腸吉泰對腸易激綜合征內臟高敏感大鼠PAR2、PKCε、TRPV1 蛋白表達的影響*

耿 琦，叢 軍

上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院，上海 200021

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種功能性腸病，臨床以反復發(fā)作的腹痛，伴排便頻次或大便性狀改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)［1］。據一項來自Rome 委員會的系統(tǒng)綜述（包含83 項研究，涉及41 個國家）顯示，全球IBS 的總體患病率為8.8%，亞洲患病率為9.6%，占消化科門診的25%～50%，每年發(fā)生的直接醫(yī)療費用為13.5 億美元，間接花費為2.05 千萬美元［2-3］。腹痛是IBS 患者最為常見的不適主訴，內臟感覺高敏則是IBS 的一項重要病理生理學征候，其發(fā)生機理目前尚不十分明確［4］。而目前治療內臟疼痛的藥物有限，針對軀體疼痛治療的藥物副作用大，因此對內臟痛敏神經生理機制的研究，將有助于尋找新的治療靶點。

腸吉泰是全國名中醫(yī)蔡淦教授治療IBS 的經驗方，具有疏肝健脾、緩急止瀉的功效。前期RCT臨床研究結果表明，腸吉泰對鎮(zhèn)痛止瀉有效，對改善患者糞便性狀、減少每天排便次數、減輕急迫癥狀、減輕腹脹程度均有較為顯著的治療作用［5］。我們經過更進一步的實驗研究發(fā)現(xiàn)［6-7］，腸吉泰方可以減少IBS 內臟高敏感模型大鼠結腸黏膜內肥大細胞數目，從而有效控制肥大細胞受P 物質刺激后的脫顆粒狀態(tài)；使得IBS 模型大鼠結腸黏膜TRPV1 mRNA 的表達降低，改善內臟痛覺敏感。近年來國內外研究表明，PAR2、PKCε是TRPV1敏化介導的內臟高敏感性的關鍵之一，為了深入研究內臟高敏感IBS 模型大鼠鎮(zhèn)痛作用機制，本研究擬從PAR2、PKCε 蛋白的變化角度，觀察腸吉泰對內臟高敏感IBS大鼠鎮(zhèn)痛作用的療效。

1 材料與方法

1.1 實驗動物雄性新生SD 大鼠，SPF 級，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，實驗動物許可證號：SCXK（2017-0005）。每籠飼養(yǎng)10 只新生大鼠和1只哺乳期母鼠。大鼠出生后第35天與母鼠分離并分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

1.2 藥物及儀器腸吉泰（藥物組成：炒白術、白芍、陳皮、防風、烏梅、甘草等），由曙光醫(yī)院中藥制劑中心采用水提法制成濃度為0.423 g/mL 的溶液。TRPV1 阻 斷 劑capsazepine（美 國abcam，批號：ab120025）。PAR2 抗體（1∶1000，Abcam，批號：ab180953），p-TRPV1 抗體（1∶1000，Abnova，批號：PAB8499），TRPV1 抗 體（1∶1000，NOVUS，批 號：NB100-1617），PKCε 抗 體（CST，批 號：2683，1∶1000）。酶標儀（MK3，THERMO 公司）；thiss-24 型組織碾磨儀（上海凈信）；MIKRO220R 型低溫高速離心機（Hettich 公司）；DNP9082 型恒溫孵育箱（精宏公司）；MDF-382 型-80℃冰箱（Panasonic 公司）；1658033 型電泳儀（美國伯樂）；IMS-25 型制冰機（常熟雪科）；ChemiQ4600 型熒光化學發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔儀器公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 分組及造模 新生大鼠40 只，按照隨機數字表法隨機分為空白組、模型對照組、陽性對照組和腸吉泰組，每組10 只。參照Alchaer 直腸醋酸刺激法制造IBS 模型［8］：乳鼠在出生第8 天即采用直腸內注入醋酸的方法進行刺激，使用冰醋酸配置0.5%的醋酸溶液，以連續(xù)硬膜外導管連接注射器經石蠟油潤滑插入大鼠肛門直腸2 cm，緩慢注入0.5%醋酸溶液1 mL，保留20 s。除空白組外，其余3組大鼠連續(xù)造模14天。

1.3.2 給藥方法 造模期間陽性對照組大鼠給予腹腔注射Capsazepine（2 mg/kg，醋酸刺激前30 min），其余各組除空白組外均給予相同體積的溶劑腹腔注射。從第8 周開始，腸吉泰組按0.423 g/（mL·d）的劑量給予腸吉泰中藥灌胃，其他組每日予以等量去離子水灌胃，持續(xù)灌胃4周。

1.4 觀察指標

1.4.1 檢測大鼠腸道敏感性 采用結直腸氣囊擴張法行腸道敏感性評估。用異氟烷氣麻后，將氣囊用甘油潤滑后經肛門插入約5 cm，用膠布把導管與鼠尾固定，置透明器具內，大鼠不能轉身，但不影響抬腹等動作。待大鼠蘇醒適應10 min 后，進行腸道擴張檢測，壓力分別為20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa），每次持續(xù)20 s，通過觀察大鼠腹壁反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）情況評估各組大鼠的腸道敏感性，并記錄評分。對每一壓力值都重復進行3次擴張，每次擴張間隔4 min，取3次測量所得壓力值的均數作為檢測值。

