HS-SPME 結(jié)合GC×GC-TOF-MS 分析茶曲清香型白酒中的揮發(fā)性香氣組分

關(guān)玉權(quán)，薛錫佳，陳興杰，杜先鋒，楊金玉，李 增，高志遠，程 偉

（1.安徽金種子酒業(yè)股份有限公司，安徽阜陽 236023；2.安徽農(nóng)業(yè)大學茶與食品科技學院，安徽合肥 230036）

中國白酒以高粱等谷物為原料，采用酒曲（大曲、小曲、麩曲）為糖化發(fā)酵劑，經(jīng)復雜的酶化學反應、生化反應、有機化學反應及微生物代謝活動等發(fā)酵過程釀制而成，其中，酒曲是微生物、粗酶和風味物質(zhì)的重要載體。中國白酒的制曲、釀酒、風味及微生物等方面還有待于深入研究。大曲清香型白酒通常以低溫大曲作為糖化發(fā)酵劑，采用“兩遍清”的釀造工藝，地缸作為發(fā)酵容器，突出乙酸乙酯和己酸乙酯為主體的花果樣香氣。茶作為重要的傳統(tǒng)飲品，含有茶多酚、咖啡堿和多糖類等對人體有益的組分。茶酒是指以茶葉為主要原料，采用浸泡或發(fā)酵的工藝制備而成的飲用酒的統(tǒng)稱。夏秋茶是相對于春茶的一大類茶，不適宜制作綠茶。夏秋茶具有典型的茶香特點，嘗試將夏秋茶與傳統(tǒng)大曲結(jié)合制成含茶大曲，然后將夏秋茶大曲應用在釀造固態(tài)白酒過程中，以期得到具有“獨特茶香、保留傳統(tǒng)酒香、口感醇和、酒體清澈透明”的固態(tài)發(fā)酵型茶酒。

全二維氣相色譜聯(lián)合飛行時間質(zhì)譜(two-dimensional gas chromatography-time-of-flight mass spectrometry，GC×GC-TOF-MS)技術(shù)相較于傳統(tǒng)的一維氣相色譜（1D-GC），具有分辨率高、靈敏度高、峰容量大等顯著特點，是進行復雜樣品中揮發(fā)性組分分離鑒定的重要工具。頂空固相微萃取（HS-SPME）作為復雜樣品中揮發(fā)性組分分析重要的前處理方法之一，具有無需溶劑且操作簡單快速等特點，已廣泛應用于食品中各種微量成分的富集。當前，GC×GC-TOF-MS 技術(shù)已廣泛應用到白酒香氣組分的分離鑒定等方面的研究,然而，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵型茶酒中揮發(fā)性香氣組分的GC×GCTOF-MS 分析還鮮有報道。本實驗采用HSSPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)對固態(tài)發(fā)酵型茶酒中的揮發(fā)性香氣組分進行檢測并對比分析，有助于增進對茶酒香氣特點及特征組分的認識，為固態(tài)發(fā)酵型茶酒的開發(fā)與組分特征評價提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

酒樣：固態(tài)發(fā)酵型茶酒（原酒），優(yōu)級酒（酒精度63.0%vol，以下簡稱SF-CJ），安徽金種子酒業(yè)股份有限公司提供；采用夏秋茶為輔料培養(yǎng)的中低溫大曲作為糖化發(fā)酵劑，再采用大曲清香型白酒釀造工藝釀造清香型白酒。

試劑：氯化鈉、無水硫酸鈉等（化學純），中國醫(yī)藥集團化學試劑有限公司。

儀器設備：全二維氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜儀(GC×GC-TOF-MS，Pegasus4D Leco Corporation，USA)系統(tǒng)：7890A 氣相色譜儀（美國Agilent 公司），Pegasus 4D 飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國LECO 公司），其中，GC×GC 柱系統(tǒng)的第一維柱采用DBWAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，第二維柱采用DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)；57330-U 手動SPME進樣器(美國Supelco 公司)；2 cm 50/ 30 μm DVB/CAR/PDMS 固相微萃取頭(美國Supelco 公司)；Mili-Q Advantage超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗酒樣的前處理

用去離子水將實驗酒樣SF-CJ 的酒精度稀釋到10.0%vol，置于4 ℃普通冰箱，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 頂空固相微萃取方法(HS-SPME)

