響應(yīng)面法優(yōu)化冰糖草總黃酮提取工藝及抗氧化活性分析*

陳麗珍，侯 杰，趙 珂，魏 娜，高麗玉，勞佳麗

海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，海南 海口 571199

冰糖草為玄參科野甘草屬植物野甘草Scoparia dulcis L．的全草，又名野甘草、假枸杞、香儀、米碎草等。它是多年生草本植物，生長于熱帶和亞熱帶地區(qū)，我國主要分布在廣西、廣東、海南、福建、臺灣等地。冰糖草性涼味甘，可全株入藥，具有清熱解毒，健胃疏風(fēng)，鎮(zhèn)咳止癢，利尿消腫的功效，常用于治療肺熱咳嗽、腳氣浮腫、腸炎、高血壓和濕疹熱痱等病證［1-3］。在國外還用于治療牙痛、淋病、糖尿病、胃病和肝機能障礙等［4-5］。已有文獻［4，6］報道了冰糖草的化學(xué)成分、藥理活性［4，7-8］、生藥學(xué)［9］等方面的研究，發(fā)現(xiàn)其主要含有二萜類、黃酮類、生物堿等化學(xué)成分，具有降血糖血壓、抗胃潰瘍、抗菌、抗病毒、抗癌和治療肝機能障礙等多種藥理活性［3］，是一種很具開發(fā)應(yīng)用前景的中草藥?？寡趸瘎┛捎行宄梭w新陳代謝過程中產(chǎn)生的過量自由基，還可預(yù)防心臟疾病、癌癥、老年癡呆癥等多種疾病。自然界中，很多來源于植物的黃酮、酚類、多糖、皂苷類等都具有很好的抗氧化活性［10］。因此，從天然植物中提取開發(fā)新型安全有效的抗氧化劑已被廣泛關(guān)注。然而，關(guān)于響應(yīng)面法優(yōu)化冰糖草總黃酮的提取工藝及其抗氧化活性方面的研究未見報道。為了更好地開發(fā)和利用豐富的冰糖草資源，本研究在單因素試驗基礎(chǔ)上，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化冰糖草總黃酮的提取工藝，采用1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基清除能力和測定鐵氰化鉀還原能力的方法評價其抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 試藥及儀器 冰糖草，采自海南省萬寧市龍滾鎮(zhèn)周邊地區(qū)，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院曾念開教授鑒定為玄參科植物野甘草Scoparia dulcis L.的全草，烘干，分離粉粹并過80 目篩，密封低溫干燥避光保存?zhèn)溆?；蘆丁對照品（上海源葉，批號：B20771）；維生素C（Vc）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（上海阿拉丁，批號：Y01M7S10307）；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。SK3210HP 超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)公司）；SHZ-D（Ⅲ）型循環(huán)水式真空泵（鞏義予華公司）；RE-2000B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；DZF-6053 型真空干燥箱（上海一恒公司）；AE100 型電子分析天平（上海梅特勒-托利多公司）；UV-1600型紫外可見分光光度計（北京瑞利公司）；800C型臺式離心機（上海安亭公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線［11-12］采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH顯色法。取7 個25 mL 容量瓶，分別精密量入0.246 mg/mL 的蘆丁對照品溶液0、1、2、4、6、8 mL，分別加入5%NaNO2溶液1 mL，搖勻靜置6 min；各加入10%Al（NO3）3溶液1 mL，搖勻靜置6 min；再加入4%NaOH 溶液4 mL，用蒸餾水定容，搖勻，放置15 min后在510 nm 處測定吸光值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C（ug/mL）為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線及回歸方程：A=10.677C-0.002 8，r=0.999 7，表明在9.8～78.7 ug/mL 測定濃度的線性關(guān)系良好。

