm處有一個(gè)特征吸收峰32。與10 μmol·L-1TBA在緩沖體系中混合后形成K+-TBA，吸收峰出現(xiàn)了7 nm(419-412 nm)的紅移；與10 μmol·L-1ds-DNA(1+2)混合后，吸收峰紅移了3 nm(415-412 nm)；而加入10 μmol·L-1TBA-10 bp時(shí)，TBA-10 bp轉(zhuǎn)化為K+-TBA-10 bp，硫黃素T的吸收峰紅移了40至452 nm處。結(jié)果表明硫黃素T可以特異性地與K+-TBA-10 bp結(jié)合33。接著，考察了硫磺素T與K+-TBA-10 bp的親和常數(shù)。通過熒光滴定法，擬合滴定曲線測得的解離常數(shù)KD為1.61 ×10-8mol·L-1，結(jié)合比例為1:1(圖2b)。

同樣地，硫磺素T與K+-TBA作用后的解離常數(shù)KD為1.63×10-5mol·L-1(圖2c)，硫磺素T與雙鏈DNA(1+2)作用后的解離常數(shù)KD為1.95×10-5mol·L-1(圖2d)。相較于K+-TBA，硫磺素T與TBA-10 bp的親和能力增加了近1000倍。這些結(jié)果說明，硫磺素T與K+-TBA-10 bp的強(qiáng)相互作用導(dǎo)致了硫磺素T分子的平面性增加，因而產(chǎn)生了100倍增強(qiáng)的發(fā)射熒光

圖2 (a)硫磺素T以及在TBA，ds-DNA(1+2)，TBA-10 bp存在時(shí)的紫外-可見光譜;(b)0-5 μmol·L-1 TBA-10 bp,(c)0-10 μmol·L-1 TBA and(d)0-10 μmol·L-1 ds-DNA(1+2)對硫磺素 T(200 nmol·L-1)的熒光滴定曲線。F0表示硫黃素T的熒光強(qiáng)度；F表示存在DNA時(shí)硫黃素T的熒光強(qiáng)度Fig.2 (a)UV-Vis spectra of ThT in absence and presence of TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp.Fluorometric titration curves of ThT(200 nmol·L-1)with 0-5 μmol·L-1 TBA-10 bp(b);0-10 μmol·L-1 TBA(c)and ds-DNA(1+2)(d).F0 and F denote the fluorescence intensity of ThT in the absence and presence of TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp.

為了進(jìn)一步說明硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合位點(diǎn)，采用圓二色光譜表征了K+-TBA-10 bp的構(gòu)型，如圖3a所示。緩沖體系中的TBA(K+-TBA)在291和248 nm處呈現(xiàn)兩個(gè)正峰，265 nm處呈現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰，這表明K+-TBA形成了反平行的G4結(jié)構(gòu)34。ds-DNA(1+2)在280 nm處呈現(xiàn)一個(gè)正峰，在248 nm處呈現(xiàn)了一個(gè)負(fù)峰，表明ds-DNA(1+2)屬于B型雙鏈DNA35。而緩沖體系中的TBA-10 bp(K+-TBA-10 bp)在28到290 nm處出現(xiàn)了一個(gè)很寬的正峰，246 nm處有一個(gè)負(fù)峰。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道36，將K+-TBA-10 bp的譜圖減去ds-DNA(1+2)的譜圖，得到圖3a內(nèi)圖所示曲線：291和248 nm處有兩個(gè)正峰以及265 nm處有一個(gè)負(fù)峰，同反平行K+-TBA結(jié)構(gòu)譜圖類似。這表明K+-TBA-10 bp是K+-TBA連接雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)。硫磺素T與K+-TBA和K+-TBA-10 bp結(jié)合的熱穩(wěn)定性表明，K+-TBA的解鏈溫度約為31.1 °C，K+-TBA-10 bp的解鏈溫度升高到41.5 °C(圖3b)。結(jié)合紫外可見光譜與解離常數(shù)測試結(jié)果，表明：(1)硫磺素T與K+-TBA和ds-DNA(1+2)結(jié)合較弱，(2)硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合呈現(xiàn)出極大的增強(qiáng)，(3)K+-TBA-10 bp是K+-TBA連接雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)?；诖?，我們推測硫磺素T可能嵌合在K+-TBA與雙鏈DNA接壤處的空腔，體現(xiàn)出一種特異性的結(jié)合模式。

圖3 (a)緩沖體系中TBA，ds-DNA(1+2)和TBA-10 bp圓二色譜圖。內(nèi)圖：TBA-10 bp的圓二色譜圖減去ds-DNA(1+2)的圓二色譜圖。(b)10 mml·L-1 K+中TBA-10 bp 熔解曲線(黑線)，10 mml·L-1 K+和30 μmol·L-1 硫黃素T中TBA-10 bp 熔解曲線(紅線)Fig.3 (a)CD spectra for TBA,ds-DNA(1+2)or TBA-10 bp in buffer solution.Inset:CD spectra of TBA-10 bp subtracting that of ds-DNA(1+2).(b)Melting curves of TBA-10 bp in the presence of 10 mmol·L-1 K+(black line)，10 mmol·L-1 K+ and 30 μmol·L-1 ThT(red line).