參照GAO W J 等人的方法，調(diào)整了萃取時間：取5 mL 酒樣加入到20 mL 的頂空瓶中，加蓋密封；采用DVB/CAR/PDMS纖維頭，對頂空瓶中的樣品進行SPME 萃??；在50 ℃條件下恒溫15 min，再萃取30 min 后，將萃取頭立即插入250 ℃的GC 進樣口解吸附5 min，再進行GC×GC-TOF-MS 分析，相同條件下進樣3次。

1.2.3 儀器方法(GC×GC-TOF-MS)

參照陳雙等的方法，第一維柱進樣溫度250 ℃，初始溫度40 ℃保留5 min，以5 ℃/min 升至220 ℃，以20 ℃/min升至250 ℃，保留2.5 min，氦氣(99.999 9%)1.0 mL/min，無分流；第二維柱的柱溫高于第一維柱5 ℃，調(diào)制解調(diào)器溫度始終保持高于第一維柱5 ℃；全二維分析調(diào)制周期4.0 s，接口溫度270 ℃，離子源溫度250 ℃，電子轟擊源70 eV，檢測器1680 v，采集率50 張/s，質(zhì)譜掃描范圍m/z 29～500，采用NIST譜庫比對。

質(zhì)譜條件：EI 離子源，電壓70 eV，離子源溫度230 ℃，傳輸線溫度280 ℃，檢測器電壓1365 V，采集質(zhì)量數(shù)范圍35～500 amu、頻率100 spectrum/s，由LECO公司Pegasus4D工作站控制數(shù)據(jù)采集。

1.2.4 GC×GC-TOF-MS的數(shù)據(jù)處理

采集的TOF-MS 數(shù)據(jù)由LECO 公司Chroma TOF 工作站自動識別信噪比大于50 的色譜峰，并與NIST 14和Wiley 9質(zhì)譜庫比對，經(jīng)人工解譜與同系物二維色譜出峰規(guī)律比對后去除烷烴類等化合物；選擇相似度與反相似度均大于700，且可能性大于4000 的化合物，在Chroma TOF 軟件中建立保留指數(shù)計算方法；確定化合物一維色譜柱保留指數(shù)，再比對文獻報道的保留指數(shù)，最后選擇數(shù)值差異在不大于50的化合物作為鑒定結(jié)果（參照高夢昕等的方法，作為數(shù)據(jù)處理依據(jù)）。

2 結(jié)果與分析

2.1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法對白酒揮發(fā)性香氣組分的分離特性

全二維色譜分離極大地拓展了傳統(tǒng)一維色譜的分離能力，還具有靈敏度高、分辨率高等優(yōu)點。飛行時間質(zhì)譜的采集頻率較高，可實現(xiàn)與全二維氣相色譜的聯(lián)用，極大地提高檢測靈敏度。當前，GC×GC-TOF-MS 技術(shù)已應用于白酒檢測領域，洪澤淳等基于GC×GC-TOF-MS 技術(shù)研究了醬香型白酒風味成分；周茜等總結(jié)了GC×GC-TOFMS 技術(shù)在酒類分析中的應用；季克良等采用GC×GC-TOF-MS 技術(shù)對醬香型白酒的微量成分進行了分析。然而，關(guān)于固態(tài)發(fā)酵型茶酒中揮發(fā)性香氣組分的GC×GC-TOF-MS分析還鮮有報道。

本實驗采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技術(shù)對酒樣SF-CJ 中的揮發(fā)性香氣組分進行檢測并對比分析，如圖1 所示的全二維分析譜圖表明，酒樣SF-CJ 中的揮發(fā)性組分較為復雜，一維色譜圖中有部分化合物出現(xiàn)共流出現(xiàn)象，通過二維色譜后獲得了一定的分離效果，但仍存在少量的共流出現(xiàn)象，還需要進一步分析原因。

圖1 酒樣SF-CJ經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析的1D總離子流色譜圖與2D總離子流色譜圖(圖中黑點表示一個色譜峰)