1.2.2 冰糖草總黃酮的提取和含量測定 精密稱取冰糖草粉末4.0 g于磨口三角瓶中，在設(shè)定的試驗條件下按一定的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液料比、超聲溫度、超聲時間和超聲功率進行超聲提取，固定提取次數(shù)為2次，抽濾，合并2次濾液，定容于容量瓶中，搖勻即得待測樣品溶液。準(zhǔn)確吸取一定量樣品溶液置于25 mL 容量瓶中，按“1.3.1”項中的方法處理后測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算總黃酮含量（W），結(jié)果以每克冰糖草干藥草中含有相當(dāng)蘆丁的毫克數(shù)來表示（mg/g），計算公式為W=c×V×N/m，式中：c 為樣品的吸光度代入回歸方程計算得到的總黃酮濃度，mg/mL；N 為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.2.3 單因素試驗 在下列設(shè)定好的提取條件下進行冰糖草總黃酮的提取，考察各因素對總黃酮提取量的影響。設(shè)定液料比25∶1 mL/g，提取溫度為50℃，不同體積分?jǐn)?shù)（40%、50%、60%、70%、80%、90%）的乙醇溶液為溶劑，超聲功率為250 W，超聲處理40 min；溶劑為70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超聲功率為250 W，置于不同溫度（35、40、45、50、55、60℃）的水浴中超聲處理40 min；提取溫度50℃，溶劑為70%乙醇溶液，液料比25∶1 mL/g，超聲功率為250 W，分別超聲處理（20、40、60、80、100、120 min）；提取溫度50℃，溶劑為70%乙醇溶液，液料比（10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1、35∶1 mL/g），超聲功率為250 W，超聲處理40 min。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken 中心組合試驗原理，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲溫度（C）為考察因素，以冰糖草總黃酮提取量為響應(yīng)值，采用Design-Expert10.0 軟件進行三因素三水平響應(yīng)面法的設(shè)計與分析，由此優(yōu)化得冰糖草總黃酮的最佳提取工藝條件。試驗因素與水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素水平

1.2.5 抗氧化活性測定 將最佳工藝提取得到的總黃酮提取液，經(jīng)減壓濃縮后，真空干燥得到粗總黃酮粉。經(jīng)減壓濃縮至約原體積的1/4，加入4倍體積95%乙醇溶液，在4℃條件下過夜靜置，抽濾，自然干燥，即得粗總黃酮粉。

1.2.5.1 清除DPPH 自由基能力的測定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗總黃酮樣品溶液，并作梯度稀釋。參照楊文平等［13］的方法并適當(dāng)改進。DPPH 乙醇溶液濃度為50 ug/mL。分別在2 mL DPPH 溶液中加入1.0 mL 梯度質(zhì)量濃度的樣品溶液，混勻，暗處室溫放置30 min 后，于517 nm 處測定吸光度，即為A1；在3 mL DPPH 溶液中加入1 mL的樣品溶劑作空白對照，同樣條件下測定吸光度，即為A0；同時以Vc作為陽性對照。

1.2.5.2 還原能力的測定 用70%乙醇溶解配成1 mg/mL粗總黃酮樣品溶液，并作梯度稀釋。參照BERKER［14］方法略作修改，分別吸取梯度質(zhì)量濃度1 mL置于10 mL離心管，再加入0.2 mol/L pH 6.6磷酸鹽緩沖液2 mL 和1%鐵氰化鉀1 mL?；靹蛑糜?0℃水浴保溫20 min，迅速冷卻后加入10%三氯乙酸2 mL，混勻，4000 r/min 離心10 min。取上清液4 mL，加入蒸餾水1 mL 和0.1%的三氯化鐵水溶液0.5 mL，混勻靜置10 min，以蒸餾水作空白參比，在700 nm處測定吸光度值，并與相同濃度Vc的還原力進行比較。吸光值越大表示還原能力越強。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法采用Excel 2010、GraphPad Prism 8.0.2 和Design-Expert10.0 軟 件 進 行 數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加而上升，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達到70%時，提取量最大，之后開始呈下降趨勢。這是可能因為隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，溶劑對物料的滲透性和對細(xì)胞膜的破壞性隨之增大［15］，提高了黃酮類成分的溶出率；而繼續(xù)增加體積分?jǐn)?shù)使得其他醇溶性成分溶出量增多［16］，反而降低了提取量。故乙醇體積分?jǐn)?shù)以70%為宜。見圖1。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總黃酮提取量的影響