為了證實(shí)硫磺素T嵌合在K+-TBA與雙鏈DNA銜接處的空腔，變化了K+-TBA和雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)。當(dāng)TBA-10 bp在不含有K+的緩沖體系中，圓二色譜圖在280 nm處出現(xiàn)一個(gè)正峰，246 nm處出現(xiàn)一個(gè)負(fù)峰(圖4a，黑線)。與含有K+的圓二色譜圖有些許偏差，但不甚明顯(圖4a，紅線)。此時(shí)，減去雙鏈DNA的圓二色譜圖，得到圖4a內(nèi)圖所示的譜圖，相較于含有K+的情況，G4結(jié)構(gòu)的特征峰消失，說明在無K+條件下，K+-TBA沒有形成。加入硫磺素T之后，在495 nm處的發(fā)射熒光降低，如圖4b所示。這表明K+-TBA部分對于硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合至關(guān)重要。同樣地，當(dāng)變化TBA-10 bp 3’端和5’端的互補(bǔ)堿基數(shù)由2至18時(shí)，隨著堿基數(shù)的增多，硫磺素T的熒光強(qiáng)度逐漸增加，當(dāng)互補(bǔ)堿基增加到10對后，熒光強(qiáng)度不再變化(圖4b)，這表明硫磺素T與K+-TBA-10 bp的結(jié)合同樣依賴于穩(wěn)定的雙鏈部分。此外，將緊鄰K+-TBA的A-T堿基對改變成G-C(K+-TBA-10 bp-GC)，C-G(K+-TBA-10 bp-CG)和T-A(K+-TBA-10 bp-TA)互補(bǔ)堿基對，或者A-A(K+-TBA-10 bp-AA)，T-T(K+-TBA-10 bp-TT)和C-C(K+-TBA-10 bp-CC)錯(cuò)配堿基對，繼續(xù)與硫磺素T結(jié)合，熒光強(qiáng)度均呈現(xiàn)出不同程度的下降(圖5a)?；诖?，我們認(rèn)為硫磺素T是高效地嵌合于K+-TBA與雙鏈DNA(1+2)銜接處的空腔內(nèi)，如圖5b所示。

圖4 (a)含K+和不含K+的緩沖體系中TBA-10 bp圓二色譜圖。內(nèi)圖：對應(yīng)的TBA-10 bp圓二色譜圖減去ds-DNA(1+2)圓二色譜圖。(b)硫黃素T與不含K+的TBA-10 bp，以及含 10 mmol·L-1 K+的 TBA-10 bp，TBA，TBA-2 bp，TBA-4 bp，TBA-8 bp和TBA-18 bp結(jié)合后在495 nm處的發(fā)射熒光強(qiáng)度Fig.4 (a)CD spectra for TBA-10 bp in the absence and presence 10 mmol·L-1 K+ in buffer solution.Inset:CD spectra of TBA-10 bp in the absence(black line)and presence 10 mmol·L-1 K+(red line)subtracting that of ds-DNA(1+2).(b)Intensity of fluorescent emission of ThT at 495 nm upon binding with TBA-10 bp in the absence of 10 mmol·L-1 K+,and TBA-10 bp,TBA,TBA-2 bp,TBA-4 bp,TBA-8 bp and TBA-18 bp in presence of 10 mmol·L-1 K+.

圖5 硫黃素T分別與K+-TBA-10 bp，K+-TBA-10 bp-GC，TBA-10 bp-CG，TBA-10 bp-TA，TBA-10 bp-AA，TBA-10 bp-TT或TBA-10 bp-CC結(jié)合后的熒光譜圖Fig.5 Fluorescent spectra of ThT in presence of K+-TBA-10 bp,K+-TBA-10 bp-GC,TBA-10 bp-CG,TBA-10 bp-TA,K+-TBA-10 bp-AA,TBA-10 bp-TT or TBA-10 bp-CC.