2.2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法對酒樣SF-CJ揮發(fā)性香氣組分的鑒定

當前，市場上流通的茶酒大部分是配制型工藝，其香氣和口感與固態(tài)發(fā)酵白酒相比均有不同程度的欠缺，將茶葉作為原輔料釀造固態(tài)發(fā)酵型茶酒的研究并不多。茶與釀酒工藝的結(jié)合可能創(chuàng)新白酒品類或釀造過程產(chǎn)生新的香氣物質(zhì)，陳琳琳等在蒸餾茶酒中檢測到有新的香氣物質(zhì)產(chǎn)生，該物質(zhì)是否來源于茶葉中的醇類物質(zhì)與白酒中的酸類物質(zhì)發(fā)生的反應還有待深入研究；邱新平等也在發(fā)酵型茶酒中檢測到了新的香氣物質(zhì)。金種子酒業(yè)采用夏秋茶為輔料培養(yǎng)中低溫大曲，再根據(jù)大曲清香型白酒的釀造工藝釀造茶曲清香型白酒，提供了茶酒品類開發(fā)的新思路。

本實驗采用固態(tài)發(fā)酵型茶曲清香型白酒（原酒）作為實驗酒樣（酒樣SF-CJ），進行揮發(fā)性香氣組分分析。如表1 所示，在酒樣SF-CJ 中共確認了可信度較高的揮發(fā)性組分261 種，主要包括酯類62種，醇類49 種，酸類36 種，醛、酮、縮醛類34 種，含氮化合物11 種，呋喃類21 種，含硫化合物11 種，芳香族22種，其他類16種。

表1 酒樣SF-CJ經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鑒定出的化合物統(tǒng)計(種)

綜上表明，酒樣SF-CJ 中主要揮發(fā)性香氣組分包括酯類、醇類、酸類、醛酮類等化合物，其中，多數(shù)酯類物質(zhì)具有花果香氣，醇類和酸類物質(zhì)賦予酒體醇甜的感官，各類揮發(fā)性香氣組分的復合形成了酒樣SF-CJ 的獨特感官及風格特征。某些呋喃、芳香族及部分酯類化合物通常具有特殊香氣及生理功能，雖然其在酒體中的種類和含量較少，也對酒體的復合香氣具有重要作用。因此，本文著重對比分析了鑒定出的呋喃、芳香族及部分酯類化合物。

2.2.1 呋喃類化合物

呋喃類化合物是許多天然食品香氣特征的重要成分，具有特殊香氣和生理功能。呋喃類化合物也是白酒中重要的呈香物質(zhì)，研究表明，呋喃類化合物是醬香型白酒的重要呈香物質(zhì)和特征化合物。由表2 可知，酒樣SF-CJ 中共鑒定出21 種呋喃類化合物，其中，乙酸糠酯具有果香、藥香、辛香；苯并呋喃具有抗菌，抗腫瘤和抗炎等生物作用；糠醛具有特殊香氣，其含量對酒體的香氣有重要影響，在多種香型的白酒中均檢測到糠醛。綜上，具有特殊香氣或生理功能的乙酸糠酯、苯并呋喃等呋喃類化合物均可以作為SF-CJ中重要的香氣組分。

表2 酒樣SF-CJ經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鑒定出的呋喃類化合物

2.2.2 芳香族化合物

芳香族化合物是一類碳氫化合物，是一類從植物膠中獲得的具有芳香氣味的物質(zhì)。由表3 可知，酒樣SF-CJ 中共鑒定出21 種芳香族化合物；其中，藍烴具有芳香性，具有抗菌、抗真菌與抗發(fā)炎、鎮(zhèn)痛的效果；苯乙酸乙酯作為合成香料，具有顯著而甜蜜的玫瑰花香，較普遍用于煙、皂、日用化妝品的香精中；苯乙醇具有清甜的玫瑰樣花香，這與酒樣SF-CJ 具有“特殊的花香、蜜香”等香氣感官相吻合。綜上表明，具有特殊香氣或生理功能的藍烴、苯乙酸乙酯、苯乙醇等芳香族化合物均可作為SFCJ中重要的香氣組分。