2.1.2 液料比對總黃酮提取量的影響 總黃酮提取量隨著提取劑用量的增加而呈上升趨勢，當(dāng)液料比達到30∶1 mL/g 時，提取量最大，之后繼續(xù)增加溶劑用量，提取量反而呈下降趨勢。這可能是因為在一定范圍內(nèi)，溶劑用量增加，溶質(zhì)的分散程度好，接觸面積大［17］，有利于黃酮類成分的溶出。當(dāng)溶劑用量進一步增加時，黃酮類成分溶出趨于飽和，反而促使其他雜質(zhì)的溶出，使得提取量下降。故液料比以30∶1 mL/g為宜。見圖2。

圖2 液料比對總黃酮提取量的影響

2.1.3 超聲溫度對總黃酮提取量的影響 隨著提取溫度升高，總黃酮提取量呈上升趨勢，當(dāng)提取溫度達到55℃時，提取量最大，之后升高溫度反而使得提取量下降。這可能是因為隨著溫度升高，加速了黃酮類成分的滲透，增加溶解速度和擴散作用［17］，促使溶出。但溫度過高，會導(dǎo)致部分受熱不穩(wěn)定的黃酮物質(zhì)氧化和降解［18］，降低提取量。故超聲提取溫度不宜超過55℃。見圖3。

圖3 超聲溫度對總黃酮提取量影響

2.1.4 超聲時間對總黃酮提取量的影響 隨著超聲提取時間的延長，總黃酮提取量變化不大，但當(dāng)超聲提取時間為80 min時，提取量最大，隨后提取量呈緩慢下降趨勢。這可能是由于當(dāng)超聲時間達到80 min，黃酮類成分已基本完全溶出，繼續(xù)延長時間，有可能使黃酮類成分發(fā)生降解或也伴隨著其他雜質(zhì)的溶出［15］，導(dǎo)致提取量下降。故超聲提取時間以80 min為宜。見圖4。

圖4 超聲時間對總黃酮提取量影響

2.1.5 超聲功率對總黃酮提取量的影響 當(dāng)超聲功率在125～225 W 范圍內(nèi)，隨著超聲功率的增大，總黃酮提取量增加很緩慢，變化不大，而當(dāng)功率從225 W增加至250 W時，提取量上升較快，且在250 W 時達到最大值。這可能是因為隨著超聲功率增大，超聲波增加了物料細(xì)胞的破碎程度與滲透性［17］，促使黃酮類成分的溶出。故超聲功率以250 W為宜。見圖5。

圖5 超聲功率對總黃酮提取量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 試驗設(shè)計及結(jié)果 響應(yīng)面試驗方案及結(jié)果見表2。

2.2.2 回歸方程方差分析 對表2數(shù)據(jù)進行回歸分析，建立提取工藝參數(shù)回歸模型，得回歸方程為：Y=36.45+1.31A+1.37B+0.54C+0.56AB-1.85AC-1.32BC-2.48A2-4.15B2-2.88C2。

方差分析結(jié)果如表3所示。回歸模型的F值為71.41，P＜0.000 1（極顯著），失擬項P=0.092 8＞0.05（不顯著），決定系數(shù)R2=0.989 2，校正系數(shù)RAdj2=0.975 4，表明模型擬合試驗結(jié)果良好，試驗值與預(yù)測值相關(guān)性高，有近98%的真實值可由該模型預(yù)測，有97%的試驗結(jié)果受試驗因素的影響。因此所建模型可靠，可用于分析和預(yù)測總黃酮提取的結(jié)果。通過比較F值的大小，判斷各因素對總黃酮提取量影響的主次順序為乙醇體積分?jǐn)?shù)＞液料比＞超聲溫度；由P值及顯著性結(jié)果可知，對總黃酮提取量的影響達到極顯著的因素有一次項A、B、C及二次項A2、B2、C2，交互項AC、BC對總黃酮提取量的影響達到顯著。見表2—3。