3.3 硫磺素T與K+-TBA-10 bp作用的抗Na+干擾性

高濃度的Na+會(huì)極大地影響G4結(jié)構(gòu)與熒光小分子配體的有效結(jié)合26。那么K+-TBA銜接雙鏈DNA(1+2)與硫磺素T的結(jié)合是否受Na+的影響？采用熒光滴定技術(shù)考察了解離常數(shù)對Na+濃度的依賴度，如圖6示。在含有5 mmol·L-1Na+的緩沖體系中，測得的解離常數(shù)為1.588 × 10-8mol·L-1(圖6a)。類似地，在含有20 mml·L-1Na+的緩沖體系中，測得的解離常數(shù)為1.614 × 10-8mol·L-1(圖6b)；在含有50 mmol·L-1Na+的體系中，測得的解離常數(shù)為2.011 × 10-8mol·L-1(圖6c)；在140 mmol·L-1Na+的緩沖體系中，測得的解離常數(shù)為2.142 × 10-8mol·L-1(圖6d)。這一結(jié)果表明，K+-TBA銜接雙鏈DNA(1+2)與硫磺素T的結(jié)合不受Na+的影響，體現(xiàn)出優(yōu)質(zhì)的抗Na+干擾能力。

圖6 不同 Na+濃度下，0-5 μmol·L-1 K+-TBA-10 bp 對硫磺素 T(200 nmol·L-1)的熒光滴定曲線:(a)5 mmol·L-1 NaAc，(b)20 mmol·L-1 NaAc，(c)50 mmol·L-1 NaAc，(d)140 mmol·L-1 NaAc。F0 表示沒有K+-TBA-10 bp時(shí)硫黃素T的熒光強(qiáng)度；F表示存在K+-TBA-10 bp時(shí)ThT的熒光強(qiáng)度.Fig.6 Fluorometric titration curves of ThT(200 nmol·L-1)with 0-5 μmol·L-1 K+-TBA-10 bp in the presence of various Na+ concentrations:(a)5 mmol·L-1,(b)20 mmol·L-1,(c)50 mmol·L-1 and(d)140 mmol·L-1 NaAc.F0 and F denote the fluorescence intensity of ThT in the absence and presence of K+-TBA-10 bp.

3.4 硫磺素T與K+-TBA-10 bp作用模式的普適性

硫磺素T作為一個(gè)與混合結(jié)構(gòu)G4特異性相互作用的熒光小分子，幾乎不能有效地與平行G4和反平行G4結(jié)合21。這本文中，K+-TBA是一種最簡單的反平行G4結(jié)構(gòu)，而硫磺素T可以與K+-TBA-10 bp有效相互作用。隨后，將這一特異性結(jié)合模式推廣到其他富G適體鏈。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，K+存在下，富G適體鏈PW1737、T3TT38、T3TT338和c-kit39形成平行的G4結(jié)構(gòu)，Oxy2840、Hum2438和PS2.M41形成反平行的G4結(jié)構(gòu)。用這些具有代表性的富G適體鏈代替TBA-10 bp中的TBA部分，在K+誘導(dǎo)下形成K+穩(wěn)定的G4結(jié)構(gòu)并銜接雙鏈DNA(1+2)(K+-G4-10 bp)。加入硫磺素T，通過硫磺素T發(fā)射熒光的增加程度衡量相互作用效果，結(jié)果如圖7所示：同K+-G4本身(黑色柱)相比，K+-G4-10 bp(紅色柱)與硫磺素T結(jié)合后，硫磺素T的發(fā)射熒光強(qiáng)度明顯地增加。結(jié)果表明，對于富G適體鏈，在3端和5端增加堿基數(shù)，形成G4結(jié)構(gòu)后并銜接穩(wěn)定雙鏈DNA的結(jié)構(gòu)，可以有效地增加與硫磺素T的相互作用強(qiáng)度，且與G4的構(gòu)型無關(guān)。

圖7 硫磺素T與K+-G4(黑色柱)和K+-G4-10 bp(紅色柱)結(jié)合后在495 nm處的熒光強(qiáng)度Fig.7 The fluorescence intensities of ThT at 495 nm upon binding with G-rich DNA sequences(black)and G-rich DNA sequences flanking with ds-DNA(red).

4 結(jié)論

綜上所述，在凝血酶適體鏈TBA的5’端和3’端分別增加10個(gè)堿基(TBA-10 bp)，K+誘導(dǎo)TBA形成K+穩(wěn)定的TBA(K+-TBA)并銜接10對互補(bǔ)堿基的雙鏈DNA(K+-TBA-10 bp)。相較于K+-TBA，K+-TBA-10 bp與熒光小分子硫磺素T結(jié)合后，硫磺素T的熒光強(qiáng)度增加了100倍，親和強(qiáng)度增加了1000倍，最重要的這一結(jié)合模式不受Na+(5-140 mmol·L-1)的影響。這些結(jié)合性能的改善得益于硫磺素T有效地嵌合在K+-TBA和雙鏈DNA銜接的空腔內(nèi)。這一特殊的結(jié)合模式普遍適用于其他的G4結(jié)構(gòu)。所以，硫磺素T可以成為一種廣譜熒光探針識(shí)別G4結(jié)構(gòu)，不依賴于G4結(jié)構(gòu)的多型性，也不依賴于體系中的Na+濃度，在生物化學(xué)和生化分析領(lǐng)域，體現(xiàn)出潛在的應(yīng)用價(jià)值。