表3 酒樣SF-CJ經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鑒定出的芳香族化合物

夏秋茶中的多酚、花青素、咖啡堿類等物質(zhì)含量較高，這類物質(zhì)在制曲過程中有可能被微生物利用轉(zhuǎn)化或者影響制曲微生物的類群與代謝，含有這類物質(zhì)或新轉(zhuǎn)化和生成物質(zhì)的茶曲再通過白酒固態(tài)發(fā)酵得到固態(tài)發(fā)酵型茶酒，涉及的重要微生物及關(guān)鍵代謝產(chǎn)物等還有待于深入研究。采用夏秋茶培養(yǎng)的茶曲，微生物群落結(jié)構(gòu)及其代謝產(chǎn)物與酶類明顯區(qū)別于傳統(tǒng)大曲，大曲的品質(zhì)與風味組分也有差異。將夏秋茶大曲應用于釀造固態(tài)過程中，得到具有“獨特茶香、保留傳統(tǒng)酒香、口感醇和、酒體清澈透明”的固態(tài)發(fā)酵茶酒，茶葉中的芳香族化合物在制曲、釀酒等過程中的轉(zhuǎn)化對茶酒的香氣形成具有重要影響。

2.2.3 酯類化合物（部分）

酯類化合物是白酒揮發(fā)性成分中最重要的化合物，是白酒中主要的揮發(fā)性成分。酒樣SF-CJ 中除乙酸乙酯（具有溶劑狀香）、乳酸乙酯（具有椰子香）、己酸乙酯（具有甜蘋果香）、辛苯乙酸乙酯（具有玫瑰和蜜香）等含量較高的酯類物質(zhì)外，還含有如表4 所示的19 種特殊酯類物質(zhì)，其中己酸甲酯具有令人愉快的氣味。

表4 酒樣SF-CJ經(jīng)HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析鑒定出的酯類化合物(部分)

固態(tài)發(fā)酵型茶酒釀造過程中，茶葉或茶曲中的大部分營養(yǎng)、香氣及功效成分都直接或間接參與釀酒發(fā)酵并溶于酒體，蒸餾得到的茶酒有可能兼具茶和白酒的特點，具有一定的藥理或保健功效。固態(tài)發(fā)酵型茶酒在口感上與浸泡或調(diào)制型茶酒相比也具有突出的優(yōu)勢，固態(tài)發(fā)酵型茶酒既有茶葉的清香，也有白酒的醇厚，其中，酯類物質(zhì)的產(chǎn)生也可能受到茶葉中特殊組分的影響，進而在白酒發(fā)酵體系中形成有別于傳統(tǒng)發(fā)酵白酒的新型酯類物質(zhì)。綜上表明，除乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯、辛苯乙酸乙酯等含量較高的酯類物質(zhì)外，具有特殊香氣的己酸甲酯等芳香族化合物也可作為SF-CJ 中重要的香氣組分。

3 結(jié)論

目前，白酒香氣特征研究主要側(cè)重于揮發(fā)性組分分析等方面，伴隨著樣品前處理方法的日益豐富與創(chuàng)新發(fā)展，以及新型高端精密檢測分析儀器的廣泛應用，基于風味組學技術(shù)對白酒微量成分構(gòu)成與含量分析的研究也在不斷深入。香氣特征是白酒品質(zhì)的重要組成部分，揮發(fā)性組分是構(gòu)成清香型白酒獨特香氣的重要部分，因此，研究特征香氣組分對調(diào)控茶曲清香型白酒的品質(zhì)具有重要意義。發(fā)酵型茶酒的生產(chǎn)工藝較復雜，從茶酒市場長遠的發(fā)展方向來看，發(fā)酵和配制等工藝相結(jié)合而制備的茶酒有利于更好地提高茶酒的口感和品質(zhì)，對茶酒的香氣組分及特征性組分進行檢測分析對茶酒行業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

本實驗采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法檢測酒樣SF-CJ 中的揮發(fā)性香氣組分，得到的結(jié)論主要有：（1）在酒樣SF-CJ 中共確認了可信度較高的揮發(fā)性組分261 種，主要包括酯類62 種、醇類49種、酸類36 種、醛酮縮醛類34 種、含氮化合物11種、呋喃類21 種、含硫化合物11 種、芳香族21 種和其他類16 種；（2）酒樣SF-CJ 中鑒定出的多種特殊揮發(fā)性香氣組分，如苯并呋喃、乙酸糠酯、藍烴、苯乙酸乙酯、苯乙醇等，均可作為酒樣SF-CJ 中的重要香氣組分。本研究為固態(tài)發(fā)酵型茶酒的開發(fā)與組分特征評價提供依據(jù)，有利于促進茶酒行業(yè)的發(fā)展。