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 回歸方程方差分析

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 由所得的回歸模型作出相應(yīng)的響應(yīng)曲面圖，可進一步直觀反映各試驗因素對響應(yīng)值影響的兩兩交互作用及相對顯著性。響應(yīng)面坡度越陡，表明因素對響應(yīng)值的影響越大；反之則其影響越小［15］。在交互項對提取量的影響中，液料比與超聲溫度和超聲時間與超聲功率之間交互作用顯著，其他因素之間交互作用不顯著，這與方差分析的結(jié)果一致。見圖6。

圖6 各因素交互作用對總黃酮提取量的響應(yīng)曲面

2.3 最佳提取工藝及驗證應(yīng)用Design Expert 10.0 軟件進行工藝參數(shù)的優(yōu)化分析，得到預(yù)測的冰糖草總黃酮提取的最佳工藝參數(shù)為乙醇體積分?jǐn)?shù)71.93%，液料比31.52∶1 mL/g，超聲溫度54.76℃，提取量可達到36.77 mg/g。為驗證模型有效性，考慮到實際操作將冰糖草總黃酮的最佳提取工藝參數(shù)調(diào)整為乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比32∶1 mL/g、提取溫度55℃。在此條件下平行提取5 次，所得到提取量為36.82 mg/g，與預(yù)測值接近，表明該模型可靠，優(yōu)化所得工藝可行。

2.4 體外抗氧化活性結(jié)果在測定的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，冰糖草總黃酮具有抗氧化活性，且隨著質(zhì)量濃度的增加而呈現(xiàn)增強趨勢，呈現(xiàn)明顯的量效關(guān)系。由圖7（a）可知，在2.12～10.60μg/mL的相同濃度內(nèi)，冰糖草總黃酮和Vc對DPPH自由基的清除率均隨著濃度的升高而增強，分別為總黃酮26.69%～80.15%和Vc 21.58%～70.24%；由GraphPad Prism 8.0.2 處理得IC50為總黃酮4.23 ug/mL、Vc 5.54 ug/mL。整體上總黃酮的清除能力高于Vc，表明冰糖草總黃酮具有較強的清除能力。由圖7（b）可知，在1.43～7.15 ug/mL 的相同濃度內(nèi)，冰糖草總黃酮與Vc 的吸光值都隨質(zhì)量濃度的增加而增大，分別為總黃酮0.363～0.885和Vc 0.218～0.821，還原能力也明顯增強，而整體上總黃酮的還原能力略低于Vc，但仍說明冰糖草總黃酮具有一定的還原能力。見圖7。

圖7 冰糖草總黃酮抗氧化活性

3 小結(jié)

以冰糖草為原料，乙醇溶液為溶劑，在單因素試驗的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對超聲輔助提取冰糖草總黃酮的工藝進行優(yōu)化，確定最佳工藝條件為：采用響應(yīng)面法考察冰糖草總黃酮提取量的影響因素，優(yōu)化得到冰糖草總黃酮的最佳提取工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)72%、料液比32∶1 mL/g、提取溫度55℃。得到冰糖總黃酮含量為36.82 mg/g，與模型預(yù)測值36.77 mg/g 較接近，表明建立的模型可靠，該提取工藝穩(wěn)定合理，是提取冰糖草總黃酮的可行方法?？寡趸钚詼y定結(jié)果顯示，冰糖草總黃酮對DPPH 自由基有較好的清除能力及還原能力，表明冰糖草總黃酮具有較好的抗氧化活性，可作為天然抗氧化劑資源。該研究為冰糖草的進一步開發(fā)及天然抗氧化劑的應(yīng)用提供了理論依據(jù)。同時冰糖草總黃酮的體內(nèi)抗氧化活性及其具體化學(xué)成分的分離純化有待下一步研究。