1.4.2 檢測大鼠結腸黏膜組織PAR2、PKCεTRPV1、p-TRPV1表達值 取結腸黏膜組織加入含蛋白酶等抑制劑的裂解液經組織碾磨儀碾磨后提取總蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，蛋白變性，經凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白，濕轉后，用TBST 溶液清洗后封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗室溫下孵育1 h，電化學發(fā)光顯色后置于凝膠成像儀中分析蛋白表達情況，采用Image 軟件評估各個蛋白相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0軟件進行數據統(tǒng)計分析，計量資料采用xˉ±s表示，組間變量比較采用單因素方差分析，經正態(tài)分布檢驗，如果方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhane’s T2法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠內臟敏感性當氣囊壓力為40、60 mm Hg時，模型對照組大鼠AWR 評分較空白組明顯升高（P＜0.01），提示內臟敏感性升高；腸吉泰組和陽性對照組AWR 評分與模型對照組比較均明顯降低（P＜0.05）。腸吉泰組AWR 評分與陽性對照組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠AWR評分比較（±s） 分

表1 各組大鼠AWR評分比較（±s） 分

注：空白組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型對照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別空白組模型對照組陽性對照組腸吉泰組鼠數10 10 10 10氣囊壓20 mm Hg 0.500±0.527 0.800±0.789 0.600±0.699 0.800±0.789 40 mm Hg 1.700±0.675 2.800±0.632**2.000±0.816△1.800±0.632△△60 mm Hg 2.700±0.675 3.800±0.422**3.000±0.816△△3.100±0.568△80 mm Hg 3.500±0.527 3.900±0.316 3.700±0.483 3.900±0.316

2.2 大鼠結腸黏膜組織PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達與空白組比較，模型對照組PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達顯著升高（P＜0.05）。與模型對照組比較，陽性對照組及腸吉泰組PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達均顯著降低（P＜0.05）。見圖1—2。

圖2 各組大鼠PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1蛋白表達

3 討論

IBS 內臟高敏感屬祖國醫(yī)學“痛瀉”范疇。本病病機為脾虛肝乘，肝脾不和，運化失常所致?！兜は姆ā分礊a藥方乃治療“痛瀉”的經典方劑，由陳皮、白術、白芍、防風組成。上海中醫(yī)藥大學附屬曙光醫(yī)院全國名中醫(yī)蔡淦教授根據“痛責之肝；肝責之實”的理論，在痛瀉藥方的基礎上加入甘草、烏梅兩味藥，即構成“腸吉泰”組方。方中甘草配伍芍藥即《傷寒論》芍藥甘草湯，具有調和肝脾、緩急止痛之功效；而烏梅味酸，入肝脾二經，與甘草合用，可酸甘化陰，亦可益肝陰。全方共奏疏肝健脾，緩急止瀉之效，治療IBS療效滿意［5］。

前期動物實驗研究［6-7］證實，腸吉泰方可以減少IBS 內臟高敏感模型大鼠結腸黏膜內肥大細胞數目，從而有效控制肥大細胞受P 物質刺激后脫顆粒狀態(tài)；使得IBS模型大鼠結腸黏膜TRPV1 mRNA的表達降低，改善內臟痛覺敏感。

新近研究發(fā)現(xiàn)，PAR2、PKCε 在TRPV1 敏化介導的內臟高敏感性導致IBS 的過程中扮演著重要的角色。PAR2 廣泛表達于胃腸組織的上皮細胞、平滑肌細胞及相關的神經、免疫系統(tǒng)的細胞，通過感知興奮感覺神經元，激發(fā)神經源性疼痛［8-11］。PKCε是蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）家族中的一種亞型，其可通過磷酸化TRPV1 降低離子通道開放閾值而在痛覺敏感中發(fā)揮重要的作用［12］。IBS 患者腸道存在肥大細胞（mast cell，MC）增多及PAR2的過度表達［13］。IBS活檢組織樣本的分析結果顯示，胃腸道MC 數量平均增加1.2～2.5 倍，提示IBS 患者黏膜存在MC 增生，通過透射電子顯微鏡上的過敏性脫顆粒的超微結構特征顯示，MCs在IBS 中的盲腸和直腸中具有更高的活化率［14］。當MC 被活化并脫顆粒后，釋放大量胰蛋白酶、類胰蛋白酶等，可激活自身PAR2 進行傷害信號放大，同時類胰蛋白酶剪切并結合PAR2，激活下游磷酸酯酶Cβ（phosopholipase Cβ，PLC），將膜上的脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol biphosphate，PIP2）分解為二酰甘油（diacylgycerol，DAG）和1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），IP3 動員細胞內鈣庫釋放Ca2+到細胞質中與鈣調蛋白結合，而DAG 在Ca2+的協(xié)同下激活PKCε，PKCε 活化可致敏TRPV1 受體，使其發(fā)生磷酸化，Ca2+內流增加，導致胞膜去極化，引起神經元的興奮，釋放傷害性神經遞質SP 與降鈣素基因相關肽（calcitoningene-related peptide，CGRP），引起內臟疼痛感知異常，最終導致內臟高敏感性的發(fā)生［15-18］。因此，抑制PAR2、PKCε 可下調TRPV1 的表達，從而減少傷害性神經遞質的釋放，降低內臟敏感。

本研究結果表明，腸吉泰對模型大鼠結腸黏膜組織中PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表達有顯著下調作用，提示腸吉泰可能是通過下調PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表達，抑制其活化，改善IBS的內臟高敏感狀態(tài)，從而取得鎮(zhèn)痛的療效。